전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

요약

인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.

초록

Histocultures 허용 인간의 조직 내에서 세포 상호 작용을 공부 하 고 그들은 통제 된 실험실 조건에서 모델 호스트 병원 체 상호 작용을 채택 될 수 있다. 인간의 조직 중 다른 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 ex vivo 효능 및 항 바이러스 약물의 독성을 테스트 플랫폼으로 초기 질병 병 인, 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 현재 프로토콜에서 우리가 처리와 에이즈-1 조직 explants 인간의 편도 및 자 궁 경부 거칠어, 감염 약 2 주 동안 액체 공기 인터페이스에 젤라틴 스폰지 위에 문화에서 그들을 유지 하는 방법을 설명 합니다. 이 아닌-편광 culture 설정 조직의 무결성과 기능적 아키텍처의 진보적인 손실의 주요 제한 남아 있지만 문화 매체에 산소, 영양소에 대 한 액세스를 극대화 합니다. 이 메서드는 hiv-1 복제 및 병 인 immunoassays, cytometry, 정량, 등 여러 가지 기술을 사용 하 여 모니터링을 수 있습니다. 중요성, 생리 변화 같은 표본의 다른 지역에서 explants 사이 에서도 조직 기증자, 사이의 실험 결과 영향을 크게 수 있습니다. 결과 재현성을 보장 하기 위해, 그것은 중요 explants, 기술 복제, 조건과 일치 하는 기증자 컨트롤의 적절 한 번호를 사용 하 여 여러 실험에서 데이터를 컴파일할 때 실험적 치료의 결과 정규화 (즉, ., 다른 기증자에서 직물을 사용 하 여 실시) 통계 분석을 위해.

서문

여기 언급으로 종래의 monotypic bi 차원 세포 배양 조직을 구성 하는 세포 유형의 큰 다양성 및 기관 간의 공간 및 기능 통신에 대 한 계정을 하지 않습니다. 이 점은 질병의 실험 모델에 대 한 파라마운트 중요성의 방해가 homeostatic 세포 상호 작용은 모든 병 리의 운전 요인. 조직 explants 그들은 vivo에서, 비록 제한 된 양의 시간¹대는 cytoarchitecture와 기관의 많은 중요 한 기능적 측면을 유지 하기 때문에 건강 및 인 간에 있는 질병을 모델링 하기 위한 주요 이점을 제공 합니다. 예를 들어 디프테리아 사망 toxoid 등 파상풍 사망 toxoid, 회 항으로 비보 전 도전 시 편도 선 조직 항 원 특정 항 체²의 활발 한 생산 응답합니다. 어떤 다른 비보 전 모델 처럼, histoculture는 그것의 자신의 제한이: 간 기증자, 조직 분극, 제한 된 조직 생존, 변화와 confocal 현미경 검사 법¹의 깊이 넘어 셀 모니터링에 어려움. 그럼에도 불구 하 고, 인간의 조직 explants 호스트 병원 체 상호 작용 및 잠재적인 치료 내정간섭³를 포함 하 여 인간에서 항상성 및 병원 성 면역 과정을 공부 하는 선택의 모델을 남아 있다.

에이즈-1 병의 중요 한 이벤트는 조직에서 자리를 차지할. 생식 기 점 막의 감염 모든 hiv-1 전송 이벤트 전세계⁴의 대부분을 차지 한다. 림프 조직 급성 감염 시 바이러스 복제의 주요 사이트 latently 감염 세포⁵의 뜻깊은 수영장을 비호 하 고 그들의 지 속성 치료⁶을 달성 하기 위해 주요 장애물을 나타냅니다. 인간 림프 및 점 막 조직의 문화 및 비보 전 도전 에이즈-1의 연구에 대 한 격리 된 세포에 따라 기존의 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 예를 들어, 조직 상주 세포 주변 혈액 단 셀¹반대로 exogenous 활성화의 부재에 에이즈-1 감염을 지원할 수 있습니다. 림프 조직 explants의 사용 기본 CD4 T 세포 소모즉, 방관자 효과⁷, 급성 감염의 특징은 몇 가지 주요 메커니즘의 더 나은 이해를 허용 했다. 림프 조직⁸ 여 포 B 셀 등 여성 생식 기 점 막 explants⁹ 상피 구조의 보전이이 사이트에서 에이즈-1 감염의 공간 및 기능 기능을 통합 독특한 기회를 제공 합니다. Antiretrovirals 및 multitarget microbicides^12, 의 전 임상 시험에 대 한 뿐만 아니라 모델을 연구 및 herpesvirus 공동 감염^10,11, histocultures 성공적으로 사용 되었다 마지막으로, ^{13 , 14 , 15}.

