마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

요약

여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.

초록

인할지 모터 신경은 자 궁 경부 모터 신경 c 3에서 발생 하는 대부분 포유류 종에서 C6 수준. Axonal 예측 인할지 신경 innervating 호흡기 횡 경 막에 수렴. 척수 조각에서 인할지 모터 뉴런 형태학 또는 생 화 확 적인 기준에 다른 모터 신경에서 확인 될 수 없습니다. 우리 쥐, 콜레라 독 소 단위 베타 (CTB)는 fluorophore를 활용의 다음 intrapleural 주사 인할지 모터 신경 셀 시체를 시각화에 대 한 절차의 설명을 제공 합니다. 이 형광 신경 해부학 추적 횡 경 막 신경 근육 학 교차로에서 잡, 인할지 축 삭을 따라 retrogradely 실시 인할지 셀 시체에 도달 하는 기능이 있다. Intrapleural CTB 배달의 두 방법 론 적 접근 비교: transthoracic 주사 대 transdiaphragmatic. 두 방법 모두 성공 하며 인할지 모터 뉴런 CTB 표시 된의 유사한 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 기술은 시각화 또는 다이어 프 램 인할지 회로에 초점을 맞춘 등 다양 한 실험 연구에서 인할지 모터 뉴런 계량에 적용할 수 있습니다.

서문

연구의 목표 마우스 척수 섹션에 인할지 모터 신경 (PhMN)를 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시 하는 것입니다. 흉 막 캐비티에 형광 신경 해부학 추적기의 주입은 횡 경 막에 인할지 신경 근육 학 계획에 도달 하 인할지 축 삭을 따라 역행 전송 인할지 셀 시체를 사용 하 여 전달 방법으로 선정 되었다. Intrapleural 전달의 두 가지 기술을 설명: transthoracic 대 transdiaphragmatic.

인할지 모터 뉴런 누구의 axons 궁극적으로 횡 경 막 자극 인할지 신경으로 수렴 하는 척추 릴레이 셀 있습니다. 이들은 더 낮은 모터 신경 inspiratory 드라이브 안구 호흡기 센터에서 수신 하 고 횡 경 막 신경-근육 접합부 (NMJ) 릴레이. PhMN는 각 hemicord, 중반-자 궁 경부 척추를 따라 실행 한 두 개의 모터 열으로 구성 되어 있습니다. 인간을 포함 한 포유류 종의 대부분, 인할지 모터 열 C6^1,2,3레벨 c 3에서에서 퍼졌다. 우리와 다른 PhMN 쥐와 쥐 척수^4,5,6,,78c 3-c 5 수준에 집중 하는 것을 확인 했습니다. 인할지 셀의 지형 분포 되지 않습니다 무작위로. 모터 뉴런 innervating 횡 경 막의 sternal 부분 crural 부분 innervating 모터 신경은 더 꼬리 (C5)⁹반면 인할지 모터 풀 (C3)의 두개골 부분에 더 조밀 하 게 배포 됩니다. 또한, PhMN 복 부 경적 회색 문제에 각종으로 클러스터링 됩니다. C3 수준 인할지 셀 클러스터 거짓말 측면, 그때 그들은 ventrolateral 방향에서 이동 하 고 ventromedially는 가장 꼬리 레벨^10,11에서 찾을 수 있습니다.

영감 중 그들의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것 건강 한 척수에서 PhMN를 정확 하 게 식별 하지만 또한 퇴행 성 질환 또는 척수의 외상 성 상해 등 병 적인 상태에 있는 동안 그들의 운명에 따라 매우 중요입니다. 때문에 PhMN 차이가 없습니다 형태학 상으로 다른 자 궁 경부 모터 신경에서 PhMN의 주 호흡기 센터⁸또는 격 막 NMJ⁷ 또는 수준에서 신경 해부학 추적기의 대상된 배달에 의존 인할지 신경⁴. 추적 프로그램 신경 섬유에 의해 촬영 및 자 궁 경부 척추에 인할지 셀 시체까지 수행 어디에 직접 또는 간접 검출 시스템을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 역행 또는 참가자 추적기 어원이 같은 말의 광범위 한 범위와 상업적으로 사용할 수 있습니다. 각 추적 부여 없이, 주목할 만한, trans 시 냅 스 추적에 대 한 낮은 또는 높은 능력.

