생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

요약

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한 모델

초록

Keratinocytes의 주요 기능 표 피, 유지 하 고 외부 세계에 기계적인 방 벽의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다. 또한, keratinocytes 빠른, 일반적인 방식으로 항 원 자극에 응답 하는 타고 난 면역 체계의 부분이 되 고에 의해 개시, 유지 보수, 그리고 피 면역 반응의 규칙에서 필수적인 역할을 재생 합니다. 우리가 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 셀 칼슘 유도 터미널 차별화, 차별화 마커 involucrin의 증가 식에 의해 측정에 응답 입증 하 고. 또한, 우리는 고립 된 keratinocytes p38 MAPK 통로의 활성화에 의해 측정 된 세포내 신호 통로의 활성화 IL 1β 유도 반응 하 보여줍니다. 함께 찍은, 고립과 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 경작 하는 방법을 설명 합니다. Keratinocytes는 표 피에 우위 한 세포 종류 이기 때문에,이 방법은 피부 생물학 생체 외에서 분자 메커니즘 연구 유용 합니다.

서문

피부는 인체의 가장 큰 장기 이며 외부 환경에 대 한 보호벽 역할. 피부는 두 가지 주요 레이어 구성: 진 피와 표 피, 표 피는 피부의 가장 바깥쪽 레이어를 구성 하는 곳. 표 피에서 가장 풍부한 셀 타입 keratinocytes 셀 대량^1,2의 95% 이상으로 구성 된입니다. Keratinocytes는 표 피에 차별화의 다양 한 단계에서 유지 하 고 차별화³의 특정 단계에 해당 하는 기초, spinous, 세분화, 및 cornified 계층으로 구성 됩니다. Keratinocytes의 기본 기능은 외부 세계에 그대로 배리어를 생산 함으로써 표 피의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다.

Keratinocytes는 또한 피부에 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 대표 하 고 따라서 타고 난 면역 반응^4,5에서 중요 한 역할. 외부 자극에는 keratinocytes의 노출 및 연속적으로, 세포내 신호 통로의 활성화 다양 한 cytokines, 발산, 및 항균 성 펩 티 드를 포함 하 여 다양 한 선 동적인 중개자의 생산 리드. 이러한 keratinocyte 파생 단백질 보충 하 고 활성화 하는 수지상 세포, 호 중구, 특정 T 세포^6,7등 면역 세포 염증 반응에 참가. 따라서, keratinocytes 수많은 생물학 과정에 중요 한 역할을 하 고, 때문에 피부 생물학 공부를 생체 외에서 모델을 생성 하 뒤 여기에 제시 된 기술에 근거가 했다. 신생아 포 피에서 얻은 기본 keratinocyte 문화 자주 피부 생물학^8,9공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 기술을 두 남녀에서 keratinocytes 셀의 높은 생물 다양성의 결과로 얻어진 다.

여기, 선물이 분리와 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 유지 보수를 포함 하 고는 keratinocytes의 동결. 이 방법의 전반적인 목표 생성 기본 인간의 keratinocytes 피부 생물학 생체 외연구 모델로 사용 될 수 있는 것입니다.

프로토콜

건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부 샘플 컬렉션 호스트 기관에서 윤리 위원회 로부터 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 지역 윤리 위원회의 지역 Midtjylland, 덴마크 (M-20110027)에 의해 승인 되었다. 여기에 설명 된 메서드는 Maciaq 그 외 여러분 에 의해 비슷한 연구에서 파생 된 ¹⁰ 그리고 Liu와 Karasek¹¹.

1입니다. 인간의 피부에서 Keratinocytes의 격리

1. 다음과 같은 솔루션을 제작 하 여 시작: DPBS에 0.25 %trypsin 및 0.1% 포도 당 50ml 솔루션. 믹스와 필터 소독 (0.2 µ m) 솔루션. RPMI-1640 + 2 %FBS 솔루션, DPBS 및 keratinocyte 혈 청 무료 매체 (KSFM)의 50 mL의 10 mL를 준비 합니다. KSFM의 500 ml KSFM 보충 및 gentamycin의 250 µ L를 추가 합니다. 미리 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C.
2. 건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부를 수집 합니다. 피부 샘플 사용 하지만 약 10 cm x 15 cm, 크기에서 다를 수 있습니다. 냉각 요소를 포함 하는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 운반 하 여 교통 아래 피부 차가운 유지. 필요한 경우, 피부 샘플 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 하룻밤.
3. 소독, scalpels가 위와 집게를 사용 하 여 피부 섹션 아래에서 지방을 제거.
4. 바늘을 사용 하 여 접시 위에 무 균 커버에 피부 섹션 (약 10 cm x 15 cm) 버클. 첫째, 건조 멸 균된 거 즈 패드와 함께 피부를 청소. 다음 70% 에탄올으로 소독된 거 즈 패드를 사용 하 여 피부를 청소.
5. 발 평면을 사용 하 여, 피부 섹션의 상위 계층 (표 피)의 잘라 고 9 cm 배양 접시에에서 넣어. 다음, 즉시 페 트리 접시 (단계 1.1에서에서 준비) DPBS/트립 신/포도 당 솔루션의 25 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
6. 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에서 DPBS/트립 신/포도 당 솔루션을 제거 하 고 RPMI 1640 + 2 %FBS 트립 신을 비활성화에 10 mL을 추가.
7. 두 개의 집게를 사용 하 여, 지금 분리 상피 세포 매체에 부드럽게 된다고 하 고는 표 피와 피부 부분의 피부 구획을 교 반 하십시오.
8. 표 피 세포 현 탁 액 (1 m m 구멍 크기), 금속 필터를 통해 필터링을 50 mL 튜브에 수집 합니다. FBS와 소용돌이 없이 RPMI-1640의 10 mL를 포함 하는 포함 하는 표 피 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 금속을 통해 서 스 펜 션 필터의 s. 필터 10 개 50 mL 튜브에 나머지 피부 섹션을 추가 합니다. 50 mL의 총 볼륨 DPBS를 추가 합니다.
9. 셀 서 스 펜 션 실내 온도에 450 x g에서 10 분 원심
10. 상쾌한을 제거 하 고 37 ° C KSFM 셀 펠 릿의 크기에 따라 약 10 mL에 상피 세포 pellet을 resuspend. Trypan 블루 얼룩 현미경 메서드를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10 cm x 15 cm 피부 단면도에서 얻은 세포 수는 약 50-100 x 10⁶ 세포입니다. 각 75 cm² 문화 플라스 크를 37 ° C KSFM의 12 mL와 8 x 10⁶ 셀을 전송 합니다. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 flasks 흔들.
11. Keratinocytes 100% 습도 및 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 품 어. 2 일 후에 세 번 매주 매체를 변경 합니다. 문화는 keratinocytes의 확산 속도 따라 약 2 주 후 70-80% 합칠 때 세포를 통과.

2. 뿌리고 Keratinocytes의

1. 인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 4.5 mL를 사용 하 여 75 cm² 문화 플라스 크에 대 한.
2. 매체는 셀에서 제거 하 고 4.5 mL/75 cm² 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.
3. 셀의 약 50%는 느슨하게 하면 부드럽게 손 풀고 나머지 셀에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 75 cm² 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 6 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 키를 누릅니다.
4. 린스 RPMI 1640 + 2%의 3 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 실내 온도에 450 x g에서 10 분에 대 한 셀 원심
   1. KSFM (37 ° C) 10 mL에 수송과 셀 resuspend 셀을 계산 하 고 KSFM (37 ° C)의 20 mL와 150 cm² 문화 플라스 크에 3 x 10⁶ 셀을 전송. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 플라스 크를 흔들어. 문화는 (냉동 프로토콜 아래 섹션 3 참조) keratinocytes의 확산 속도 따라 약 4-6 일 소요 80-90% 합칠 때 셀을 고정 합니다. 적절 한 냉동된 주식을 생성 하 keratinocytes를 확장 합니다.

