검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

요약

재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.

초록

레트로 바이러스 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 integrase (IN) 단백질은 retroviral 통합의 메커니즘 연구 모델 효소 이다. 다른 레트로 바이러스에서에 비해, PFV에 더 많은 가용성과 실험적인 조작에 순종. 또한, 그것은 임상으로 관련 된 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1)에 억제제, PFV에 촉매 메커니즘은 그의 HIV-1 인치에 catalyzes 바이러스 무료 DNA (cDNA) 대상의 공유 결합 비슷한 제안에 민감한 과정에서 DNA 가닥 전송을 이라고합니다. 이 물가 이동 반응 대상 DNA에 닉스를 소개합니다. 통합 반응 제품의 분석 nucleases 마찬가지로 DNA를 닉의 존재에 의해 혼동 될 수 있습니다. 세균성 nuclease 공동 재조합 PFV에 대장균 (대장균)에 표현 된 정화 표시 되었습니다. 여기 헤 파 린 친화성 크로마토그래피에 의해 오염 nuclease에서 PFV에 격리 하는 방법을 설명 합니다. 분수는 쉽게 supercoiled 플라스 미드와 agarose 젤 전기 이동 법 nuclease 오염에 대 한 상영 됩니다. PFV에 및 오염 nuclease nuclease 무료 준비 재조합 PFV에 통합의 대량 생 화 확 적인 또는 단일 분자 분석에 대 한 적합 한 허용 하는 헤 파 린 sepharose에 대 한 대체 선호도 표시 합니다.

서문

Dna 단백질 상호 작용의 생 화 학적 및 단일 분자 연구 매우 순수한 재조합 단백질을 필요로합니다. 박테리아에서 nucleases 오염 이러한 분석의 결과 모호한 수 있습니다. 오염 nuclease 재조합 단백질 산소 폐품 protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) 및 대장균 (대장균)¹ 에서 절연 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV) integrase (IN)의 준비에서 발견 되었습니다. ^{, 2 , 3}.

Retroviral 통합 분석 실험 활동⁴의 측정으로 긁어 또는 선형 제품 supercoiled DNA의 변환에 의존합니다. 세포 감염 동안에 호스트 chromatin⁵바이러스 성 cDNA의 두 끝에 합류 했다. 반응에 참여 하는 각 끝에는 스트랜드 전송 되 나 이다. 분석 실험 활동 두 DNA 올리고 참여 수 재조합에의 공동된 통합 반응^4,,56,7,8에서 표적 DNA에 종료 바이러스 성 cDNA를 흉내 낸. 또는 재조합에 비 순수 관련 반 사이트 통합 반응^9,10단 하나의 DNA 끝을 참여할 수 있습니다. Supercoiled 플라스 미드 DNA의 대상인 통합, 공동된 통합 제품은 오는지 DNA 고 반 사이트 통합 제품은 편안한 서클. 이러한 반응 제품 agarose 젤 전기 이동 법¹동안 상대 그들의 이동성에 의해 식별 됩니다. 재조합에 오염 nuclease 있으면 가짜 편안한 원이나 실험 결과 혼란 가능성이 선형화 플라스 미드 있을 것입니다. 바이러스 성 DNA 올리고 nuclease 제품 반대로 통합 제품을 결정적으로 식별 하 붙일 표시 될 수 있습니다. 그러나,에서 크게 하시 더군요 supercoiled DNA 목표; 편안한 원 또는 오염 nuclease에 의해 선형 DNA supercoiled 플라스 미드의 손실 결과 및 해석 데이터¹¹의 왜곡 수 있습니다. 따라서 세균 nucleases retroviral 준비에서에서 제거 하는 것이 필수적 이다.