현재 연구에서 우리가 선택 했다 콜레라 독 소 (CTB) 알 렉 사 Fluor 555 (이제부터 CTB fluorophore 라고도 함)와 공업화의 beta 소 단위 형광 라벨으로 냉동된 척수 섹션에 PhMN의 직접적인 시각화 수 있도록. CTB는 실험 데이터는 transneuronal 통로¹²를 표시 하는 경향이 있지만 일반적으로 monosynaptic 추적 프로그램 설명. CTB은 ganglioside GM1 신경 결말의 원형질 막에 바인딩할 수가 있습니다. CTB는 역행 패션^13,14에서 바인딩과 그물에 clathrin-또는-독립적인 메커니즘 및 trans Golgi 네트워크를 통해 트래픽을 통해 내 면. 국제화와 역행 전송 microtubule 네트워크¹⁷에 뿐만 아니라 말라 골격^15,16 에 종속 될 것 같다.

퇴행 성 신경 해부학 추적 프로그램 다이어 프 램 PhMN 회로 라벨로 CTB의 유용성을 입증, CTB fluorophore intrapleurally는 전달 했다. CTB 두 가지 기법을 사용 하 여 관리 했다: 첫 번째 포함는 개복 술과 여러 transdiaphragmatic 주사; 번째, 보다 적게 침략 적, 독특한 transthoracic 주사를 사용합니다. 4 일 후, 붙일 레이블 PhMNs에서 건강에서 그리고 spinally 부상 (C4) 동물에서 경부 척수에 정량 했다.

프로토콜

실험 프로토콜 (2010/63/EU, 86/609/EEC 및 87-848/EEC) 동물 실험에 대 한 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 실시 하 고는 동물 윤리 위원회의 대학의 Namur (윤리 프로젝트 n ° 17-284에 의해 승인 되었다 ). 그림 1 은 2 개의 각각 접근 묘사: transdiaphragmatic 또는 transthoracic 주사. 남성 C57bl/6J 마우스를 사용 하 여 (n = 18), 연구에서 4 개월에서 3 세.

1입니다. CTB 솔루션의 준비

1. Transdiaphragmatic 주사:
   1. 메 마른 물 0.2% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.
   2. 각 마우스에 대 한 연결 된 33-게이지 바늘 (무딘 또는 짧은 경사) 살 균 10-µ L-microsyringe에서 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 7.5 µ L를 로드 합니다.
2. Transthoracic 주입:
   1. 메 마른 물 0.1% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.
   2. 각 마우스에 대 한 베벨된 27 게이지 바늘으로 살 균 500 µ l 인슐린 주사기에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L를 로드 합니다.
      참고: 소 주 하 고 살 균 수를 사용 하 고 제대로 CTB 분말을 용 해 합니다. 솔루션 4 ° C에서 한 달 동안 보관 하실 수 있습니다 (고정 되지 않습니다). 침전 물은 몇 일 후 양식 수 있습니다. 실내 온도에 해결책을 가져오고 사용 하기 전에 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.

