관찰 및 깜박이 표면 강화 된 라만 산란의 분석

Yasutaka Kitahama

doi:10.3791/56729

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기사 소개

요약
초록
서문
프로토콜
결과
토론
공개
감사의 말
자료
참고문헌
재인쇄 및 허가

요약

표면 강화 라만 점멸의 분석이이 프로토콜에 설명 합니다 전원 법을 사용 하 여 실버 표면에 단일 분자의 랜덤 워크 인 비 산.

초록

nanoaggregate 접속점에 단일 분자에서 관찰 표면 강화 된 라만 산란 (SERS) 점멸 합니다. 여기, 프로토콜 관련 활동을 준비 하는 방법에 선물 된다 nanoaggregate 실버, 미세한 이미지에서 특정 깜박이 명소의 비디오를 기록 하 고 깜박이 통계 분석. 이 분석에서 전원 법률 그들의 지속 시간에 상대적인 밝은 이벤트에 대 한 확률 분포를 재현합니다. 어두운 이벤트에 대 한 확률 분포는 지 수 함수 전원 법으로 적합 하다. 전원 법의 매개 변수는 모두 밝고 어두운 상태에서 분자 동작을 나타냅니다. 랜덤 워크 모델 및 전체 실버 표면에서 분자의 속도 추정 될 수 있습니다. 평균, 자기 상관 함수 및 슈퍼 해상도 관련 이미지를 사용 하는 경우에 추정 하는 것이 어렵습니다. 점멸의 기원만이 분석 방법에 의해 확인할 수 없습니다 때문에 미래에 전원 법 분석 스펙트럼 이미징, 함께 결합 되어야 합니다.

서문

표면 강화 라만 산란 (SERS) 고귀한 금속 표면에서 고감도 라만 분광학 이다. 금속 표면에 단일 분자의 정보를 조사 수 이후 기능적인 그룹 분자에서 진동 모드를 통해 날카로운 피크 위치에 따라 분자 구조에 대 한 자세한 정보를 제공 하는 라만 스펙트럼 관련¹^,²^,³을 사용 하 여. 단일 분자 수준에서 흡착과 실버 nanoaggregate에서 깜박이 신호 관찰¹^,²^,³^,^,⁴⁵^,⁶^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶, 그리고 스펙트럼 변동¹^,²^,³^,^,⁴⁵^,⁶^,⁷^,⁸, ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,^,¹³¹⁴. 깜박임 무작위로 나노미터 크기의 nanoaggregate 접속점에 향상 된 전자기 (EM) 필드 밖으로 이동 하는 단일 분자에 의해 유도 될 수 있다. 따라서, 점멸 SERS 농도 및 bi 분석²^,^,³¹⁷의 포아송 분포를 사용 하는 기술에 비해 단일 분자 검출에 대 한 간단한 증거를 간주 됩니다. 그러나, 강하게 Ag 표면에 분자 행동에 달려 있습니다, 깜박이 변동 스펙트럼의 상세한 메커니즘은 아직도 논란이 있습니다.

이전 학문에서는, 점멸 관련 분석 된 고 확산 계수는 향상 된 EM 필드¹²^,¹³^,^{14 밖으로 이동 하는 분자의 농도 계산할 수 있습니다 자기 상관 함수를 사용 하 여}. 또한, 불안정 총 강도 나타내는 정규화 된 표준 편차 점수는 신호¹⁵시간 프로필에서 파생 되었습니다. 그러나, 이러한 분석 방법 몇 가지 분자의 동작에 따라 수 있습니다. 반면, 깜박이 SER의 슈퍼 고해상도 이미징, 향상 된 EM 필드에 단일 분자 동작 확인 된¹⁶될 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 향상 된 EM 필드에만 이러한 매개 변수를 얻을 수 있습니다. (예를 들어, 깜박이 SERS)에서 넓은 범위 내 단일 분자의 임의의 동작 전원 법 보다는 평균⁴^,^,⁵⁶^,⁷^,^{8로 대표 될 수 있다} ^,^,⁹¹⁰^,¹¹, 단일 반도체 양자 점 (QD)¹⁸^,¹⁹의 점멸 형광 비슷합니다. 전원 법 분석⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,^,⁸⁹^,¹⁰^,¹¹, 분자 동작을 사용 하 여 (향상 된 EM 필드)에 밝은 상태와 어두운 상태¹⁰;에서 예상할 수 있는 즉, 전체 실버 표면 분자의 행동은 추정 될 수 있습니다.