3입니다. 동결 Keratinocytes의

1. 인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 9 mL를 사용 하 여 150 cm² 문화 플라스 크에 대 한.
2. 매체는 셀에서 제거 하 고 9 mL/150 cm² 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.
3. 셀의 약 50%는 느슨하게 하면 나머지를 완화 하기 위해 부드럽게 손에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 150 cm² 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 12 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 발음 키를 누릅니다.
4. 린스 RPMI 1640 + 2%의 6 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 4 ° c.에 450 x g에서 10 분 동안 관을 원심 매체 (KSFM + 10 %DMSO) 얼어 얼음 처럼 차가운 셀을 준비 합니다.
5. Resuspend KSFM + 10 %DMSO 셀 펠 릿, 셀, 및 표준 느린 냉동 cryopreservation 방법¹²를 사용 하 여 6 x 10⁶ 셀/mL의 농도에서 세포를 동결.
6. 사용할 준비가 될 때까지 액체 질소 (기상) keratinocytes를 저장 합니다.

4. 해빙과 동결된 Keratinocytes 경작

1. 빠르게 녹여 37 ° C 물 욕조에 적절 한 냉동된 튜브. 70% 에탄올을 사용 하 여는 cryovial의 외부를 청소. 문화 플라스 크에 세포 (약 15, 000 셀/cm²)의 적절 한 번호를 전송 하 고 즉시 문화 플라스 크를 미리 데워 진된 성장 매체 (KSFM)를 추가 합니다.
   문화 플라스 크의 어떤 크기 든 지 실험의 설정에 따라 사용할 수 있습니다.
2. 5 mL 문화 매체를 사용 하 여 25 cm² 문화 플라스 크에 대 한.

셀 수 추가 문화 플라스 크는 세포의 성장을 기증자 기증자에서 다르기 때문에 다를 수 있습니다. 셀 100% 습도 및 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 품 어.

변경 후 2 일 매체 세 번 매주 신선한 미리 데워 진된 KSFM을 사용 하 여.
참고: 데이터 평균 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 분리 하는 세포의 95%는 keratinocyte 마커 cytokeratine-14¹³에 대 한 긍정적인 것을 증명 하고있다.

결과

칼슘 유도 터미널 차별화
인간의 keratinocytes 칼슘^14,,1516치료 시 터미널 차별화를 받 다. 기본 인간 keratinocytes 고립 되었고 위의 프로토콜에 설명 된 대로 양식. 때 약 50-60% 합칠 셀 칼슘 (1.2 m m) 자극 했다 또는 0, 1 및 2 일에 차량 및 셀의 사진을 찍은. 그림 1 에서는 칼슘 자극 시 관찰 keratinocyt...

토론

여기, 우리가 쉽게 기본 인간의 keratinocytes 성인 피부에서 분리 하는 방법과 생체 외에서문화를 설명 합니다. 이 모델의 표 피 세포 생물학, 조사에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 가질 수 있으며 연구자 피부 질병을 공부에 관심이 더 유용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 프로토콜의 장점 중 일부입니다 keratinocytes 신생아 남성 할례를 받고에서 얻은 신생아 포 피에서 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	Cell culture medium
KSFM supplements	ThermoFisher Scientific	37000-015	Supplements for KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Dimethyl sulfoxid
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15710-049	Cell culture medium additive
Sterilization filter	Sartorius	16534	Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin	Sigma-Aldrich	T7409	Used to trypsinize cells
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	Used to inactivate trypsin
Forceps	-	-	Forceps from any company can be used
Scissors	-	-	Scissors from any company can be used
Scalpel	Swann Morton	0501	Scalpels from any company can be used
70% ethanol	-	-	-
Gauze pads	NOBAMED	875420	Gauze pads from any provider can be used
Foot planer	Credo Solingen	1510	Foot planer from any provider can be used
Petri dishes	TPP	93100	Petri dishes from any provider can be used
Metal filter	-	-	In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks	NUNC	156499	-
150 cm2 culture flasks	TTP	90151	-
0.05% Trypsin-EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300-062	Used to trypsinize cells when passaging