2입니다. Intrapleural 주사 전에 준비

1. 고압 또는 유리 비드 소독 기를 사용 하 여 수술 전에 수술 도구를 소독. 깨끗 한 벤치 코트 수술 도구를 처리 하 고 수술을 할 준비.
   참고: 수술 중에 사용 하는 어떤 물자 든 지 살 균 해야 합니다. 악기는 microsyringe 살 균 제 (액체) 닦 여야 한다 또는 같은 살 균 될 수 없는 단일 사용만. 외과 수술의 시작 전에 살 균 제 (액체 스크럽)와 그녀의 손을 씻어 해야 합니다. 외과 의사는 메 마른 장갑, 안 면, 그리고 깨끗 한 가운 착용 해야 한다.
2. 마 취의 적절 한 복용량을 관리 하 고 동물, 무게: 칵테일 마 취의 복 주입 (예: 마 취 제 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg).
3. 발가락을 꼬집어 하거나 마우스 제대로 마 취 여부를 확인 하 십시오 반사의 손실에 대 한 확인 합니다. 각 막을 보호 하기 위해 수 의사 연 고를 적용 합니다.
4. (Transdiaphragmatic 프로시저)에 대 한 복 부 피부 또는 오른쪽 면 흉부 피부 (transthoracic 절차), 전기 헤어 클리퍼 스를 사용 하 여 신중 하 게 면도. 잘 충분히 넓은 방지 하 고 수술 필드에 지 고 머리를 면도.
5. 면도 영역에 10% 요오드 솔루션의 국 소 응용 프로그램에 의해 무 균 상태를 확인 합니다. 주변으로 사이트의 중심에서 스크럽 주의 요오드 솔루션 외과 사이트 스크럽.
6. 수술 내내 homeothermic 패드를 사용 하 여 동물의 체온을 유지 하기 위해.

3. Intrapleural 주사 Transdiaphragmatic 접근을 사용 하 여

1. 생리대에 부정사 위치에 마 취 마우스 내려 놓. 동물의 목 아래 압 연된 거 즈 패드를 놓습니다. 성인 마우스 두께에서 0.5 인치 연된 거 즈 패드를 사용 합니다. 움직임이 있는 경우를 피하기 위해 수술 보드에이 패드를 테이프.
2. 메스 블레이드를 사용 하 여 incise는 중간에 따라 복 부 피부: 피부 긴장 늦추지 수 있도록 다른 한편으로 옆으로 피부를 스트레칭 하는 동안 탯 줄 지역 칼 과정에서 절 개. 내부 장기의 손상을 방지 하려면 블레이드에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.
3. 작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 피부 절 개 주위 복 부 근육에서 분리 합니다. 이 절차는 근육과 피부 수술의 끝에 떨어져 바느질에 도움이 됩니다.
4. 개복 술 작은 위를 사용 하 여 수행 합니다. 수행은 배꼽의 수준에서 buttonhole 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다. 흰색 라인을 따라 복 부 근육을 incise ("교육 알바") 칼 과정까지.
5. 횡 경 막의 복 부 표면, 시각화 하기 위해 상업적 또는 수 제 견인 기를 사용 하 여 복 부 근육을 철회.
   참고: 이러한 견인 기 L-후크¹⁹에 midi 크기 종이 클립에서 만들 수 있습니다.
6. 개복 술, 그리고 벤치 코트를 브래킷으로 아래로 테이프의 양쪽 모두에 밖으로 스트레칭. 횡 경 막의 복 부 표면은 penumbra에 더 이상 시야의 조명 최적화. 이 목적에 대 한 가장 강력한 조명 장치를 통해 광선으로 LED 램프입니다.
7. 한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여, xyphoid 부록을 들어올린 풀 간 (그림 2A)의 측면 돌출부 다운. 다른 한편으로는, 작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 잘라 매 다 인 대, 쓸 개 또는 횡 경 막 (그림 2B) 손상 없이.
8. Xyphoid 부록을 들어올려 한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여. 반면에 해밀턴 주사기를 파악. 중간 및 crural 지역 (그림 3A, 그림 3B에서 삽입 된) 각각 sternal, 커버를 오른쪽 hemidiaphragm에 주입의 3 개 사이트를 대상.
9. 다이어 프 램 두께 쥐⁷약 0.37 m m으로, 호흡 시 폐 방지에 다이어 프 램 시트 넘어 바늘 1 개 이상 또는 2 m m를 삽입 합니다. 각 사이트 (그림 4B)에서 오른쪽 격 막 통해 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 2.5 µ L를 제공 합니다. 횡 경 막의 안정화 필요 하지 않습니다.
10. 주사 (그림 1A)의 3 동측 사이트 및 contralaterally PhMN 풀의 양자 라벨에 대 한이 절차를 반복 합니다.
11. 개복 술 사이트를 닫으려면 resorbable와 복 부 근육을 4-0 봉합 사 봉합. 사용 중단된 바늘 간격으로 3 m m. 주식 피부 상처 9.0 m m 클립 폐쇄. 스테이플 미루어에서 동물을 방지 하기 위해 스테이플 조입니다. 공간에는 약 5 m m 떨어져 스테이플링을 수행합니다. 할 하지 지나치게 조여 상처 클립으로이 장애 치유 이어질 수 있습니다.
12. 막힘을 방지 하기 위해 증류수로 깨끗 한 마이크로 주사기. 천천히 그리고 추방 2-3 번. 주사기로 공기를 그릴 하지 않습니다.