여기, 편도 선 및 낮은 여성의 성 기 요로 (자 궁 경부)에서 점 막 조직에서 얻은 인간 조직 explants의 문화에 대 한 자세한 프로토콜 덮고 비 편광 방식으로 에이즈-1 도전 explant를 조직 해 부 설명 합니다. 문화 지원, 젤라틴 스폰지를 사용 하 여 액체 공기 인터페이스에서 조직 explants의 모세 혈관, 따라서 그들의 자연적인 감퇴를 지연 스폰지를 통해 문화 매체 영양소에 대 한 액세스를 제공 하면서 산소를 공기에 노출을 극대화 합니다. Hiv-1 복제를 평가 하는 우리의 시스템에 가장 즉각적인 방법은 immunoassay 또는 정량 시간이 지남에 explant 문화 매체에 발표 하는 바이러스의 양을 측정 하는 것입니다. 에이즈-1 감염 및 병 인 (예., CD4 T 세포 소모) cytometry 여 조직 explants 대량 RNA/DNA 추출 및 정량, 제자리에서 얼룩, 또는 조직 소화 시 단일 세포 분석 평가할 수 있습니다.

프로토콜

인간의 조직의 컬렉션에 대 한 프로토콜 로컬 관할 당국에 의해 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다. 편도 선 수술, 자 군 절제 등 지정 된 수술의 경우는 표본은 연구 목적을 위해 특별히 수집 하 고 연구에 여겨진다 인간 대상 연구 (건강의 국가 학회. 인간 주제에 연구입니다. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11)입니다. 그러나, 조직 기증자 개인 및 의료 데이터를 가져오기 (예., 성별, 나이, 현재 약물 사용, 감염 등의 역사)를 해석 하는 실험 결과 동의 해야 하는 개인 정보 보호에 대 한 포즈 우려 도움이 될 수 있습니다 조직 컬렉션에 대 한 프로토콜에서 해결.

주의: 전체 프로시저가 수행 되어야 합니다 밖으로 생물 안전 캐비닛에. '건강 한' 개인에서 그들을 포함 하 여 모든 인간의 표본, 전염 성 요원을 항구 수 있습니다. 연산자는 실험 HIV의 사용을 포함 하지 않는 경우에 안전 하 게 처리 조직 표본, 혈액을 매개로 병원 체와 함께 작동 하도록 훈련을 받아야 한다. 조직 해 부 및 hiv 감염의 절차의 위험 평가 연산자 및 동료의 안전을 보장 하기 위해 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 합니다. HIV 감염의 사용 국가 유해 체액 및 혈액을 매개로 병원 균 연구소 관련 규정에 따라 전용된 biosafety 수준 2 또는 3 환경을 필요합니다.

1입니다. 젤라틴 스폰지의 준비

참고: 비록 그것이 엄격 하 게 조직 해 부 하기 전에 젤라틴 스폰지를 준비 하는 데 필요한, 그것은 더 편리 조직의 또는 많은 기증자에서 큰 금액을 처리 하는 경우에 특히, 여기에 설명 된 순서에 따라.

