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요약

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

초록

클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)는 CRISPR 관련 (Cas) 9 사이트별 진 핵 게놈에 대 한 같은 RNA 기반 nucleases 생성을 과학자 들에 의해 다른 용도로 원핵생물에서 적응 면역 시스템 편집. Cas9에 의해 게놈 엔지니어링 효율적으로 쉽고 튼튼하게 많은 biomedically 관련 된 포유류 세포와 유기 체에 내 생 유전자를 수정 하는 데 사용 됩니다. 여기 우리가 특정 유전자 변이의 생물 학적 기능을 이해 하는 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 하는 방법의 예를 보여줍니다. 우리는 특정 지역에서 생 Calr 소재 시를 대상으로 한 가이드 RNAs (sgRNAs)의 전달에 의해 murine 인터 루 킨-3 (밀-3) 종속 프로 B (Ba/F3) 셀에 calreticulin (CALR) 돌연변이 모델 어디 삽입 또는 삭제 (indel ) CALR 돌연변이 myeloproliferative 신생 (MPN), 혈액 암의 일종을 가진 환자에서 발생. sgRNAs 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 다양 한 크기의 indels를 주고 수리는 대상된 지역에 두 배 물가 틈 (DSBs)을 만듭니다. 우리 다음 조 혈 모 세포 변환에 Calr 돌연변이의 생리 적 수준 식이의 영향을 이해 하 표준 바/F3 세포 변환 분석 결과 사용 합니다. 이 방법은 다양 한 포유류 세포 라인에 그들의 생물학 기능을 공부 하기 다른 유전자에 적용할 수 있습니다.

서문

CRISPR/Cas9 기술 최근 살아있는 세포와 유기 체에서 편집 하는 타겟된 게놈 혁명 있다. 그것은 생물 의학 연구를 위한 매우 강력한 도구가 되고있다 고 현재1유전자 질환 치료에 대 한 잠재적인 애비뉴로 널리 사용 되 고 있다. 모든 게놈 편집 도구에 대 한 기초 수정할 genomic 소재 시에 nuclease 유도 DNA 두 배 좌초 휴식 (DSB)의 생성에 의존 합니다. DSBs 비 동종 끝-결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR)2,3에 의해 수리 수 있습니다. Cas9 nuclease 엔지니어링 nucleases 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 같은 다른 게놈에 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)의 장점은 RNA에 대 한 그것의 의존 대상 비교 원하는 DNA 시퀀스를 nuclease에 대 한 에 ZFNs 및 TALENs2,3에 단백질 DNA 상호 작용.

Prokaryotic 세포4,5에 적응 면역 시스템으로 CRISPR/Cas9 nuclease 통로의 발견 후 많은 노력 적응 포유류 세포 선 및 모델 생물2, 에 사용 하기 위해 통로에 간 3. 유전자 편집 도구로, CRISPR/Cas9 통로 활용 두 가지 주요 구성 요소: 연쇄 상 구 균 pyogenes (Sp) 파생 Cas9 nuclease 관심2,3의 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs. sgRNA 20 뉴클레오티드 RNA DNA 기본적인 쌍 complementarity2,3게놈에 특정 사이트에 직접 그 Cas9로 구성 됩니다. 대상 사이트는 sgRNA의 옆의 5' NGG SpCas9 nuclease에 의해 인식 되는 형태로 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 사이트에 있어야 합니다. 이러한 도구를 사용 Cas9 sgRNAs 대상 관심 영역을 설계 하 여 어떤 DNA 순서를 이동 수 있습니다. 또한 Sp Cas9 파생, 특정 응용 프로그램에 따라 다른 특징을 가진 Cas9에 대 한 추가 변종이 있습니다. 예를 들어 편집 하는 대상에 대 한 높은 특이성 또는6,7nicking dna 단일 가닥 절단 용량 Cas9 변종이 있습니다. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 최근 transcriptional 규칙8에 대 한 개발 되었습니다. 과학자 들은 이제 다양 한 유전자 쫓 고 녹아웃 유전자9, 기능 손실 및 이득의 함수 라이브러리 화면10 및 유전 생물 학적 기능 연구 등의 응용 프로그램에 대 한 CRISPR/Cas9 시스템 사용 모델 생물11의 공학입니다.