4. Intrapleural 주입 Transthoracic 접근을 사용 하 여

참고:이 방법은 쥐⁴ 에 설명 된 절차에서 영감을 하 고 마우스에 적응 했다.

1. 마 취 마우스 왼쪽 옆 decubitus 위치가 열 패드 (그림 4A)에 누워.
2. 수동 촉진 (그림 4B)에 의해 팔꿈치 영역 아래 여섯 번째와 일곱 번째 갈비뼈를 식별 합니다.
3. 조 수 바로 앞-및 뒷 다리-팔 다리 (그림 5A)를 확장 하는 동안 cranially 중심 및 접선 여섯 번째 또는 일곱 번째 갈비뼈, 3 밀리미터 깊은 (그림 1B 및 그림 5B) 경사와 피부에서 주사기를 삽입 합니다.
4. 부드럽게 흉 강 (그림 5C, 그림 1B에서인세트)에 잘 위치, 갈비뼈를 올려서 확인 하 바늘을 상승 합니다.
5. 가슴 벽에 두 개의 손가락으로 약간의 압력을 적용 하 여 가슴의 움직임을 호흡 안정.
6. 다른 손에 주사기를 들고, 하는 동안 단일 주사에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L을 제공 합니다.

5. 수술 치료

1. 절차 후 즉시 복구에 대 한 homeothermic 패드에서 바로 옆 decubitus 위치에 마우스를 놓는다. 이 흉 막 구멍의 오른쪽에 확산 추적을 보장 하 고 동물의 호흡을 모니터링을 위한 수 있습니다.
2. 살 균 염 분 솔루션 i.p.의 1 mL를 피하 관리 합니다. 동물 나타나면 탈수 또는 무관심 후속 주사를 제공 합니다.
3. Buprenorphine의 0.1 mg/kg 피하 관리 처음 이틀 후 수술, 어떤 잠재적인 통증을 최소화 하는 동안 하루에 두 번.
   참고: 많은 기관 여기 그려져 개복 술과 같은 침략 적인 절차에 대 한 복합 진통을 권하고 싶습니다. 이 비 스테로이드 항 염증 제 (NSAID) 약 절 개 사이트에 로컬 마 취 에이전트의 사용을 포함할 수 있습니다. 이 약물은 일반적으로 바람 통증을 최소화 하기 위해 첫 번째 절 개 전에 전달 됩니다.
4. 동물 안락사까지 매일 모니터링 합니다.

결과

남성 C57bl/6J 마우스 (n = 18), 4 개월에서 3 세 연구에 포함 됐다. 실험의 하루 0, 8 마우스 게시 프로토콜^7,18에 따라 일방적인 C4 타 박상을, 오른쪽 면을 받았다. 가짜 프로시저로 10 쥐 박상 없이 C4 위에 laminectomy를 받았다. 3 일에 쥐 위에서 설명한 두 가지 절차에 따라 CTB fluorophore의 intrapleural 주사에 대 한 준비가 되어 있었다. 7 일에...

토론

성인 쥐의 어떤 긴장 든 지 또는 어떤 실험 패러다임 다이어 프 램 PhMN 회로의 무결성을 평가 해야 되 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 루 경화 증 (ALS) 및 자 궁 경관 척수 상해 (cSCI) PhMN 손실, 인할지 축 삭 및 후속 호흡 타협의 참가자 퇴보와 관련 된 조건들이 있습니다. ALS 또는 cSCI의 동물 모델 histopathological와 기능 호흡 적자 인간의 질병에서 관찰 모방. 이러한 모델에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm