해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

요약

이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

초록

플라즈마 살 균 산업, 임상, 및 spaceflight 목적으로 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 저압 플라즈마 (LPP) 방전 급속 한 미생물 비활성화 이어질 활성 종의 광범위 한 스펙트럼을 포함. 효율성과 LPP에 의해 살 균의 메커니즘 연구, 우리는 기존의 살 균 절차에 대 한 그들의 특별 한 저항 때문에 새 균의 subtilis 테스트 기체의 포자를 사용 합니다. 우리는 B. subtilis 포자 monolayers, 이중 유도 결합된 플라즈마 반응 기, 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 포자 형태학의 특성에서에서 저압 플라즈마에 의해 살 균 과정의 생산을 설명 하 고는 발 아 및 라이브 셀 현미경으로 포자의 파생물의 분석. 플라즈마의 주요 대상 게놈 소재 (DNA) 이며 포자 부흥 시 플라즈마 유도 DNA 장애의 복구는 생물의 생존을 위해 중요 한. 여기, 우리는 포자의 발 아 능력을 연구 하 고 DNA의 역할 붙일 이라는 DNA 복구 단백질 (RecA) 시간 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 추적 하 여 LPP와 치료 후 포자 발 아 및 파생물 복구 합니다. 치료 및 치료 포자 monolayers는 발 아에 대 한 활성화 개별 포자의 반응에 따라 시간이 지남에 거꾸로 confocal 라이브 셀 현미경으로 시각. 우리의 관측 공개 출 아 포자를 빨리 성장 하 고 일부 LPP 트리트먼트 120 s. RecA YFP (노란색 형광 단백질) 형광 몇 포자에만 감지 되 고 모두에 개발 되었다 후 최소에 도달의 기간에 따라 달라 집니다. LPP 취급 포자에 약간의 상승으로 빨리 성장 세포. 또한, 일부 식물 박테리아의 세포질에 있는 증가 보여주었다 LPP 취급 포자에서 파생 된 그리고 lyse 경향이. 개별 포자의 분석에 대 한 설명된 방법 포자 발 아 및 파생물의 다른 측면의 연구에 대 한 훌륭한 될 수 있습니다.

서문

우주 탐사의 주요 목표는 생명체와 다른 행성 몸과 우리의 태양계에 있는 달에 생체의 서명에 대 한 검색입니다. 미생물의 전송 또는 탐험의 중요 한 영역을 지구 근원의 생체 개발 및 생활 탐지 임무 화성과 유로 파¹등 행성의 시체의 무결성을 영향을 미칠 특정 위험입니다. 여는 위원회의 공간 연구 (COSPAR) 1967 년에에서 설립, 행성 보호의 국제 지침 다른 행성, 그들의 위성, 소행성, 및 다른 천체를 유인 하 고 로봇 임무에 대 한 엄격한 규제를 부과 하 고 규제는 청소 및 살 균 지상파 미생물 오염 제거 하 고 천체²의 교차 오염을 방지 하기 위하여 발사 하는 우주선과 이전 중요 한 하드웨어 구성 요소. 지난 10 년간 비 열 플라즈마의 응용 spaceflight 응용 프로그램^3,,45뿐만 아니라 생물 의학 및 영양 연구에 광범위 한 관심을 얻고 있다. 신속 하 고 효율적인 미생물 비활성화⁶을 민감한 부드러운 고 열 불안정 물질 동안 제공 플라즈마 살 균은 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 플라즈마 방전 자유 래 디 칼, 입자, 중립/흥분 원자, 광자 자외선 (UV), 진공 자외선 (VUV) 스펙트럼에 있는 급속 한 미생물 비활성화³반응 요원의 혼합물을 포함 합니다. 이 연구에서 우리는 새 균의 subtilis endospores 유리 테스트 표면에 배포를 비활성화 하 이중 저압 유도 결합된 플라즈마 (DICP) 소스^7,8 에 의해 생성 된 저압 플라즈마를 사용 합니다.