1. 문화 매체 (CM)를 준비 하 고 항생제 솔루션 (Tircacillin-clavulanate 믹스) CMT (자료 테이블)을 사용 하기 전에 그것을 보충. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다.
   참고: Ticarcillin 및 CMT에서 clavulanate 제대로 안정 있습니다. 필요한 경우, 다시 보충 CMT 항생제 솔루션 준비에서 약 24 시간 후. 매체 마다 24 h 동안 문화 explant을 항생제 솔루션을 추가 하는 필요 하지 않습니다.
2. CMT의 약 20-30 mL로 100 m m x 20 mm 페 트리 접시를 채우십시오.
   참고:이 설정은 최적의 시간에 두 6-잘 접시 또는 한 12-잘 접시에 대 한 충분 한 젤라틴 스폰지를 준비 하는. 많은 접시 필요한 경우 속도 준비를 더 넓은 샬레와 큰 CMT 볼륨을 사용 합니다.
3. 소독 집게를 사용 하 여 배양 접시에 젤라틴 sponge(s)를 전송 합니다. 양쪽에 스폰지를 젖은 고 1 분 살 균 주걱을 사용 하 여 약 2 분 페 트리 접시의 바닥에 스폰지를 눌러에 대 한 매체를 흡수 하기 위해 스폰지.
   참고:이 단계는 중요 한 중요성의 때문 스펀지에서 공기 방울의 존재는 문화 매체 영양소는 조직에 도달 하는 모세 혈관 차단입니다. 젤라틴 스폰지는 탈수 때 매우 취 성. 부드럽게 아래로 눌러 스폰지에 처음 특히 주걱으로 스폰지를 위반을 피하기 위해.
4. 약 1 c m²의 동일한 크기의 조각으로 rehydrated 젤라틴 스폰지를 잘라 사용 무 균가 위. 1 스폰지 조각 문화 접시의 각 음에 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 12-잘 접시 (경부)에 각 음 6 잘 플레이트 (편도)의 그리고 잘 당 1 mL에 CMT의 3-4 mL를 추가 합니다. 조직 explants는 스폰지에 로드할 준비가 될 때까지 37 ° C, 5% CO₂, ≥ 90% 습도 설정 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
   참고: 접시에 추가 하는 CMT의 볼륨 explants는 액체-공기 인터페이스에서 유지 하는 스폰지의 두께를 조정 한다.

2입니다. 인간의 편도 선 조직의 해 부

참고: 편도 해야 처리, 수술 후 즉시 이상적으로 수술 당일. 또는, 표본 남아 있을 수 있습니다 하룻밤에 잠긴된 CMT 4 ° c.에

1. CM 수 있도록 충분 한 시간을 실 온 (RT)에 도달 하거나 물 욕조에 넣어 37 ° c.에 미리 예 열 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 남은 모든 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 포 셉, 메스 해 부 절차 동안 필요할 때마다을 깨끗 한 용기에 70% 에탄올 용액을 붓는 다. 도구를 청소 하 고 다른 기증자 로부터 표본 해 사이 메스 블레이드를 변경.
2. 소독 집게를 사용 하 여 CMT의 10-20 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 편도 운송 컨테이너에서 전송.
   참고: 멎, 피 묻은, 광범위 한 분야와 표본 또는 괴 사 성 조직 폐기 해야한다.
3. 절단 표면으로 페 트리 접시의 뚜껑을 사용 하 여 조직 해 부. 집게와 조직을 부드럽게 잡고, 살 균 메스와 블레이드를 사용 하 여 여러 큰 조각으로 각 편도 선 잘라.
   주의: 처리 날카로운 도구를 인간의 표본을 해 부 부상 및 오염 위험을 증가. 연산자 추가 보호로 금속, 메쉬, 절단 방지 장갑 착용을 고려해 야 합니다.
4. 제거, 피 묻은, 멎 고 섬유질 조직, 그리고 모든 부품 및/또는 녹색 갈색 색상으로 사용 하 여 집게 메스 tonsilloliths (석 회 질된 물질)을 포함 하.
   참고: 조직에의 한 조각에 대 한 작업, 그것은 조직의 건조를 피하기 위해 중간에 빠져들 조직의 나머지를 유지 하는 것이 중요.
5. 두께에서 약 2 m m의 조각으로 각 조직 조각을 잘라. 이전 단계에서 모든 원치 않는 부분을 제거 합니다. 2 m m 두께 스트립에 조직 조각을 잘라. 2 m m 두꺼운 블록으로 조직 스트립을 잘라. 이 약 8 m m³의 조직 explants 될 해야 합니다.
6. 해 부와 함께 진행 하는 동안 조직의 건조를 피하기 위해 CMT의 10-20 mL를 포함 새로운 100 mm 페 트리 접시에는 explants 전송. 해 부의 끝에, 무작위로 explant 분포 접시를 소용돌이 친다. 장소 9 조직 explants 그들 사이 공간이 집게를 사용 하 여 6 잘 플레이트에 각 젤라틴 스폰지 위에. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
   참고: 일반적으로, explants 교양 하룻밤와 에이즈-1 문화의 접종 다음 날 수행 됩니다. 이것은 세균 이나 곰 팡이 오염 없이 문화에서 개발 다는 것을 확인 하입니다. 또한, 세포는 절 개 후 편도 선 조직 explants 탈출구 경향이 있다. 이 과정은 크게 문화¹의 첫 24 시간 이내 완료 됩니다.
7. 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.