이 기술에 대 한 실버 콜 로이드 nanoaggregates는 사용된⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,^,⁸⁹^,^,¹⁰¹¹. 이러한 nanoaggregates 그들은 특정 한 파장에 흥분 하는 때 강력 하 게 향상 된 전자기 필드를 영향을 미칠 다양 한 지역화 된 표면 플라스몬 공명 (LSPR) 밴드를 표시 합니다. 따라서, 관련 액티브 실버 나노 콜 로이드 서 스 펜 션, 그리고 일부 데이터에 존재 하는 즉시 얻을 수 있습니다. 특정 크기, 모양, 그리고 준비는 간단한 nanostructures의 경우 SER 점멸의 LSPR 의존 다른 의존⁷;을 숨길 수 있는 즉, LSPR에 좋은 소식이 나 나쁜 nanostructure 사용 하는 경우 매개 변수 상수, 되며 다른 의존 따라서 숨겨져 있을 것 이다. 전원 법 분석 실버 콜 로이드 nanoaggregates⁴^,^,⁵⁶^,⁷^,⁸^, 에서 깜박이 관련의 다양 한 종속성을 발견 하는 데 사용 되었습니다. ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹.

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프로토콜

1. 샘플 준비

실버 콜 로이드 나노 입자의 준비 ²⁰
1. 조작 실버 콜 로이드 나노 입자, 실버 질산염의 그리고 150 mL 200 mL 둥근 바닥 플라스 크에 물이 수화물 trisodium 시트르산의 0.030 g 0.030 g을 분해.
2. 플라스 크를 결합 하 여 환류 (Dimroth) 콘덴서와 함께.
3. 마그네틱 교 반기 및 저 어 바와 플라스 크에 솔루션을 저 어. 그런 다음 60 분 동안 150 ° C에 기름 목욕에서 플라스 크에서 감동적인 솔루션 열.
  참고: 솔루션은 노란색, 다음은 하 회색을 돌 것 이다.
4. 서 스 펜 션, 실내 온도에 냉각 하 고 냉장고에 알루미늄 호 일로 덮여 플라스 크에 정지를 유지.
  참고: 프로토콜 수 수 일시 중지이 시점에서. 콜 로이드 나노 입자를 사용 하 여 1 개월 이내는 냉장고에 저장 후.
다중 색에 대 한 샘플의 준비 점멸 방출 ¹¹
1. 현미경 슬라이드를 준비, 유리 접시 비누를 손으로 세척 하 고 물으로 씻어.
2. 유리 접시에 0.1% 폴 리-L-리 신 수성 솔루션을 추가 하 고 솔루션을 제거 하는 송풍기와.
3. 유리 접시에 실버 콜 로이드 현 탁 액을 추가 하 고 송풍기와 현 탁 액을 제거.
4. 액체 차단 펜으로 유리 접시에 드롭 영역을 묶습니다.
5. 유리 접시에 증류수를 삭제 하 고 다른 유리 접시 현미경 슬라이드를 만들고 증발에서 물을 방지 하기를 다룹니다.
단조로운 색된 점멸 관련에 대 한 샘플의 준비 ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰
1. 현미경 슬라이드를 준비, 유리 접시 비누를 손으로 세척 하 고 물으로 씻어.
2. Thiacyanine 또는 thiacarbocyanine 염료와 실버 콜 로이드 현 탁 액을 혼합 (25 또는 4 µ M, 각각)와 2의 볼륨 비율로 NaCl (10mm) 용액: 1:1.
3. 유리 접시에 샘플 중지를 삭제 하 고 송풍기와 현 탁 액을 제거.
4. 액체 차단 펜으로 유리 접시에 드롭 영역을 묶습니다.
5. 나노 입자를 고정을 유리 접시에 NaCl (1 M)의 수성 해결책을 삭제 하 고 다른 유리 접시 현미경 슬라이드 플레이트를 만들고 솔루션에서 증발 방지를 커버.

2입니다. 점멸은 나노 입자의 관찰

샘플의 조명
1. 1.2 또는 1.3 프로토콜을 사용 하 여 거꾸로 현미경의 스테이지 준비 샘플 유리 접시를 놓습니다.
2. 목표 렌즈 (60 X)를 사용 하 여 유리 접시에 다양 한 색된 반점 (, 녹색, 노란색, 파란색과 빨간색)에 어두운 필드 콘덴서와 통해 하얀 빛을 사용 하 여 샘플 유리 접시 켜.
3. 밝게 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도 다이오드 펌프 고체 (DPSS) 연속파 (cw) 레이저 간섭 필터를 통해 전달 감쇠 광속을 사용 하 여 샘플 유리 접시.
4. 사용 하 여 레이저 조명 같은 색 주변에 단조로운 색된 반점으로 실버 nanoaggregates 관찰, 보기의 센터에 레이저 조명 영역을 이동 하 고 z-방향으로 단계를 조정 하 여 유리 접시에 반점에 초점.
점멸의 관찰
1. 목표 렌즈 후 긴-패스 필터를 삽입 하 고 간섭 필터를 통해 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도에서 전달 DPSS cw 레이저 광선을 사용 하 여 샘플 유리 접시를 조명.
2. 그림 1 에서 보듯이 명소 점멸 찾기 (참고 그림 S1 보충 자료에서) 무대에는 x-및 y-방향으로 이동 하 여.
3. 거꾸로 현미경, 냉각된 디지털 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라, 61-120 ms의 시간 분해능이 20 분에 대 한 결합으로 깜박이 명소의 기록 영상.

3입니다. 깜박이 SER의 분석

비디오에서 시간 프로필의 유래
1. CCD 카메라를 제어 하는 소프트웨어에서 비디오 파일을 엽니다.
2. 깜박이 관광 명소 및 어두운 영역을 선택 하려면 별도로 지역 명소 비디오 이미지 없이 커버 하는 영역을 드래그 합니다.
3. 깜박이 관광 명소와 비디오에서 어두운 영역에서 신호 강도 시간 프로필 파생, 분석, 임시 분석 을 선택 하 고 임시 분석 창에서 계산 을 클릭 합니다.
4. 텍스트 파일로 데이터를 저장.
시간 프로 파일의 분석
1. 어두운 영역 또는 그림 2A 와 2B와 같이 다항식 함수과 시간 프로필을 빼서 시간 프로필의 기준선을 평평.
2. 약 2000 포인트, 난_기본, 그리고 초기 농도의 표준 편차 σ, 그림 2C 및 2D에서 같이 구성 된 평균된 초기 강도 평가 합니다.
3. 내가_기본 + 3σ의 임계값 보다 큰 농도 사용 하 여 어두운 이벤트에서 밝은 이벤트를 구별 하 고 각 이벤트의 기간을 기록 합니다. 그림 3에서 예를 들어 0에서 3.5476 이벤트 기록 어두운 이벤트로 s ( t 기간 = 3.5476 s), 4.0981 3.5476에서 이벤트를 기록 하 고 밝은 이벤트로 s (기간 t = 0.5505 s). 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 반복 합니다.
4. 표 2의 첫 번째 및 두 번째 라인에 표현 각 기간에 대 한 밝고 어두운 이벤트 수를 계산.
5. 이벤트 기간 t보다 짧은 제외한 각 기간에 대 한 이벤트 수를 합계 하십시오. 표 2의 두 번째 및 세 번째 라인에 표현, 예를 들어 각 기간에 대 한 이벤트 수를 합계 ( t 에 대 한 이벤트를 제외 하 고 0.0612 = s) 41 + 18 + 9 +...; 결과 t 에 대 한 합계 = 0.1223 s, 즉, 103.
6. 각 기간별로 합계를 분할 하 고 그들을 정상화. 표 2에 표현, 예를 들면, 기간 t 에 대 한 변론 분할 0.0612 = s 기간 0.0612 s. 결과 3,351.5791입니다. 그런 다음 표 2에 네 번째 줄에서 결과의 총 결과 나눕니다. 확률 분포는 0.64494 것 파생 됩니다.
7. 밝은 이벤트 P(t)에 대 한 그들의 기간 t 로그-로그 그래프에 대 한 확률 분포를 플롯 및 로그₁₀P_에(t) 로그_{10에 의해}()는 전원 법 지 수 α에_에 깜박이 자리 특정 추론할. P_에(t)는으로 장착 하는 경우 , 그림 4A에 점선으로 표시 된 것 처럼 장착된 라인 P(t)의 값이 작은 플롯에서 일탈.
8. 어두운 이벤트 P_오프(t) 로그-로그 그래프에 그들의 시간 t 에 대 한 확률 분포를 플롯 및 로그₁₀(로그₁₀P_오프(t) 맞는 는 전원 법 지 수 α_오프 와는 잘림 시간 τ 동일한 점멸에서 자리를 추론할. P_오프(t)는으로 장착 하는 경우 , 맞춤된 곡선 P_오프(t)의 값이 작은 플롯에서 성적이 상자.
9. 3.2.1 3.2.8 비디오에서 다른 깜박이 관광 명소에 대 한 반복 합니다.

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결과

그림 1¹¹에서 같이 폴 리-L-리 신 1.2 프로토콜에 의해 준비와 함께 실버 nanoaggregates에서 관련 및 표면 강화 된 형광 색된 점멸 명소 관찰 된다. 반면에, SERS에서 단조로운 색된 점멸 명소 프로토콜 1.3⁷^,⁸^,^,⁹¹⁰에 의해 준비 된 염료 분자와 실?...

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토론

실버 nanoaggregate 접합에서 SER는 발생 합니다. 따라서, 우리는 시트르산 음이온으로 덮여 있다 콜 로이드 나노 입자, 보다는 오히려 nanoaggregates를 준비 해야 합니다. 실버 집계 효과 폴 리-L-리 신,-NH₃⁺ 이며는 SER의 기원의 추가 의해 만들어진 소금에서 형성 된다 또는 NaCl, 보충 자료의 그림 s 2 와 같이에서 Na⁺ 양이온. 또한, 넓은 지역에 많은 관광 명소를 밝히는, ?...

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공개

저자는 공개 상관이 있다.

감사의 말

저자는이 작품의 그들의 유익한 토론에 대 한 교수부터 Y. 오자키 (간사이 학원 대학) 및 박사 T. 이토 (국립 연구소의 첨단 산업 과학 및 기술)을 감사합니다. 이 작품의 교육부, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (No. 16 K 05671)에서 KAKENHI (선진적인 과학 연구 c)에 의해 지원 되었다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nitrate, 99.8%	Wako	194-00832
Trisodium citrate dihydrate, 99. %	Wako	191-01785
Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1%	Sigma-Aldrich	P8920
3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine	Hayashibara Biochemical Laboratories	NK-2703	a kind of thiacyanine dyes
3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt	Hayashibara Biochemical Laboratories	SMP-9	a kind of thiacarobocyanine dyes
Sodium chloride, 99.5%	Wako	191-01665
Dimroth condenser	Iwaki	61-9722-22	perchased from AS ONE
Magnetic stirrer	Corning	DC-420D
Oil bath	Advantech	OS-220
Glass plate	Matsunami	S-1112	Microscope slide
Blower	Hozan	Z-288	Air duster
Liquid blocker pen	Daido Sangyo		LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Objective lens	Olympus	LCPlanFl 60×	NA 0.7
Dark field condenser	Olympus	U-DCD	NA 0.8–0.92
Cooled digital CCD camera	Hamamatsu	ORCA-AG	controlled by software Aqua Cosmos
Software for the cooled digital CCD camera	Hamamatsu	AquaCosmos	used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video
Color CCD camera	ELMO	TNC-C920	not used for analysis
DPSS laser	RGB laser system	NovaPro532-75	λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)
Interference filter	Semrock	LL01-532-12.5
Long pass filter	Semrock	BLP01-532R-25
Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events	home-maid		programmed by C++
Software for the fitting by a power law	LightStone	Origin6.1

참고문헌

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