가족 Bacillaceae 의 그람 양성 박테리아는 토양, 퇴적 물, 및 클린 룸 시설 등 국제 우주 정거장^{9,10 비정상적인 환경에서 뿐만 아니라 공기의 자연 서식 지에 널리 배포 ,11}. 속 균 의 가장 뚜렷한 특징은 영양소 고갈¹²등 불리 한 조건, 살아남기 위해 저항력 휴면 endospores (포자 라 함)을 형성 하는 기능 이다. 포자는 일반적으로 훨씬 더 다양 한 트리 트 먼 트 및 환경 스트레스, 열, 자외선, 감마 방사선, 건조, 기계적 장애, 및 강한 산화 제와 같은 독성 화학 물질을 포함 하 여 식물 세포 들 보다 저항 또는 pH 변화 에이전트 (참조^13,14에서 검토) 되며 따라서 미생물 비활성화 방법의 효율성을 테스트 하기 위한 이상적인 개체. 때문에 genomic DNA는 박테리아^15,16, 병 변의 플라즈마 유도 DNA 수리의 플라즈마 처리의 주요 목표 (예: DNA 이중 가닥 나누기) 포자에 부흥은 박테리아^{13의 생존을 위해 중요 한 17}.

따라서, 우리 연구 포자의 발 아 용량 및 DNA 복구의 역할 포자 발 아 및 파생물 다음 개별 포자에 의해 낮은 압력 아르곤 플라즈마와 포자를 치료 후 하 고 형광 표시 DNA의 그들의 표현을 수리합니다 시간이 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 단백질 RecA. 우리는 재현할 수 있는 테스트 결과, 저압 플라즈마 살 균에 대 한 포자 monolayers의 처리, 플라즈마 처리 포자에 대 한 준비를 달성 하기 위한 monolayers에 B. subtilis 포자의 준비의 단계 지시를 주고 ultrastructural 평가 모니터링 활성 DNA와 함께에서 개별 포자의 수준에서 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 그리고 라이브 셀 현미경 분석을 사용 하 여 셀 내에 플라즈마 처리에 발생 하는 프로세스를 복구 합니다.

프로토콜

1. 새 균의 subtilis 포자 생산 및 정화

1. 포자 생산에 대 한 각각의 5 mL 하룻밤 문화 전송 B. subtilis 스트레인, 적절 한 항생제, 200 mL (당 리터 16 g 영양 국물, KCl 2 g, 0.5 g MgSO _{더블 강도 액체 쉐 퍼 포자 형성 매체를 보충 4}* 7 H₂O 2 mL 1 M Ca (₃)₂, 2 mL의 0.1 m M MnCl₂ * • 4 H₂O 2 mL 1 m m FeSO₄, 2 mL 50% (w/v) 포도 당¹⁸) 72 h 또는 문화 > 95%까지 37 ° C에서 활발 한 통 기 통풍으로 육성 sporulated는. 다음 변종 포자 사용 됩니다: B. subtilis PY79 (야생 유형) B. subtilis PY79ΔrecA:: 네오 (DNA 수 선 단백질 RecA의 결핍) B. subtilis PY79 recA yfp:: 고양이 (RecA 융합 노란색 형광 단백질 [YFP]¹⁹).
2. 50 mL 튜브에 3000 x g에서 15 분 동안 원심 분리 하 여 포자를 수확 하 고 반복된 세척 단계 (최대 15 시간) 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 순도 및 발 아 상태에 대 한 멸 균 증류수 H₂O와 검사를 사용 하 여 샘플을 정화. 포자 현 탁 액 단계 밝은 포자 (> 99%)으로 구성, 자유롭다 식물 세포 (막대), 세균된 포자 (검정 / 회색 외관)과 세포 파편, 그렇지 않으면 현미경 실험을 방해 수 있습니다 추가 확인 하십시오. 원하는 순도 도달할 때까지 샘플을 씻으십시오.
3. 50 µ L 파운드 agar에 10 직렬 희석의 밖으로 도금 하 여 포자 titer 결정 (예: 사용 30 µ L 샘플 + 270 µ L 살 균 물 1시 10분 희석. 받아 270 µ L H₂O 1: 100 희석에 대 한 특정 희석에서 30 µ L 등등) CFU (콜로 니 형성 단위)을 계산 하 고 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. CFU 결정 후 집중 또는 살 균 물으로 희석 하 여 mL 당 10⁹ 포자를 샘플을 조정 합니다.

2. 샘플 준비 졸 입금 새 균의 subtilis 포자의

참고: 축적 및 포자의 중첩 발생할 수 있습니다 처리 도중, 효과 그림자 궁극적으로 위조 된 비활성화 속도 론 인. 이 문제를 최소화 하기 위해에 어로 졸 증 착 기술은²⁰여 포자 샘플을 준비 합니다. 간단히, 가압된 캐리어 가스 (여기서 N₂)의 흐름으로 콘서트에 액체 처리량을 조절 하는 전기 타이머와 높은 정밀도 2 물질 노즐을 제어 합니다. 질소 가스 흐름을 사용 하 여 노즐 출구를 통해 주입 된 액체 샘플을 분산.

1. (생존 활동)에 대 한 멸 균된 현미경 슬라이드 형태의 샘플 캐리어 또는 25 mm coverslips 라운드 (DNA 수리의 형광 추적 프로세스/cLSM; confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법) 전자식으로 작동된에 어로 졸 분사 장치 내부 에 노즐 정렬. 사용 된 포자 농도에 해당 하는 데 필요한는 원하는 최종 농도의 백배.
2. 포자 문화의 1 mL 노즐 액체 입구 전송과 0.1의 살포 과정 시작 1.3 바의 압력에서 s. 분무 포자 현 탁 액 (1 x 10⁷) 균일 하 게 분산된 포자 단층을 형성 하는 초 이내 급속 하 게 말리는 현미경 슬라이드에 얇은 필름을 형성 합니다. 실 온에서 살 균 컨테이너에서 처리 샘플 캐리어를 저장 합니다.

3. 저압 플라즈마 처리

1. 생물 학적 샘플의 처리를 위한 플라즈마 시스템을 준비 하 고 5에서 시스템을 작동 5 분 동안 500 W에서 아르곤 플라즈마와 Pa. 이것에 의해, 시스템의 모든 표면은 청소 하 고 예 열. 이 시스템을 배출 하는 동안 주위 공기, 질소, 산소, 그리고 물, 즉 분자의 고집을 감소 시킨다. 시스템의 전처리 후 챔버를 환기 하 고 유리 선반의 도움으로 원자로 용기의 센터에 샘플을 신중 하 게 배치 합니다.
2. 적어도 3 개의 생물 복제를 사용 합니다. 챔버를 닫고 2 아래 철수 아빠 나중, 챔버로 공정 가스를 채우기. 5 시스템에 압력 조절 실바
3. 정의 된 프로세스 시간 후 전력 및 가스 공급을 해제 하 고 신중 하 게 샘플 홀더에서 샘플을 부을 방지 하기 위해 시스템을 환기. 환기, 후 샘플을 제거 하 고 시스템에서 다음 매개 변수에 대 한 샘플을 배치 합니다. 플라즈마 치료 비 컨트롤 샘플만 진공을 노출에 대 한 (5 Pa) 응용된 플라즈마 긴 시간에 해당 공정 가스의 존재에.

4. 복구 및 포자 생존의 평가

1. 압력가 10% 폴 리 비닐 아세테이트 (PVA)의 솔루션을 준비 하 고 신중 하 게 약 500 µ L로 샘플 캐리어 커버 그들이 4 h. 스트립에 대 한 공기 건조 소독 집게를 사용 하 여 (지금 포자 샘플을 포함 하는) 말린 PVA 레이어 및 2 mL에 전송 반응 관입니다. 튜브를 살 균 물의 1 mL를 추가 하 고 vortexing 통해 PVA 레이어 디졸브. 이 절차를 리드 > 포자의 95% 회복²¹그들의 발 아 능력는 영향을 미치지 않습니다.
2. 직렬 (즉 270 µ L 살 균 H₂O + 30 µ L 샘플/전 희석) 96 잘 접시에 메 마른 물에 1시 10분에서 샘플을 희석. 50 µ L 각 희석 Lysogeny 국물 영양 한 천 (파운드)에 밖으로 하십시오, 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 고 자란된 식민지 (CFU)의 수를 열거.

5. 라이브 셀 현미경 검사 법, 출 아 포자에서 DNA 복구 프로세스의 추적

1. 발 아 실험에 대 한 준비는 1 m m 두께 1.5% 파운드-한 천 패드, 끓는 700 µ L 매체와 피펫으로 멸 균 현미경 페 트리 접시에 그것. 10 분 후는 8 m m x 8 m m x 1 m m 파운드-한 천 패드 살 균 메스를 잘라 하 고 신중 하 게 25 m m 유리 coverslips에 쉬고 있는 포자 monolayers 위에 agar를 전송.
   참고:이 단계 개별 포자의 시각화에 대 한 중요 하 고 영양 한 천에 의해 유도 된 발 아의 활성화 쪽으로 그들의 반응에 따라 허용. 따라서, 파운드-한 두 가지 목적, relocalization 표면을 따라와 광학 초점을 방지, 표면에 포자를 해결 하기 위해 (1) 및 (2) 발 아에 대 한 포자 활성화를 제공 합니다.
2. Agar와 샘플, 취재 후 전송 유리 coverslip 빠르게 이미징 챔버 및 현미경으로 자동된 confocal 레이저 스캐닝 현미경으로 샘플 63 X를 사용 하 여 거꾸로 광학 / 1.3 apochromatic 비행기 기름 침수 목표.
3. 이미징을 수행 형광 (YFP)는 여기의 514 nm의 방출 파장은 520 및 560 nm 사이 검출 될 수 있다.
   1. 스캔 모드 사진 배율 (전송 빛 경로) 중 하나를 사용 하 여 레코드 필드 밝은 이미지.
   2. 2.6%, 레이저 파워와 시간 경과 시리즈를 기록 하 고 5 공기 단위 및 30 초당 1 프레임의 샘플 주파수에서 confocal 조리개 설정 실험에 따라 5 h 0 h에서 s. 그것은 특정 참고 단색의 고용량 514에서 조명 레이저의 nm는 완전히 (그림 1A, B) 발 아를 억제.
4. 전체 이미징 프로세스 동안 난방 단계에서 37 ° C (주변 공기 습도)에서 샘플 계속. 적어도 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 각 조건에 대 한. 포자 집계, 다층된 포자 배포 또는 오염 먼지 입자에 의해 발생할 수 있습니다 ("그림자") 플라즈마 처리의 차단 및 (그림 1C, D) 숨겨진된 포자의 발 아를 활성화.

그림 1: 잠재적인 문제 confocal 살아있는 세포 형광 현미경 플라즈마 처리 포자의 동안 관찰. (A, B) 단색의 높은 복용량에 의해 발 아 포자의 억제 (514 nm) 레이저 조명. (A) B. subtilis (LAS72, RecA YFP)의 개요 (3 맞춘된 프레임 x 3) 발 아의 개시 후 180 분 포자. 중간에 프레임 (= 프레임) 주변의 지역 조명 하지 했다 반면 30 s 간격 (514 nm, 70% 레이저 전원), 레이저 빛의 높은 복용량에 노출 되었다 (밝은 분야 채널과 RecA YFP 형광;의 병합 된 이미지 구조 했다 주문 35 mm 이미징 찍힌된 500 µ m 그리드와 요리를 사용 하 여 발생 하는). (B) X 4를 보여줍니다 반면 포자, 단색 레이저 조명의 고용량에 노출 됐다 않았다 하지 발 아 하 고 성장, 보여주는 조명 및 조명 비 지역 사이 국경의 확대 보기에서 포자 비 조명 영역 완전히 밝은 RecA YFP 형광 (녹색 신호)를 표현 하는 무성 한 박테리아를 복구. (C, D) 입자 오염에 의해 덮여 포자 또는 포자 (화살표)의 여러 레이어 플라즈마 처리에 의해 비활성화에서 기본 포자를 보호 하 고 그들의 발 아 및 파생물 ("그림자 효과")를 허용 하는 것 같다. (C) 포자의 발 아 또는 (D)에 개시 후 60 s 한 군데 180 분 플라즈마 처리 했다 120 s 240 분 후 몇 군데와 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

6. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)

1. 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 치료 컨트롤에 비해 플라즈마 처리 포자의 표면 형태에 대 한 ultrastructural 정보를 제공. 금-팔라듐과 coverslips에 말린된 포자 monolayers 코트 (3 nm) 스퍼터 coater를 사용 하 여. 이미징 샘플, 지형 대조를 계시 하는 렌즈에서 2 차 전자 검출기를 포함 하 여 5 kV 가속 전압에 운영에 대 한 필드-방출 스캐닝 전자 현미경을 사용 합니다.

7. 데이터 분석

1. 여기서 N은 평균 치료 샘플의 CFU 고 N₀ 은 치료 진공 컨트롤의 CFU 평균 몫 N/N₀에서 포자 생존을 결정 합니다. 시간 (초)의 기능으로 아르곤 플라즈마 처리에 의해 포자 비활성화를 플롯 합니다. 평균 및 표준 편차로 표현 하는 모든 데이터 (n = 3).
2. 라이브 셀 이미징 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. 포자 발 아의 비율 계량 및 플라즈마 처리 후 빨리 성장, 대표 프레임 4 h 후에 뿐만 아니라 실험의 시작 부분에 있는 포자. 포자 생존 분석 실험의 의미 결정에 대 한 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (분산 분석) 통계 소프트웨어와 함께). P 값 < 0.05로 통계적으로 유의 한 것으로 간주 됩니다.

결과

플라즈마 처리 B. subtilis 의 생존 포자

B. subtilis 포자의 플라즈마 처리 사용이 연구 보기 생존 감소 (그림 2) 플라즈마 처리의 내구 증가 함께. RecA표현 스트레인의 포자-YFP 융합 유전자 유전 수정 세균 활력에 더 큰 영향을에 나타내는 야생 유형 긴장의 포자와 비슷한 생존 곡선을 보여주?...

토론

낮은 온도 사용 하 여 표면 살 균, 저압 플라즈마는 이온화 방사선, 화학 치료 등 오히려 기존의 살 균 절차를 유망한 대안 (예: 가스 H₂O₂ 와 같은 또는 에틸렌 산화물) 또는 건조 하 고 습 한 열²³. 일반 살 균 방법을 주로 효과적인 살 균을 제공 하지만 그들은 치료 재료 영향 및 연산자에 대 한 잠재적인 위험을 나타내는 알려져 있습니다. 저압 플라즈마는 자...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Two substance nozzle (model 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Tube connectors	Festo	n/a	G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Polyamid tube	Festo	558206	d = 6 mm
Glass slides	VWR	48300-026
Electric Timer 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
attofluor cell chamber	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, round
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Glucose	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
Nutrient Broth (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96-wellplate	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software)	Systat GmbH, Erkrath, Germany	n/a
Attofluor cell chamber	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom	ibidi	81168