3. 편도 선 조직 감염 Explants 에이즈-1

참고: 독립적인 실험 사이의 결과 변화를 줄이기 위해, 동일한 바이러스 준비 전체 연구를 위해 사용 될 해야 합니다. 것 활성화 된 주변 혈액 단 세포에 바이러스를 전파 수 고 표면에 뜨는 문화 반복 중지 및 재개 (자료 테이블)을 피하기 위해 aliquoted-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.

1. 37 ° c.에 미리 예 열 물 욕조에 CM을 넣어 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다.
2. 피 펫과 6-잘 plate(s)에 매체를 발음 하 고 살 균 제 솔루션 컨테이너에서 삭제. 접시를 기울기와 잘 수 있도록 하단에 수집 하 고 발음 그것을 버리고 중간의 위쪽 부분에 젤라틴 스폰지를 부드럽게 밀어. 각 우물에 CMT의 3-4 mL를 추가 합니다.
3. 37 ° c.에 물 목욕에 있는 에이즈-1 바이러스 준비를 녹여 필요한 경우, CM (표 1)와 함께 바이러스 재고 희석.
   참고: 선택한 inoculum 5-8 µ L (표 1)의 볼륨에 포함 된 있도록 바이러스 주식 희석 수 한다. 효율적인 감염, 그것은 녹고 HIV-1 준비와 조직 explants 감염 사이 필요한 최소 시간을 사용 하 여 중요 한.
4. 바로 위에 젤라틴 스펀지에 9 explants의 각 바이러스 inoculum 플라스틱 감염이 완료 되 자 마자 인큐베이터에는 plate(s)를 반환 합니다. 모든 잔여 바이러스 준비를 삭제 합니다. 섹션 5를 계속 합니다.
   참고: 정확 하 게 제공 바이러스 inoculum 연산자를 고려해 야 역방향 pipetting 기술을 사용 하 여 모든 음에 대 한 팁을 변경 합니다. 이 피 펫 피스톤 지우기 위치 (두 번째 정류장)를 바이러스 inoculum, 아래로 밀어 포함 하 고 작은 반복된 샘플링 연관 거품 형성을 최소화 하 고 오류 inoculum을 전달 하기 위해 첫 번째 정류장에 추진 볼륨, 즉, 5-8 µ L.

4. 해 부 및 자 궁 경부 점 막의 감염

참고: 최적의 결과 위해 자 궁 경부 거칠어 explants 해야 처리 되며 이상적으로 수술 당일 수술 후 가능한 한 빨리 감염. 또는, 표본 저장할 수 있습니다 하룻밤, 4 ° C에서 CMT에 잠수 하 고 감염 된 절 개 후 즉시.