PFV에 세균성 nuclease¹에 비해 헤 파 린 sepharose에 대 한 다른 선호도 하고있다. PFV에 고는 nuclease 덤플링 sepharose에서 선형 그라데이션 차입에 의해 분리 될 수 있습니다. 280 nm 첨단 자외선 (UV) 흡 광도 또는 분석 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)는 nuclease 쉽게 감지 되지 않습니다. 대신,는 nuclease 편안한 원이나 선형 제품 supercoiled 플라스 미드의 전환 채용 nuclease 활동 분석 결과 의해 감지 됩니다. 헤 파 린 sepharose 크로마토그래피 다음 각 분수는 nuclease 활동에 대 한 테스트입니다. PFV에 nuclease 오염 물질 모노-Q 음이온 수 지에 대 한 선호도에 차이가 있다. 모노-S 양이온 수 지에 대 한 선호도에 작은 차이가 있다. 그러나, 세균성 nuclease 모노 S 해상도 PFV에 단백질의 효율적인 분리를 수 없습니다. 궁극적으로, 덤플링 sepharose 친 화력 정화 PFV에 세균성 nuclease의 최고의 분리를 제공 하 고 무제한 부하 볼륨의 이점이 있다.

오염 nuclease 활동에 대 한 테스트 다른 단백질을 적용할 수 있습니다. 관심사의 단백질 대체 선호도 특성 PFV에; 보다 가능성이 해야한다. 바인딩 관심과 nuclease 오염 물질의 단백질의 특성에 차이 실험적으로 결정 되어야 합니다. Nuclease 오염 식별이 방법론 모노-S 양이온 또는 모노-Q 음이온 교환 수 지를 포함 하 여 다른 수 지에 적용할 수 있습니다. 선호도 및 이온 교환 수 지는 크로마토그래피 중 단백질의 볼륨에 제한이 없는 nucleases 오염에서 재조합 단백질을 분리 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 유도 PFV 대장균 에 식에서

1. 대장균 BL21(DE3) pLysS의 20 μ 1 μ PFV에 식 플라스 미드 (10 ng/μ)의 추가 (상업적으로 사용 가능한 셀의 20 μ 약 수는 > 2 x 10⁶ CFU/μ g 플라스 미드) 1.5 mL 튜브에. 부드럽게 손가락 도청 또는 튜브를 터치 믹스. 품 어에 얼음 5 분.
   1. 정확히 30 충격 열 42 ˚C에 s 물 목욕 한 후 바로 2 분 동안 얼음을 반환할.
   2. Catabolite 억제 (SOC) 미디어 실 온 슈퍼 최적의 국물의 80 μ를 추가 합니다. 1 h 225 분당 회전 (rpm) 떨고와 37 ˚C에서 품 어.
   3. 접시는 100 m m x 15 m m Luria 국물 (파운드) agar의 25 mL를 포함 하는 배양 접시에 혼합물의 25 μ (1 L 파운드 agar: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, bacto tryptone 10 g 15 g 천) 및 100 μ g/mL 암 피 실린 (100mg/mL 재고 솔루션).
   4. 두 번째 동일한 접시에 변환 된 셀의 나머지 75 μ 접시 37 ° c.에 하룻밤 내려 뚜껑 접시를 품 어
2. 검색의 판 변형 대장균. 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 3 mL 접종 (1 L 파운드: bacto tryptone, 10 g의 NaCl, 효 모 5 g의 10 g 추출) 14 mL 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 문화 관에서 100 μ g/mL 암 피 실린 보충. ~ 8 h 225 rpm 동요와 37 ˚C에서 품 어.
   1. 50 mL 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린과 34 μ g/mL 페니 (34 mg/mL 재고 솔루션) 250 mL 삼각 플라스 크에에서 보충에 문화의 3 mL를 추가 합니다. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.
   2. 1 L 파운드, 100 μ g/mL 암 피 실린, 그리고 4 L 삼각 플라스 크에 34 μ g/mL 페니를 이동 문화의 53 mL. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 품 어.
   3. 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD₆₀₀) 정기적으로 문화. 처음에, 모든 h 문화 OD₆₀₀ 확인 하십시오. 문화는 원하는 OD₆₀₀에 도달, 하지 자라 다를 15 분 마다 확인 합니다. 0.9와 1.0 사이 세₆₀₀ 문화를 성장. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송 및 문화의 온도 줄이기 위해 소용돌이.
3. SDS 페이지 분석을 변성 시키기에 의해 나중에 분석 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 전송.
   1. 실 온에서 14000 x g에서 microfuge에 1 분 동안 원심 분리에 의해 1.5 mL 튜브에 세포를 작은. 폐기는 상쾌한. Pipetting으로 150 μ 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 펠 릿을 resuspend. PBS 또는 CaCl₂ , MgCl₂없이 있을 수 있습니다.
   2. SDS 페이지 샘플 버퍼 x 2의 150 μ 추가 (150 m m Tris HCl, pH 6.8, 1.2 %SDS, 30% 글리세롤, 15% β-mercaptoethanol (βME), 블루 0.0018 %bromophenol) 피펫으로 또는 소용돌이 의해 철저 하 게 혼합. -20 ° c.에 3 분 저장소에 대 한 종 기
4. 세균성 문화에 추가: 0.25 m m 이소프로필-베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M 재고 솔루션) 및 50 μ M ZnCl₂ (50 m m 재고 솔루션)의 최종 농도. IPTG T7 발기인에서 PFV 유전자의 표정을 유도 및 ZnCl₂ PFV 인치 품 즉시 4 헤 대 한 225 rpm에서 떨고와 25 ° C에서 문화에에서 아미노 터미널 아연 손가락 영역의 올바른 접는 보충 교재로 추가 됩니다. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송. SDS 페이지 분석 1.3에서 위와 같이 동일한 프로토콜을 다음 위한 문화의 1 mL를 저장 합니다.
5. 적절 한 크기의 원심 병 세균성 문화를 전송 합니다. 예를 들어 1 L 문화 4 살 균 일회용 250 mL 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 병을 양도할 수 있습니다. 4 ˚C에서 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 탁상 원심 분리기에 병을 회전 합니다. 붓는 의해 supernatants를 삭제 합니다.
   1. 25 mL (6.25 mL 병 당) 차가운 PBS (또는 CaCl₂ 및 MgCl₂)의 총 볼륨 1 L 세균성 문화에서 알 약의 모든 pipetting으로 resuspend. 결합 하 고 한 50 mL 원뿔 튜브에 세균성 정지를 전송. 4 ° c.에 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 원심 분리기에서 회전 붓는 또는 pipetting는 상쾌한을 삭제 합니다.
6. Pipetting으로 세균 펠 릿 10 mL 물의 resuspension 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 및 500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 프로 테아 제 억제 물)에서 resuspend. 스냅 잠수함 50 mL 튜브에 충분 한 액체 질소와 함께 Dewar 플라스 크에 튜브를 삽입 하 여 펠 릿을 동결. 조심 스럽게 액체 질소에서 튜브를 제거 하 고-80 ° c.에 저장
   참고: 세균성 펠 릿-80 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다. 우리는 2 년 동안-80 ° C 저장 다음 활성 단백질의 손실 없이 보았다.
7. 분석 사전 유도 후 유도 샘플 8.3 c m, 높이 7.3 c m 0.75 m m 두께 SDS 페이지 젤 1.5 mL 6 %polyacrylamide 레이어 스태킹와 (125 mM Tris HCl, pH 6.8, 6% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED) 3.5 mL 10% 레이어를 해결 polyacrylamide (375 mM Tris HCl, pH 8.8, 10% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED)¹².
   1. 겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 후 10 잘 빗을 삽입 합니다. 젤 생산은 때 페이지 장치를 조립 하 고 충분 한 SDS 페이지 실행 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, 0.1 %SDS)를 추가 합니다.
   2. 각 샘플의 10 μ prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 염료 앞 약 60 분, 젤의 하단에 도달할 때까지 16.5 V/cm에서 실행 합니다.
   3. 젤 접시를 분해 하 고 젤 플라스틱 욕조를 전송. Coomassie 화려한 블루 솔루션 (0.1 %Coomassie 화려한 블루 R-250, 40% 메탄올, 10% 아세트산) 아낌없이 젤 커버 하 고 주위 온도에서 20 분 동안 얼룩 얼룩을 추가 합니다.
   4. 붓는 의해 얼룩 솔루션을 제거 하 고 바꿀 솔루션 (40% 메탄올, 10% 아세트산) destain까지 밴드를 쉽게 볼 수 있습니다. 붓는 의해 destaining 솔루션을 제거 하 고 이온된 수를 바꿉니다. PFV에 후 유도 샘플에서 쉽게 식별 되어야 합니다. Hexahistidine 태그와 PFV에 47374 Da의 분자량.
   5. PFV에 표시 되지 않는 경우 변환 접시 중 하나에서 다른 식민지로 시작 하는 유도 반복 합니다.

2. 니켈 친화성 크로마토그래피

1. 얼음에 대 한 세균 펠 릿 녹여
   참고:이 중요 한 시간 (약 2-3 h) 소요 됩니다. 펠 릿은 셀 슬러리에 동 때 추가 500 μ M PMSF (100 m m 재고 솔루션)를 추가 합니다.
2. 계속 박테리아의 50 mL 튜브 얼음 슬러리. 30 대 30% 진폭에서 박테리아를 sonicate s (1 초, 1에서 s) 0.125 인치 직경 0.5 인치 직경 바이오 경적 sonicator는을 사용 하 여 1 L 문화에서 파생 된 펠 릿 당 테이퍼 microtip, 20 kHz의 주파수 및 400 w.의 최대 전력
3. 차가운 ultracentrifuge 튜브에 셀 샘플을 전송. 폴 리 탄산염 병 어셈블리 (25 m m 직경, 89 m m 높이) 유형 60 Ti 고정된 각도 터와 호환을 사용 합니다. 동일한 중력 힘을 달성 하는 경우 대체 튜브와로 터를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에서 60 분에 대 한 회전 120000 x g 명백한 펠 렛 이어야 한다. 상쾌한 노란 색깔을 할 수 있습니다.
4. 붓는 또는 찬 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting는 상쾌한 전송. 참고 볼륨; 이 볼륨 스냅 동결 전에 사용 되는 물의 resuspension 버퍼의 볼륨 약 해야 합니다. 상쾌한 점성 경우에, 착 색 인쇄기 열을 방해할 수 있는 세균성 DNA에 의해 오염 될 수 있습니다. 이 경우에, 세균성 DNA를 펠 렛을 ultracentrifugation를 반복 합니다.
5. 500 mL를 준비 (50mm pH 7.5, 500 mM NaCl, Tris HCl 500 μ PMSF) 버퍼와 500ml 버퍼 B (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μ PMSF, 200mm 이미).
   참고:이 프로토콜에서 계속 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템, 모든 버퍼 및 샘플 콜드 룸에 4 ° C에서.
   1. 살 균 필터 완충기 A와 B 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B 버퍼 A와 버퍼 B, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 10%와 90% 버퍼 A 버퍼 B. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 5 mL/min 흐름 속도 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.
6. 준비는 110 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 1.5 mL 니켈 충전 지 (최대 바인딩 용량 50 mg/mL, 최대 1 MPa의 압력). 열 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ˚C에 저장 된 수 있습니다.
7. FPLC 악기에 열을 연결 합니다. 0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 90% 버퍼 A와 10% 버퍼 B (이미 20 m m) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (₂₈₀). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.
8. 0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 0.15 mL/min 흐름 속도로 열을 단백질 샘플 (펠 릿 당 ~ 10 mL)를 로드 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
   1. 열을 씻어 20 mL 10%와 90% 버퍼 A와 B. 버퍼 수집 50 mL 튜브에서 세척. 선형 그라데이션 20 mL의 10% ~ 100% 버퍼 B (200 m m 이미 20 m m)와 단백질 elute
   2. 마지막으로, 5 mL 100% 버퍼 B (200 m m 이미) 열 세척. 수집에 그라데이션 하 고 마지막 세척 0.27 mL 분수.
9. 2 x SDS 페이지 샘플 버퍼의 15 μ 15 μ, 세척, 그리고 피크 A₂₈₀ 분수를 통해 흐름의 결합. 3 분에 대 한 샘플을 끓인 다.
   1. 두 개의 10 %SDS 페이지 젤 이전 단계에서 설명한 1.6 제외 하 고 15 잘 빗을 준비 합니다. 10 μ는 젤을 각 샘플의 prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 실행 하 고 얼룩, 1.6 단계에서 설명한 대로 젤 분석.
   2. 육안 검사에 따라 거의 순수한 PFV에 포함 하도록 표시 되는 분수를 결합 한다. Pipetting, 일반적으로 8-10 mL를 볼륨을 측정 한다.
   3. 분 광 광도 계를 사용 하 여 결합 된 분수의 A₂₈₀ 을 측정 하 고 PFV에 단백질;의 총 금액을 계산 우리의 전형적인 수확량은 유도 문화 L 당 ~ 10 mg 이다. Hexahistidine 태그 PFV에 소멸 계수는 59360 c m^-1 M^-1.
10. Hexahistidine 태그를 제거 하려면 PFV에 10 m m dithiothreitol (DTT, 1 M 재고 솔루션)와 0.1 m m EDTA, pH 8.0 (0.5 M 재고 솔루션)을 보충 한다. 4 ˚C에서 하룻밤 mg PFV 인치 품 당 인간의 이노 (HRV) 3 C protease의 15 μ g를 추가 합니다. 분열 47374 다에서 44394 다 PFV에 분자량을 감소 하 고 10 %SDS 페이지 분석 하 여 확인할 수 있습니다.

3. 헤 파 린 친화성 크로마토그래피

1. 250 mL 준비 버퍼 C (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF)와 250 mL 버퍼 D (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF, M 1 M NaCl).
   참고:이 프로토콜 FPLC 시스템, 버퍼, 그리고 샘플 보관 됩니다 4 ˚C에서 차가운 방에.
   1. 살 균 필터 버퍼 C 그리고 D 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B C 버퍼와 버퍼 D, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 5 mL/min의 유량을 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.
2. 80 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 덤플링 sepharose 수 지 (최대 바인딩 용량 소의 2.0 mg mL 당 antithrombin III 수 지; 최대 1.4 MPa의 압력)의 1 mL를 준비 합니다. 열을 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ° c.에 저장 된 수 있습니다. FPLC 악기에 열을 연결 합니다.
   1. 1 MPa의 압력을 최대 제한 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (₂₈₀). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.
3. 1.5 볼륨 버퍼 c.를 추가 하 여 200mm PFV에 샘플의 NaCl 농도 감소 예를 들어 10 mL PFV 인치를 버퍼 C의 15 mL를 추가 우리의 전체 볼륨은 일반적으로 25 mL.
4. 부하 최대 압력 0.5 mL/min 흐름 속도로 덤플링 sepharose 열에 희석된 PFV에 샘플 1.0 MPa를 제한 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
   1. 워시 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl), 20 mL로 열 워시 50 mL 원뿔 튜브에 수집. (200 m m 1 M NaCl) 30 mL 선형 그라디언트의 20% ~ 100% 버퍼 D 열 elute
   2. 워시 100% 버퍼 디의 5 mL와 열 수집 0.37 mL 분수에 그라데이션 하 고 마지막 세척 합니다.
5. 분석 로드, 통해, 세척, 분수 8 %SDS 페이지 2.9에 설명 된 대로. 다음 hexahistidine 태그의 분열 하는 PFV에 44394 Da의 분자량 있으며 멸종 계수 hexahistidine 태그를 하지 않고 59360 c m^-1 M^-1 에 남아 있다. 4 ˚C에서 모든 분수 nuclease 분석 결과 완료 될 때까지 저장 합니다.

4. nuclease 분석 결과

1. 식별 덤플링 분수 및 50의 거의 순수한 PFV 인치 결합 3 μ를 포함 하도록 표시 되는 헤 파 린 sepharose 분수 3 kb의 ng supercoiled 플라스 미드 DNA에 반응 버퍼 (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO₄, 4 μ M ZnCl₂ m 10 mM DTT) 15 μ의 최종 볼륨. 없는 PFV 인치와 90 분 포함 부정적인 컨트롤에 대 한 37 ˚C에서 품 어
   1. 1 mg/mL 가수분해 K와 반응 (20 mg/mL 재고 솔루션) 및 0.5 %SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 37 ° C에서 품 어 1 h. 샘플 나중에 분석-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
2. 1의 x TAE 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람 (10mg/mL 재고 솔루션)¹³에 볼륨 (w/v) agarose 당 1% 무게의 125 mL 젤을 준비 합니다. Agarose 솔루션을 녹여와 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 용지함에 붓는 다. 5 m m, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다. 얇은 스 웰 스 1.5 m m 두께에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을. 허용 주위 온도에서 응고 하 젤.
   1. 1에서 젤 담가 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람으로 x TAE. Nuclease 분석 결과 반응 염료 (50% 글리세롤, 0.15% 오렌지 G 염료) 로드 x 6의 3.5 μ를 추가 합니다. 전체 볼륨 젤을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 (100) cm 당 10 볼트에서 젤을 실행 합니다.
3. 바로 형광 스캐너 ethidium 평범한 사람을 감지를 설정 agarose 젤 이미지. 선형 DNA 3 kb 크기 true로 실행 해야 합니다, supercoiled DNA 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 편안한 원형 DNA 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다.
   1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 각 차선에 supercoiled, 선형, 그리고 편안한 원형 플라스 미드의 픽셀 볼륨을 계산 합니다. 이러한 세 가지 DNA 형태 "총 DNA"에 대 한 볼륨 값 및 선형 및 편안한 원형의 비율을 계산 하는 데 사용할 픽셀의 합계를 호출 합니다. 예를 들어 편안한 서클의 픽셀 볼륨 나눈 값입니다 그 차선에 있는 총 DNA 픽셀 값, 백분율을 결정 하는 100이이 숫자를 곱합니다. 분수 오염 nuclease 포함 하는 부정적인 컨트롤에 비해 선형이 고 편안한 서클의 더 높은 백분율을 표시 합니다.
4. 헤 파 린 sepharose 분수 오염 nuclease 활동을 표시 하지 않는 결합. 6-8 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 투 석 튜브 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μ M ZnCl₂, 10 m m DTT, 20% 글리세롤의 1 리터에 하룻밤 4 ° C에서 10 mm dialyze.
5. 투 석 배관에서 nuclease 무료 PFV에 샘플을 복구 합니다. A₂₈₀ 을 측정 하 고 최종 단백질 농도 계산. 약 수 및 액체 질소에서 동결. -80 ° c.에 aliquots 저장

결과

재조합 PFV에 종종 세균 nuclease¹오염 됩니다. 생 화 확 적인 통합 분석 편안한 원 및 선형 제품 supercoiled 플라스 미드 DNA의 변환의 정량에 따라 달라 집니다. 오염 nuclease의 존재는이 분석 실험의 스 퓨 리 어스 정량으로 이어질 수 있습니다. Hexahistidine 태그와 표현의 PFV에 대장균 (그림 1)에서 유도 된 이며 니켈 친화성 크로마토그래피 (그...

토론

DNA 복구 단백질, 단일 분자 현미경 검사 법 응용 프로그램, 또는 retroviral integrases 산소 청소부와 같은 DNA와 상호 작용 하는 재조합 단백질 오염 세균 nucleases^2,3의 무료 되어야 합니다. 이러한 오염 물질은 동안에 대량 생물 또는 단일 분자 분석 실험 결과의 해석을 혼동 수 있습니다.

우리는 세균 nuclease 자주 공동 정화 PFV 인치와 발견 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
LB broth	EMD biosciences	1.10285.0500
Ampicillin	Amresco	0339
Chloramphenicol	Amresco	0230
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
IPTG	Denville Scientific	CI8280
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF	Amresco	0754
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
DTT	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
MgSO4	Amresco	0662
Agarose	Denville Scientific	CA3510
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Glycerol	Fisher Scientific	G37-20
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01
HRV14 3C protease	EMD Chemicals	71493-3