이 프로토콜에서 우리 CALR 돌연변이의 생물 학적 기능을 이해 하 바/F3 세포 변환 분석 결과와 CRISPR/Cas9 방법론을 결합 한다. 학사/f 3 셀은 murine IL 3 종속 조 혈 세포 라인 IL 3 렌더링 될 수 있는 특정 oncogenes BCR ABL12등의 표현에 따라 독립. 이해 여부 돌연변이 calreticulin cytokine 독립적인 성장에 바/F3 셀을 변형할 수 있다, 우리는 엑손 9 indel 돌연변이 소개 하는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 내 인 성 Calr 소재 시의 대상으로 하 고 다음 적용할 셀에서 IL-3를 철회를 긍정적인 선택 압력, 업과 MPN 환자에서 발견 기능 이득 CALR 돌연변이의 목표와 함께. 프로토콜 포함 디자인, 복제 및 sgRNAs, 안정적인 Cas9 표현 세포의 개발의 전달 하 고 CRISPR에 대 한 심사 대상 유전자 편집. 이 프로토콜 다른 유전자와 관심의 다양 한 cytokine 종속 셀 라인에 적용할 수 있는 모델링 및 암에서 관련된 유전자의 생물 학적 기능 공부에서 특히 중요 하며

프로토콜

1. sgRNA 디자인을 사용 하 여 온라인 도구13

  1. 자유롭게 사용 가능한 온라인 도구를 사용 하 여 관심사의 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs 디자인.
    1. 복사 및 광범위 한 연구소 sgRNA 디자이너 웹 도구에 관심사의 유전자의 NCBI 참고 순서를 붙여 넣습니다: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      참고:이 도구 exons 내의 분열 사이트 sgRNA 시퀀스를 식별 하 고 하지만 여전히 intron/엑손 경계를 확장 하는 exon 내 쪼개 다.
    2. 다운로드 및 오픈 텍스트 출력 파일에서 excel.
    3. SgRNA 시퀀스 및 sgRNA 컨텍스트 시퀀스를 채워집니다 열에 초점. SgRNA 시퀀스에 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 포함 되어 있지 않습니다 하지만 컨텍스트 시퀀스 할 note.
    4. Note에 대상 효능 점수 예측된 분열 효율성 점수 1의 점수 높은 절단 효율성을 나타냅니다 1-0의 규모에 나열.
    5. '정렬' 기능 효능 점수 또는 '대상 컷 %' 칼럼을 통해 대상의 유전자 내의 위치 목표를 주문 하거나 excel을 사용 합니다.
      참고: 유전자 내의 위치 정렬 대상으로 특정 도메인 또는 관심의 exon sgRNAs를 식별 하는 데 유용 합니다.
    6. 높은 관심의 영역을 대상으로 3-6 sgRNAs 선택 (> 0.6) 효능 점수 대상. 돌연변이의 종류는 원하는 (제발 참조 그림 1 설명 하는 calreticulin에 대 한 사용 대상 전략) 표현 형에 대 한 책임 수 있습니다 아는 것이 유용할 수 있습니다.
      참고: 다른 좋은 후보자의 부족 때 제안된 0.6 효능 점수 임계값 아래 sgRNAs는 고려 되어야 한다.
    7. 화면에 MIT gRNA 분석 웹 도구를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 효과 (http://crispr.mit.edu/). 각 sgRNA 선택, (를 포함 하 여 PAM) 대상 시퀀스를 실행 합니다.
      참고: 넓은 연구소 sgRNA 디자이너 웹 도구 사용 될 수도 오프 대상 효과 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)에 대 한 화면으로.
      1. 참고는 MIT sgRNA 분석 도구 점수 각 sgRNA 1-100의 규모에 있는 100의 점수는 더 높은 특이성을 나타냅니다. 점수를 70 보다 큰 이상적 이며 최소 오프 대상 효과 함께 sgRNA를 나타냅니다. 이 웹사이트는 또한 목록을 생성 게놈 및 얼마나 많은 불일치 내의 그들의 위치에서 대상 안타의 각각 후보 가이드와 함께 있다.
        참고: 대상에서 안타 4 불일치 또는 큰 안전14간주 됩니다. 미만 4 불일치 오프 대상 안타 exons14내가 경우 문제가 될 수 있습니다.
    8. 2-3 sgRNAs를 대상으로 대상 유전자에 대 한 관심의 영역 내에서 독특한 위치 그리고 있는 최고의 짝된 분열 효율성과 오프 대상 선택 ( Calr의 엑손 9를 대상으로 하는 sgRNA 시퀀스에 대 한 표 1 참조).
      참고: 실험 목표에 따라 큰 중점 언급 한 도구에서 가져온 다른 값에 삽입할 수 있습니다.

2. 복제 sgRNA Oligos13

  1. 앞으로 올리고 생성
    1. PAM 사이트 없이 sgRNA 시퀀스의 목록을 만듭니다.
    2. SgRNA 시퀀스의 5' 끝은 G. 하지 않으면 시퀀스의 5' 끝에 G를 추가
      참고:이 G는 U6 구동 sgRNA 전사 수준 극대화 필요 합니다. G의 추가 m 1 sgRNA (표 1) 필요 합니다.
    3. G 최적화 가이드 시퀀스 (PAM)의 5' 끝에 "CACC" 시퀀스를 추가 (표 2) BsmBI로 단련된 oligos의 결 찰에 필요한 돌출부를 생성 하기 위해 lentiGuide 벡터를 소화 (3 단계 참조).
  2. 역방향 올리고 생성
    1. G 최적화 가이드 시퀀스 (PAM)을 보완 하는 역.
    2. 반대로 보충된 G 최적화 가이드 시퀀스 (표 2)의 5' 끝에 "AAAC" 시퀀스를 추가 합니다.
    3. 뇌관 종합 회사에서 설계 oligos를 주문.
  3. Anneal 및 oligos phosphorylate
    1. 앞으로 올리고 (100 µ M), 역방향 올리고 (100 µ M)의 1 µ L의 1 µ L을 추가, T4 결 찰 x 10의 1 µ L, 0.5 µ L T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 버퍼 및 H2O PCR 튜브에 6.5 µ L (총 = 10 µ L).
    2. thermocycler에서 다음 프로그램 실행: 37 ˚C 30 분, 95 5 분 ˚C, 95에서 경사 0.1에서 25로 ° C/s.
    3. 1: 250 H2o.에서 반응 제품을 희석

3. lentiGuide-순수 하지 않아 벡터13 의 소화

  1. 다이제스트 lentiGuide-순수 하지 않아 벡터
    1. 다음 구성 요소와 50 µ L 소화 반응 조립: 원형 플라스 미드, BsmBI 제한 효소의 2 µ L (30 대), 5 µ L의 제한 효소 버퍼 및 H2o.의 50 µ L까지 5 µ g
    2. 55 ° c.에서 실행 하는 2 시간에 대 한 반응 첫 번째 시간 후 BsmBI 제한 효소의 더 많은 1 µ L를 추가 합니다.
  2. Dephosphorylate 컷된 백본
    1. 소화 벡터를 7 µ L의 인산 가수분해 효소 반응 버퍼와 인산 가수분해 효소 효소의 2 µ L를 추가 합니다.
    2. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
  3. PCR 정화 잘라내기 및 상업 키트를 사용 하 여 dephosphorylated 백본.
    참고: 대체 miniprep 키트와 함께 제공 된 핑크 컬러 열 때문이 더 큰 플라스 미드의 크기를 수용할 수 있는 컬러 열을 블루. 차입 전에 90 ˚C 열 블록에 차입 버퍼를가 열 하 고 (두 번째 시간을 통해 다시 첫 번째 차입에서 eluted DNA를 실행) 끝에 두 번 열에서 DNA를 방출 하 여 수확량을 늘릴 수 있습니다.

4. 결 찰 ofAnnealed Oligos 소화 백본13 에

  1. 추가 50 ng 소화 백본의 1 µ L의 단련 올리고 희석, T4 결 찰 x 10의 1 µ L, 1 µ L t 4 리가의 및 H2O PCR 튜브에 10 µ L까지 버퍼. 실 온에서 1 h에 대 한 품 어
  2. 결 찰 반응의 2 µ L Stbl3 셀을 변환 합니다. 100 µ g/mL 암 피 실린을 lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 접시와 37 ° c.에서 밤새 품 어
  3. 3 식민지를 선택 하 고 미니 준비 문화에 접종.
  4. 올바른 올리고 삽입 확인
    1. 각 문화 및 상업 키트를 사용 하 여 U6 발기인에 뇌관에서 시작 올리고 삽입 사이트를 통해 순서는 miniprep를 수행 합니다.
    2. Midi-준비 또는 시퀀스 확인 문화 맥시 준비를 수행 합니다.

5. 셀 lLines 안정적으로 표현 SpCas9 세대

참고:이 프로토콜 lentiviral 감염에 의해 pLX_TRC311 Cas9 플라스 미드의 납품을 포함 한다. 이 프로토콜 murine 인터 루 킨-3 (밀-3) 종속 프로-B (Ba/F3) 세포, 현 탁 액 셀 라인에 대 한 세부 정보에서 설명 하 고 각 셀 형식에 대 한 선호 문화 조건을 사용 하 여 다른 셀 형식에 맞게 수 있습니다. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스 보충 RPMI 이루어져 바/f 3 셀에 대 한 문화 매체/L-글루타민과 10 ng/mL murine 인터 류 킨 3의.

  1. HEK 293T 세포 transfect
    1. 10 cm 조직 문화 접시 당 3 x 106 HEK 293T 세포 씨앗 Transfection 전에 하룻밤 시드 셀을 계속.
      참고: HEK 293T 세포 부착 셀 라인 하 고 정기적으로 바이러스 생산을 위해 사용 됩니다. 셀은 DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스/L-글루타민 보충에 유지 됩니다. 세포는 transfection 시 80% 합칠 이어야 한다.
    2. 전 따뜻한 감소 혈 청 미디어 (Opti-MEM)와 성장 매체.
    3. 튜브로 감소 된 혈 청 미디어의 500 µ L, pLX_TRC311-Cas9 구축, pCMV-VSV-G lentiviral 포장 플라스 미드의 4 µ g 및 psPAX2 lentiviral 포장 플라스 미드의 4 µ g의 7 µ g을 추가
      참고: 총 DNA 293T 세포의 10 cm 접시 당 15 µ g 이다.
    4. DNA를 잘 혼합 하 고 45 µ L transfection 시 약의 추가. 부드럽게 혼합 하 고 그것은 20 분 동안 서 보자.
      참고: 미디어를 사용할 감소 된 혈 청 혈 청 transfection 시 약 및 플라스 미드 DNA 사이 복잡 한 형성을 억제 하기 때문에 중요 하다.
    5. 293T 접시에 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 성장 매체의 5 mL를 추가 합니다.
    6. 293T 접시에 드롭 현명한 방식으로 DNA와 transfection 시 믹스를 추가 합니다. 부드럽게 소용돌이 고 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
    7. 24 및 48 h 게시물 transfection에 바이러스 supernatants 수확. Cryovial 튜브 (1.6 mL/튜브와 1.5 mL 것입니다 감염에 대 한 사용)에 0.22 μ m 필터와 약 수를 통과.
    8. -80 ° c.에 게 바이러스 상쾌한
      참고: lentiviral 상쾌한 6 개월 이내에 사용할 수 있습니다. 가능 하면 spinfection transductions 수행 되어야 한다 신선한 바이러스).
  2. 바/F3 셀 lentiviral 감염
    1. 냉동 하는 경우 얼음, 바이러스 상쾌한을 녹여.
    2. 셀 4 분에 대 한 300 x g에서 원심
    3. 상쾌한 발음 하 고 resuspend 3 x 106 셀/mL의 농도에서 세포.
    4. Resuspended 세포, 바이러스 상쾌한의 1.5 mL, polybrene의 4 µ L의 500 µ L 추가 (재고: 2 mg/mL)와 m-IL3 6 잘 조직 배양 접시에서의 10 ng/mL. 미디어 컨트롤 바이러스 상쾌한 대신 1.5 mL와 잘는 감염 되지 않은 포함 되었는지 확인 합니다.
      참고: 바이러스 상쾌한 추가 금액 감염 (MOI)의 다양성에 대응 한다 < 1.
    5. 37 ° c.에 120 분 440 x g에서 격판덮개 원심
    6. 원심 분리기에서 접시를 받아 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 밤새 껏 성장 허용.
    7. 24 시간 후 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 6 잘 플레이트에서 신선한 따뜻한 미디어의 5 mL와 함께 resuspend.
  3. Cas9에 감염 된 세포의 선택
    1. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 blasticidin, 48 h 게시물 spinfection의 5 µ g/mL으로 보충 하는 신선한 따뜻한 미디어와 resuspend.
    2. Blasticidin 또는 감염된 (부정적인) 제어 셀 죽 었 때까지 9 일 동안 셀을 선택 합니다.
    3. 선택이 완료 되 면 내성 세포 blasticidin의 낮은 농도와 매체에 전송.

6. 기자 Cas9에 대 한 분석 결과 활동15

  1. 부모 셀과 셀 안정적으로 표현 Cas9 pXPR-011 lentiviral 감염에 의해 transduce (참조 단계 5.1-5.2).
    참고:이 벡터는 GFP와 GFP를 대상으로 한 가이드 포함 되어 있습니다. 세포 활성 Cas9를 포함 하는 GFP (그림 2)의 감소에 발생 합니다.
  2. 2 µ g/mL puromycin, 48 h 게시물 spinfection의 3 일에 대 한 셀을 선택 합니다.
  3. Cytometry 여 GFP 식에 대 한 샘플을 분석 했다.
    참고: 50% 이상의 GFP 감소 최적의 Cas9 활동을 나타냅니다. Blasticidin 선택의 높은 농도 경우 Cas9 활동을 증가 하는 데 사용할 수 보다 50% 감소를 관찰 했다. 모든 셀 라인 blasticidin 선택을 허용할 수 있습니다. 이 경우에, 다른 선택 카세트와 Cas9 벡터의 사용이 필요할 수 있습니다. 또한, 모든 셀 라인 Cas9의 안정적인 표현을 허용할 수 있습니다. 이 경우에, Cas9의 과도 transfection는 사용할 수 있습니다.

7. Spinfection sgRNAs Cas9 표현 세포로의

  1. 단계 5.1-5.2 sgRNAs의 lentiviral 감염에 대 한 관심의 세포로.
    참고: 단계 5.1.3에서에서 바꿉니다 pLX_TRC311 Cas9 구문을 섹션 4에서 확인 lentiGuide-순수 하지 않아 구조.
  2. 48 h, spinfection 게시 puromycin의 2 µ g/mL로 3 일에 대 한 셀을 선택 합니다.
  3. 항생제의 낮은 농도 가진 중간 내성 세포를 전송 하 고 충분 한 편집에 대 한 허용 하도록 다른 4 일 선택 계속.

8. 바/F3 세포 변환 및 m-IL3 철수를 사용 하 여 긍정적인 선택

참고:이 분석 결과 밀 3 종속 바/f 3 셀에 대 한 설명 하지만 어떤 사이토카인 종속 셀 라인에 적용할 수 있습니다.

  1. 기 하 급수적으로 성장 하는 학사/f 3 셀 ectopically Cas9 및 sgRNA 관심의 표현 아래로 회전 합니다.
  2. 상쾌한 발음 하 고 셀 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 씻어.
  3. 셀 아래로 회전 하 고 8.2에 세척 단계를 반복 4 번 (이 단계를 통해 미디어의 IL 3 무료).
  4. PBS를 발음 하 고 IL 3 없이 신선한 미디어의 5 mL에 셀 resuspend.
  5. hemocytometer 또는 셀 생존 분석기를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  6. 시드 3 중 IL 3 없이 신선한 미디어의 2 mL의 총 볼륨에서 1 x 105 셀/mL의 농도에서 6 잘 조직 문화 접시에 있는 셀입니다.
  7. 모니터링 및 셀 8 일 총 매 2 일.
    참고: 바/F3 셀 IL 3 일반적으로 부족 한 일 게시물 IL-3 기아 죽어. 분석 결과에서 부정적인 제어를 포함 하는 것이 중요 하다 (일반적으로 비를 대상으로 가이드 사용 됩니다 제어로).

9. CRISPR를 편집 하는 대상에 대 한 심사

  1. 디자인 CRISPR 뇌관 업스트림과 다운스트림 sgRNA 분열 사이트의 심사
    참고: 예측된 분열 사이트에서 뇌관 최소한 100 bp를 사용 하 여 탐지 하지 큰 삽입 또는 삭제 (indel) sgRNA 대상 사이트에 의해 영향을 받을 것을 보장.
  2. (성장 곡선의 끝)에서 변형 된 세포와 세포 중 cytokine 철수에서 게놈 DNA (gDNA)를 격리 합니다.
    참고: 항상 유전자 편집 컨트롤 비 대상으로 가이드 overexpressing 셀을 포함 합니다. 전과 후 변환 위해 선택한 긍정적으로 클론을 식별 하 고 증식 이점을 셀에서 gDNA를 분리.
  3. 다음 구성 요소와 50 µ L PCR 조립: 2 x PCR 믹스, 앞으로 뇌관 (10 µ M), 역방향 뇌관 (10 µ M)의 1 µ L, 50-100 ng gDNA, 및 H2O 50 µ L까지 1 µ L의 25 µ L.
    참고: 수많은 하이파이 polymerases 단계 9.3에서에서 사용할 수 있습니다.
  4. Thermocycler 다음 매개 변수를 사용 하 여 샘플을 실행: 1 분 동안 95 ° C, 30의 주기 (1 분, 52 ° C 30에 대 한 94 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s), 그리고 10 분 동안 72 ° C. 이 PCR는 표 3에 나열 된 Calr 뇌관에 최적화 되어 있습니다. 9.1 gDNA에 테스트 단계에서 설계 된 뇌관 쌍에 대 한 PCR 조건 최적화.
  5. 1 x 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼를 사용 하 여 10 V/cm에서 2 %agarose 젤에 5 µ L의 샘플을 실행 합니다. 존재에 대 한 샘플 검사 / 증폭된 밴드의 관심사의 유전자를 크기에 해당.
  6. PCR 반응 (45 µ L)의 나머지를 사용 하 여 PCR 정화를 수행.
  7. 키트는 플라스 미드 벡터에 클로닝 PCR와는 amplicons 클론. 예를 들어 pGEM T-간편한 벡터는 일반적으로 사용 됩니다.
  8. Stbl3 또는 다른 호환 셀 전지와 관련 항생제와 파운드 한 천 격판덮개에 격판덮개로 플라스 미드를 변환. 10-20 식민지, 각 하나, 소형 예비를 선택 하 고 각 클론 생어 대상 indels CRISPR/Cas9 편집에서 생성 하는 시퀀스.
    참고: 원하는 경우 단일 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 일괄 수행할 수 편집 특정 indel와 클론을 분리 하는 인구. 또한, 차세대 시퀀싱 (NGS) 방법을 더 견고 하 게 대상에 sgRNA 대상 지역에 걸친 PCR amplicons의 깊은 시퀀싱을 사용 하 여 편집 척도를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 분해 또는 조 수에 의해 Indels의 추적을 정확 하 게는 스펙트럼 및 셀 (https://tide.nki.nl/#about)16의 수영장에서 생성 하는 대상된 돌연변이의 주파수를 결정 하는 subcloning 대신 사용할 수 있습니다.

결과

여기에 설명 된 메서드를 사용 하 여,이 실험의 목표 소개 하는 조 혈 세포 변환에 생 Calr 소재 시에 indel 돌연변이의 기능 효과 공부 하는입니다. CRISPR/Cas9 시스템 바/f 3 셀에 내 인 성 Calr 돌연변이 만드는 도구로 사용 됩니다. 두 개의 sgRNAs 어디 삽입/삭제 (indel) 돌연변이 또는 일반적으로에서 발생 CALR지역에서 엑손 9 Calr (그림 1

토론

여기 우리 공부 조 혈 모 세포에서 CALR 돌연변이의 생물학 기능을 편집 하는 CRISPR/Cas9 유전자의 사용을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 매우 여러 요인에 따라 달라 집니다. 첫째, 그것은 어떤 종류의 돌연변이 원하는 표현 형에 대 한 책임 수 있습니다 아는 것이 중요입니다. 이 프로토콜에서 판독 밀 3 독립 학사/f 3 셀의 변화 이며 돌연변이의 유형은 indels CALR의 엑손 9에. 그러나, ...

공개

우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.

감사의 말

이 작품은 NIH (R01HL131835), Damon Runyon 임상 조사 상 및 스타 암 협회에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BsmBINew England BiolabsR0580L
BlasticidinSigma Aldrich15025
PuromycinLife TechnologiesA1113803
Stbl3 cellsLife TechnologiesC737303
TransIT-LT1Thermo Fisher ScientificMIR2300
Opti-MEMLife Technologies51985034
RPMIThermo Fisher ScientificMT10040CV
DMEMThermo Fisher Scientific10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Omega ScientificFB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamineLife Technologies10378016
mIL-3Peprotech213-13
psPAX2AddgeneN/A
pCMV-VSV-GAddgeneN/A
pLX_TRC311-Cas9AddgeneN/A
polybreneSigma AldrichH9268
pXPR-011AddgeneN/A
Phosphate Buffered Saline (PBS)Genessee Scientific25-507
TAE bufferThermo Fisher ScientificFERB49
LentiGuide-PuroAddgenePlasmid #52963
PNKNew England BiolabsM0201S
T4 ligaseNew England BiolabsM0202S
PCR purification kitQiagen28104
Miniprep kitQiagen27104

참고문헌

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

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