1. CM 수 있도록 충분 한 시간을 RT에 도달 하거나 물 욕조에 넣어 37 ° c.에 미리 예 열 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 집게와 메스 해 부 절차 동안 필요할 때마다을 깨끗 한 용기에 70% 에탄올 용액을 붓는 다. 도구를 청소 하 고 해 여러 기증자 로부터 표본 사이 메스 블레이드를 변경.
2. 소독 집게를 사용 하 여 전송할 샘플 운송 컨테이너에서 100 mm 페 트리 접시 CMT의 10-20 mL를 포함 하.
3. 절단 표면으로 페 트리 접시의 뚜껑을 사용 하 여 조직의 해 부. 집게, 조직 부드럽게 개최 ectocervix endocervix의 점 막 stromal 밑에서 고 점 막의 근육 조직 (submucosa) 메스와 블레이드를 제거 합니다.
   참고: 조직에의 한 조각에 대 한 작업, 그것은 조직의 건조를 피하기 위해 중간에 빠져들 조직의 나머지를 유지 하는 것이 중요.
4. 점 막 2 m m 넓은 스트립으로 잘라 제거 하 고 조직의 단지 2 m m 두꺼운 층을 떠나 가능한 많은 submucosa 삭제. 2 m m 두꺼운 블록으로 스트립을 잘라. 이 약 8 m m³의 조직 explants 될 해야 합니다.
   주의: 처리 날카로운 도구를 인간의 표본을 해 부 부상 및 오염 위험을 증가. 연산자 추가 보호로 금속, 메쉬, 절단 방지 장갑 착용을 고려해 야 합니다.
5. 해 부와 함께 진행 하는 동안 조직의 건조를 피하기 위해 CMT의 10-20 mL를 포함 새로운 100 mm 페 트리 접시에 전송 조직 explants. 해 부의 끝에, 무작위로 explant 분포 접시를 소용돌이 친다.
6. 살 균 겸 살 균 1.5 mL 원뿔 tube(s) (관 당 최대 16 explants)으로 explants 전송할. 피 펫을 사용 하 여 튜브에 모든 매체를 제거 합니다.
7. 37 ° c.에 물 목욕에 있는 에이즈-1 준비 해 동 필요한 경우는 explants 포함 된 tube(s)에 CM. 전송 바이러스 바이러스 재고 희석. 모든 잔여 바이러스 준비를 삭제 합니다.
   참고: 선택한 inoculum 최소 0.5 mL (표 1)의 볼륨에 포함 된 있도록 바이러스 주식 희석 수 한다. 독립적인 실험 사이의 결과 변화를 줄이기 위해, 동일한 바이러스 준비는 전체 연구 (자료 테이블)에 사용 되어야 한다.
8. 온도-통에 튜브를 전송 및 300 rpm에서 락 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어. 부드럽게 튜브 몇 매 30-60 분 번 반전.
   참고: 효율적인 감염, 그것은 녹고 HIV-1 준비 하 고 37 ° c.를 튜브를 전송 사이 필요한 최소 시간을 사용 하 여 중요 한
9. 3-4 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 당로 6-잘 접시를 채우십시오. 에 있는 에이즈-1 보육의 살 균 제 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 컨테이너에는 tube(s)에서 모든 바이러스 준비 취소. 6 잘 플레이트 집게를 사용 하 여 PBS를 포함 하는 explants 전송할.
10. RT, 1 분에 대 한 PBS에 나머지 explants 허용 하 고 다음 그들을 씻어 부드럽게 pipetting으로 위아래 PBS 우물에 2-3 번. 살 균 제 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 컨테이너에 PBS를 삭제 합니다. 각 우물에 새로운 PBS의 3-4 mL를 추가 합니다. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 바로 조직의 건조를 피하기 위해 스폰지는 explants 전송 전에 PBS를 삭제 합니다.
    참고: Explants 특정 endocervix, 그리고 자 궁 경부 점 막의 감염 시 점액의 큰 금액을 놓습니다. 그것은 씻어 explants 및 문화 상쾌한에 바이러스의 후속 릴리스 난다 보존 바이러스 복제를 마스크 수 있기 때문에 가능한 많은 점액을 제거 하는 중요 한.
11. 12-잘 접시에 각 젤라틴 스폰지 위에 5-8 explants 전송 집게를 사용 하 여. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
12. 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.

5입니다. Histoculture

1. 감염 된 후 12-15 날까지 감염의 시간에서 출발 3 일 마다 CM 변경 합니다. CM 및 explants는 다른 매개 변수 중 hiv-1 복제를 평가 하기 위해 문화 시간에 걸쳐 정기적으로 샘플링할 수 있다.
2. 37 ° c.에 미리 예 열 물 욕조에 CM을 넣어
   참고: 그것은이 단계에서 항생제 솔루션 CM을 보완 하기 위해 필요 하지 않습니다.
3. 피 펫와 CM의 샘플을 수집 하 고 살 균 1.5 또는 2 mL 나사 모자 tube(s)-80 ° c.에 저장용으로 전송
   참고: 복제 우물에서 CM 컬렉션에서 풀링됩니다.
4. 소독 집게와 조직 explants 수확 (옵션), 종이에 그들을 배치 하 여 explants에 초과 매체를 제거 하 고 explants 살 균 1.5 또는 2 mL 나사 모자 tube(s)로 전송. 처리 하거나 실험에 의해 필요에 따라 조직 샘플을 저장 합니다.
   참고: cytometry, 위해 explants는 즉시 소화 (자세한 내용은 참조 하십시오 참조 1, 9, 16, 및 17)에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 효소 칵테일으로. RNA 추출 explants-80 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 하룻밤 4 ° C에서 RNA 안정화 솔루션에 유지 됩니다. DNA 추출 또는 제자리에 (자 궁 경부) 얼룩, explants 스냅-액체 질소 나 드라이 아이스/에탄올 슬러리에 냉동 고 수-80 ° c.에 저장 또는 편도 선 explants는 제자리에 얼룩에 대 한 PBS와 4 %paraformaldehyde 해결책에 있는 침수에 의해 해결할 수 있습니다.
5. 잔여 CM에는 피 펫을 잘 발음 하 고 살 균 제 솔루션 컨테이너에 그것을 폐기. 접시를 기울기 고 하단, 수집 매체 수 있도록 우물의 상단 부분에 젤라틴 스폰지를 부드럽게 밀어 고 발음 그것을 폐기.
6. 각 우물에 CM의 3-4 mL를 추가 합니다. 소독 집게를 사용 하 여 어떤 조직 explants는 젤라틴 스폰지를 중간에 반환 합니다. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
7. 문화의 끝에, 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.

결과

조직 explants에서 hiv-1 복제를 평가 하기 위해 몇 가지 기법을 사용할 수 있습니다. 우리의 표준 읽어 에이즈-1 p24_{개 그} immunoassay¹⁸시간이 지남에 cm에서 발표의 양을 측정 하는 것입니다.

같은 HIV-1 재고의 동일한 inoculum 감염 다른 기증자 로부터 조직 explants는 다른 양의 바이러스 (표 1)를 얻?...

토론

인간의 조직 사용 explants 에이즈-1 감염의 연구는 전통적인 bi 차원 및 monotypic 실험 시스템 1 차 셀 또는 셀 라인, 세포 상호 작용 재현 하 그들의 뛰어난 능력 때문에 이점을 제공 하 고 휴대 기능 vivo에서그들은 (예를 들어, cytokine 생산). 그럼에도 불구 하 고, 편도 선 및 자 궁 경부 조직 수, 및 HIV 대상 셀^1,16의 phenotypic와 기능적 특성 등 여러 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge	Pfizer	NDC:  0009-0315-08	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge	Ferrosan Medical Devices	MS0002	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine	ThermoFisher Scientific	21875034	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)	ThermoFisher Scientific	11140035	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)	ThermoFisher Scientific	11360070	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)	ThermoFisher Scientific	15750037	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)	ThermoFisher Scientific	15290018	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)			To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate	Sigma-Aldrich	33454-100MG	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red			To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL	NIH AIDS Reagent Program	510	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04	NIH AIDS Reagent Program	2522	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC)	NIH AIDS Reagent Program	8146	Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm