마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리

요약

이 문서의 목적은 마우스에서 다른 흰색 adipose 조직 수집, 지방 샘플 처리 RNA를 추출 하는 단계별 절차를 제시 하는 것입니다.

초록

다른 조직에 비해, 백색 지방 조직 있으므로 주로 지질 상당히 적은 RNA와 단백질 콘텐츠를 실시간 PCR 및 서쪽 오 점, 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 있다. 추가 단계는이 지질을 방지 하는 데 필요한 지방 조직 샘플에서 RNA 절연은 또한 도전 이다. 여기, 우리 3 해부학 다른 흰색 adipose 조직 생쥐, 이러한 샘플을 처리 하 고 RNA 격리 수행에서 수집 하는 절차를 제시. 우리는 더 실시간 PCR를 사용 하 여 cDNA 그리고 유전자 식 실험의 합성을 설명 합니다. 이로써 설명된 프로토콜에서 동물의 머리와 지방 패드 교차 오염을 조직 수집 하는 동안 다른 지방 패드 사이 혈액 오염의 감소 수 있습니다. 그것은 또한 적절 한 수량 및 RNA 추출의 품질을 보장 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 지방 조직 샘플은 실시간 PCR 등 일상적인 실험에 필요한 모든 마우스 모델에 널리 적용 될 수 있지만 기본 adipocytes 세포 배양에서 격리에 적합 하지 않습니다.

서문

비만 타입-2 당뇨병¹등 합병증으로 이어질 수 있는 전 세계적으로 유행 하는. 다이어트 유발 된 비만 유전자 변형 동물 모델에 비만 관련 된 합병증의 연구 자주 사용 됩니다. 전통적으로, 백색 지방 조직 초과 에너지를 위한 저장 격실으로 알려져 있다 이며 주로 지질 구성 된 갈색 지방 조직 열^2,3로 에너지를 변환 하는 동안. 지방 조직 동적 확장 하 고 음식 섭취 량과 신체 활동 등 많은 요인에 따라 축소 됩니다. 따라서, 이러한 변화에 기여 요인 결정, 적절 한 지방 조직 수집 및 처리는 필요⁴.

가운데 흰색 adipose 조직, 그것 일반적으로 피하와 내장 지방 저장소 해부학 지역화 등 다른 속성 있고,^2,5기능 허용 됩니다. 따라서, 충돌 하는 결과 또는 큰 변화를 방지 하려면 주의 지방 패드를 수집 하는 때이 다른 지방 저장소 간의 교차 오염을 방지로 이동 해야 합니다.

또한, RNA 또는 단백질 흰 쥐의 지방 조직에서 분리 하는 경우 세 가지 주요 과제 있다. 첫째, 비만 쥐에서 지방 패드를 수집 하지 않습니다 쉬운 일 다른 백색 지방 창 고를 분리 하는 테두리는 항상 명확 하 고, 신장과 심장⁶등 다른 장기와 달리. 둘째, 지방 조직, RNA 또는 단백질 격리 중의 높은 지질 내용 때문에 지질 층 위에 수레 하 고 샘플에 대 한 직접 액세스를 방지. 셋째, 갈색 지방이 많은 직물, 또는 다른 조직, 반대로 백색 지방 조직 내용이 상당히 낮은 RNA와 단백질 및이 젊은 마우스를 사용할 때 주요 관심사의, 쥐 먹이 정상 (N) 다이어트 이며 쥐 것으로 예상 된다 낮은 뚱뚱한 질량 (즉 코 모델, 치료 약물, 운동 훈련, 등.) ^{7 , 8}.

따라서, 지방 조직에서 RNA를 분리 하는 적절 한 방법을 선택이 중요 합니다. 페 놀/클로 프롬 추출 대체 방법을 상용 키트 있습니다. 그들은 일반적으로 RNA 정화 열⁹에 따라 초기 페 놀 추출 단계를 기반으로 합니다. 그러나, 그 키트는 일반적으로 더 비싼 및 샘플 낮은 수율의 RNA 품질 변수 수도 주지만 적은 시간이 소요 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 페 놀 솔루션/클로 프롬 추출에 가장 큰 장점 중 하나는 RNA, DNA, 그리고 단일 샘플¹⁰에서 단백질 분리의 가능성입니다. 쥐 지방 패드는 일반적으로 작은 있기 때문에 (특히 상체 마우스 모델)에서 RNA와 단백질의 소량을 주고, 이러한 프로토콜 작은 샘플에서 얻을 수 있는 데이터를 극대화 합니다.

이 문서의 목적은 3 쥐 백색 지방 조직 창 고 수량 및 RNA 격리의 품질에서 적절 한 샘플 컬렉션을 확인 하는 방법을 자세히 설명 하기 위해. 이 프로토콜에 따라 얻은 RNA 실시간 PCR 분석 실험을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 교양된 기본 adipocytes에서 RNA 격리에 대 한 것이 아닙니다.

프로토콜

절차에 사용 된 쥐의 관심과 동물의 보호를 위한 캐나다 위원회에 의해 설정 하는 실험 동물의 사용에 대 한 표준 준수. 모든 절차는 대학 동물 관리 및 사용 위원회 춤 연구 센터에 의해 승인 되었다.

1. 검 시 및 남성 쥐에서 지방 조직 컬렉션

1. 연구 목적에 따라 실험 그룹을 확인 합니다. 이 연구에서는 샘플 C57Bl/6 배경에 남성 쥐의 2 개 그룹에서 수집 된 (n = 12-14/그룹). 여기에 사용 되는 쥐 나이의 12-15 주 12 h 명암 주기 액세스 일반 (N) 또는 (HF) 높은 지방 다이어트에 유지 됩니다 그리고 물 광고 libitum 10 주¹¹의 기간에 대 한 확인 하십시오.
2. 10 분 동안 6% CO₂ 노출은 밀폐 챔버에 마우스를 배치 하 여 마우스를 안락사.
3. 천천히 동물의 흉 골의 왼쪽에 단지 26 G 1/2po 바늘으로 장착 1 mL 주사기를 삽입 하 고 천천히 당기는 동물의 혈액의 대부분을 제거 하는 피스톤에 의해 심장 펑크를 수행 합니다. 주사기는 동물의 신체에 평행선 다는 것을 확인 하십시오. 혈액 되지 않을 경우 주사기에 피스톤을 당기면 주사기를 천천히 회전 합니다.
   참고: (사이 0.8 및 1 mL 혈액 볼륨) 성공적인 심장 찔린 지방 조직 혈액의 오염을 줄일 것 이다.
4. 그것의 뒤에 쥐를 그림 1에서 보듯이 22 G 바늘을 사용 하 여 패드에 각 발을 고정.
5. 거 즈로 문질러 알코올로 마우스의 피부 몇 단방향 모션으로 이렇게 하면 머리 플랫 남아 지방 조직 샘플의 머리 오염 감소에 따라 생식 기 기관 내려가면서 목에서 시작 시간 없이 머리 제거.
6. 하지만 깨끗 하지 소독 집게와 수술가 위를 사용 하 여, 생식 기 기관 근처 중앙 피부 상승 하 고 작은 0.3 m m 절 개.
7. 가로로 열린된 구멍에가 위를 삽입 하 고 복 벽에서 복 부 피부를 분리.
   참고: 이것은 피부와 복 부 벽 사이 공간에 무딘 해 부 및 하지 막이이 공간에서 발견을 절단 하 여 이루어집니다.
8. 집게를 사용 하 여 열린된 구멍 근처 중앙 피부 상승과 커트가 피부는 교육 알바 곽 (마우스 크기에 따라 ~ 4 cm) 근처까지.
   참고: 이 내장 지방 조직 공기에 노출 하 고 무결성 조직 및 콘텐츠를 변경할 수 있습니다 어떤 지방 패드의 건조 이어질 수도 복 부 근육을 절단 하지 마십시오.
9. 흉 곽의 중간에서 ~ 2 cm에 오른쪽 팔 쪽으로 피부를 잘라. 생식 기 기관, 근처에서 ~ 2 cm에 오른쪽 뒷 다리 위에 피부 잘라.
10. 열린된 피부의 한 모서리를 스트레칭 하 고 22 G 바늘을 사용 하 여 패드에 그것을 아래로 핀. 다른 모서리와 반복.
    참고: 지방 조직에 피부 노출은 복 부 피하 지방 (SCF) (그림 1A).
11. 무딘 해 부 및 수술가 위는 피부에 대 한 가능한 평면 위치를 사용 하 여 피부에서 절단에 SCF를 수집 합니다. 일단 수집, 사전 확인 된 알루미늄 호 일에는 SCF를 넣어.
    참고: 수집 또는 피부 또는 머리와 지방이 많은 조직을 변경 됩니다 오염 샘플 품질 및 RNA 항복 RNases 때문. 수집 하는 지방 조직 너무 많은 시간을 지출 하는 경우 샘플 어떤 또한 샘플의 품질을 변경할 수 있습니다 또한 건조 수 있습니다.
12. 동물의 왼쪽에 1.9 1.11 단계를 반복 합니다. 알루미늄 호 일에 왼쪽 및 오른쪽 지방 패드를 수영장 및 액체 질소에 샘플을 동결.
13. 내장 지방이 많은 조직에 대 한 액세스를 얻으려면, 깨끗 한 하지만 하지 무 균 수술가 위를 사용 하 여 집게를 따라 복 부 근육을 잘라는 교육 알바, 흉 곽에 성 기에서 마우스 크기에 따라 ~ 4 cm에. 그런 다음 뒤쪽으로 마우스의 복 부 장기의 측면에 대 한 액세스를 ~2.5 cm에 성 기에서 복 부 근육에 절 개를 확인 합니다.
14. 생식 기관 주위 지방이 peri gonadal 지방 (PGF) (그림 1B) 이다. PGF는 epididymis는 고환, ductus 정 관에 연결 되어, 신중 하 게 그 구조에서 왼쪽된 지방 패드를 분리 하 고 미리 확인 된 알루미늄 호 일에 넣어. 오른쪽 측면에 대 한 반복 합니다. 두 PGFs는 수집 되 면 액체 질소에 샘플을 동결.
15. Starting 왼쪽으로, 오른쪽 복 부 구멍에서 용기를 이동 하 여 신장 노출. 신장 주위 지방 조직 peri 신장 지방 (PRF) (그림 1C)입니다. PRF는 또한 부 신 땀 샘 (그림 1D)를 포위 한다.
16. 분리 하 고 PRF를 수집 하기 전에 부 신 땀 샘을 제거. 그들은 단지 조금 pinker는 지방 조직 보다 지루한 수 있습니다.
    참고: 신장 혈액 오염 지방 조직 하 고이 지방 패드 내 아드레날린을 식별 하기 위해 더 어렵게 만들 수 있습니다이 단계 동안 제거할 수 없습니다.
17. 다시 근육 벽에서 PRF ureter, 신장 동맥, 및 신장 고 PRF는 시체의 나머지 부분에서 분리 하는 정 맥을 절단 하 여 결말을 격리 합니다. 절단 및 신장 캡슐을 제거 하 여 신장에서 PRF를 격리 합니다. PRF 캡슐에 연결 된 유지 됩니다.
18. 오른쪽에 1.15, 1.17 단계를 반복 합니다. 두 PRF를 알루미늄 호 일에 넣고 액체 질소에 샘플을 동결.
19. 단계 1.2에 1.18 수집 모든 마우스에서 절차를 반복 합니다.
20. 이 시점에서, 지방 조직 연 삭으로 진행 하거나 나중 추출-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장 합니다. 샘플 몇 년⁴에 대 한-80 ℃에서 안정적으로 저장할 수 있습니다.

2. 준비의 RNA 격리에 대 한 지방 조직 흰색

참고: 피부는 RNA 저하를 홍보할 수 있는 등, 절연 후 샘플 품질 및 RNA 수확량을 변경 RNases 포함 각 단계에 대 한 장갑 착용.

1. 준비 및 3 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 스크류 캡 튜브 마우스, 백색 지방이 많은 직물의 각 유형에 대 한 하나의 당을 식별 하 고 선반에 그들을 두십시오.
   참고: 그들은 뚱뚱한 질량 증가 비만 동물 추가 튜브를 필요할 수 있습니다. 이것은 특히 한 마우스에 대 한 7 튜브까지는 SCF에 대 한 true 얻은 것 이다.
2. 70% 에탄올과 벤치를 청소 하 고 표면에 깨끗 하 고 새로운 벤치 종이 넣어.
3. 지방 조직 갓 마우스에서 수집 된 또는-80 ° C 냉장고에 미리 저장, 프로시저의 시작 부분까지 한 액체 질소 채워진 컨테이너에서 모든 샘플을 수집 합니다.
4. 액체 질소 용기에 그들을 배치 하 여 박격포와 유 봉, 주걱을 동결. 액체 질소는 '종'을 중지, 지방이 많은 직물의 연 삭을 시작할 수 있습니다.
   참고: 이 단계, 박격포, 주걱, 원뿔 튜브 및 지방 조직 전체 과정에서 냉장 유지 해야 합니다. 어떤 열 지방 조직에 용 해 하 고 RNA를 추출 하기 어렵게 만듭니다. 또한, 세라믹 박격포 및 방 앗 공이 사용 하는 경우에 그것을 차가운 유지 하 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용할 수 있습니다 하나.
5. 배치 모든 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 스크류 캡 튜브 2.2 드라이 아이스에 단계에 그들을 준비 합니다.
6. 손에 동상이 방지 하려면 갈색 종이의 몇 가지 레이어를 사용 하 여 액체 질소에서 박격포 고 작업 벤치에 그것을 넣어.
7. 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 지방 조직 샘플을 수집 하 고 박격포에 넣어. 신속 하 게 알루미늄 호 일을 풀 다 고 박격포의 센터에 샘플을 놓습니다.
   참고: 비만 쥐의 경우는 지방 조직 샘플 너무 큰 경우 엄지를 사용 하 여 알루미늄 호 일의 작은 부분에는 샘플을 휴식 하 고 각 부분을 별도로 격파.
8. 갈색 종이의 몇 가지 레이어를 사용 하 여 액체 질소에서 유 봉 고 박격포에 맞는. 갈색 종이와 유 봉 잡고 한 두 번은 유 봉 위에 칠 망치를 사용 합니다. 미세 분말을 얻을 때까지 샘플을 움직임을 회전 박격포는 유 봉 아래로 누르십시오.
   참고: 이 단계는 적절 한 RNA 격리를 얻기 위해 중요 한. 사실, 더 큰 조각의 존재 방해 RNA 격리 하 고 수확량을 감소.
9. 정밀한 분말을 얻은 제거는 유 봉과 액체 질소에서 주걱을 들고 해당 냉장된 미리 1.5 mL 원뿔 관으로 샘플을 전송 하는 데 사용할.
   참고: 다시 녹는에서 샘플을 방지 하기 위해 수시로 액체 질소에는 주걱을 찍어. 또한, 항상 녹고에서 샘플을 방지 하기 위해 드라이 아이스에 원뿔 튜브를 유지. 약 2/3 용량 (~ 1 mL) 지상 샘플 가득 원뿔 튜브는 적절 한 RNA 수율 및 수량 필요 합니다.
10. 일단 약 1 mL 가득, 튜브 닫고 다른 액체 질소 채워진 컨테이너에 놓습니다.
    참고: 초과 샘플 별도 미리 냉장된 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브에 넣어 하 고 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 저장 된 수 있습니다.
11. 박격포와 유 봉, 주걱을 다음 지방 조직 샘플으로 이어지기를 피하기 위해 갈색 서류와 함께 청소. 진정 액체 질소에 유 봉과 주걱 다시 넣어. 갈색 종이 비록 RNA 격리의 매일 갈색 종이의 갓 열린된 팩 사용 하지 RNase 무료.
12. 2.4 2.11 다음 예제와 단계를 반복 합니다.
13. 모든 샘플 처리 됩니다 일단 RNA 격리를 시작 하거나 나중에 사용-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.
    참고: 튜브 파열 되지 않도록 완전히 액체 질소 용기에 물속에 의해 샘플 상자를 고정 합니다. 멋진 충분히 상자에서 과잉 질소를 제거 하는 경우 그것은 액체 질소 위에 플 로트. 상자에 샘플을 정렬 하 고-80 ° C 냉동 고에 넣어.

3. RNA 격리 지상 지방 조직에서

주의: 페 놀 솔루션은 피부에 유해한. 실험실 외 투, 장갑, 안전 안경 착용 하 고 화학 후드 프로시저 실행. 단계별 흐름도 그림 2에 표시 됩니다.

1. 준비 및 두 집합이 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브를 식별 하 고 선반에 넣어.
2. Adipose 조직 갓 지상 또는 사전-80 ° C 냉동 고에 저장, 여부를 대부분 실 온에서 수행 절차의 시작까지 액체 질소 채워진 컨테이너에서 모든 샘플을 수집 합니다.
3. 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 지상 지방 조직 샘플을 선택 하 고 관 선반에 넣어. 튜브는 조직 분말의 약 100 밀리 그램에 해당 하는 분말의 ~ 1 mL를 포함 해야 합니다.
4. 천천히 튜브를 엽니다.
   참고: 실 온에서 닫힌된 튜브를 남기거 나 너무 빨리 튜브의 뚜껑을 열고 발생할 수 있습니다 샘플 손실 또는 부상으로 질소의 압력 튜브에서 탈출 하는 경향이 있다.
5. 샘플을 페 놀 솔루션의 500 µ L를 추가 (1:2 비율의 페 놀 솔루션: 조직 분말).
6. 가까운 튜브와 약 5 최대 속도로 소용돌이의 뚜껑 천천히 s. 하 고 신중 하 게 질소 (공기 튜브에서 나오는 소리는 들릴 수 있다)에서 압력을 풀어 튜브를 엽니다.
7. 3.5-3.6 단계 반복 합니다. 마지막 페 놀 솔루션 볼륨 샘플에 추가 1 mL 이다.
8. 3.6 단계를 반복 하 여 샘플 완전히 해산.
   참고: 그것은 튜브 파열 되지 않도록 더 진행 하기 전에 튜브에서 모든 압력을 해제 해야 합니다.
9. 다음 샘플 단계 3.4-3.8을 반복 하는 동안 실내 온도에 서 서 샘플을 보자.
10. 일단 모든 샘플 및 모든 샘플 실 온에서 5 분을 품 어 처리, 짧게 최대 속도로 소용돌이.
11. 4 ° c.에 12 000 x g에서 10 분 원심 실내 온도에 다시 튜브를가지고.
    참고: 원심, 후 3 단계는 그림 2와 같이 현재: 지방 (위), RNA (가운데)과 펠 릿 (아래).
12. 각 샘플에 대 한 전송 많은 RNA (중간 핑크 레이어) 가능한 해당 관의 첫 번째 집합에 필터링 된 팁을 사용 하 여 P1000 피 펫과. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
13. 지질 (상위 계층)에 의해 RNA (중간 계층)의 최소한의 오염을 보장 하기 위해, 부근에 튜브의 팁 상위 단계 피어스. RNA는 걸 방지 하기 위해 새로운 튜브의 측면을 건드리지 않고도 새 원뿔 관으로 전송 지질 팁의 외부에 있을 수 있습니다.
14. 각 샘플에 순수 클로 프롬의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 미 품 어 10 분 동안 반전에 의해 혼합.
15. 4 ° C에서 12 000 x g 15 분 원심 하 고 실내 온도에 다시 튜브를가지고.
    참고: 원심, 후 3 단계는: RNA (위), interphase DNA (중간)를 포함 하 고 붉은 페 놀-클로 프롬 포함 단백질 (아래).
16. 각 샘플에 대 한 전송 많은 수성 투명 RNA에 포함 된 단계 (최고 단계)로 가능한 해당 원뿔 관의 두 번째 세트 P1000 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 함께. 각 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
    참고: Interphase는 깨지기 쉬운 이며 포부 너무 빨리 완료 되 면 상위 단계 오염 될 수 있습니다. 다른 방법으로는 interphase 교란의 기회를 줄이기 위해 P200 피 펫을 사용 합니다.
17. 각 샘플을 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L을 추가 하 고 15 초에 대 한 반전에 의해 혼합.
18. 실 온에서 10 분을 품 어
19. 4 ° C에서 12 000 x g에서 10 분 원심 하 고 실내 온도에 다시 튜브를가지고. 각 튜브를 거꾸로 하 여는 소 프로 파 놀을 삭제 합니다.
    참고: 작은 흰색 RNA 펠 릿 일반적으로 볼 수 있다 그러나 때때로 하지 않을 수 있습니다.
20. 각 샘플 및 짧게 소용돌이의 75% 에탄올 (100% 에탄올과 RNase 무료 물에서 준비) 1 mL를 추가 최대 속도로 각 튜브.
21. 4 ° C에서 7 500 x g 5 분 원심 하 고 실내 온도에 다시 튜브를가지고.
22. 각 튜브를 거꾸로 하 여 75% 에탄올을 무시 하 고 가볍게 갈색 종이 어떤 나머지를 제거에 대 한 누릅니다.
    참고: 필요한 경우 필터링-팁을 사용 하 여 RNA 펠 릿 근처 알코올을 제거. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
23. 뚜껑 열고 두고와 공기 약 15-20 분의 RNA 펠 렛 건조.
    참고: 이 단계 동안 RNA 펠 릿을 반투명 될 수도 있습니다.
24. RNA로 펠 릿에서 가용 화는 크기에 따라 다릅니다, RNA를 solubilize 사용 RNase 무료 물 볼륨을 결정 하는 펠 릿의 크기를 평가. 각 샘플의 볼륨 (10 ~ 25 µ L)를 적어 둡니다.
    참고: 이 단계는 단지 질적. RNA 펠 릿은 볼 수 없습니다, 시료에 RNA 무료 물 10 µ L를 추가 합니다.
25. 각 샘플 (미리 결정 된 볼륨 단계 3.24)에 RNase 무료 물 10-25 µ L를 추가 합니다.
26. 60 ° c.에 설정 열 블록에 5 분 샘플을 품 어 짧게 소용돌이 튜브.
27. 60 ° c.에 동일한 열 블록에 추가 5 분에 대 한 샘플을 품 어
28. 빠른 스핀 모든 샘플 미니 원심 분리기 회전 및 즉시 얼음에 넣어.
29. RNA 농도 순도 확인 합니다. 나중 사용을 위해-80 ° C 냉동 고에서 역방향 전송 (RT) cDNA를 가져오거나 샘플 저장을 수행 합니다.
    참고: 이 RNA 샘플 저하로 여러 냉동/해 동 주기를 하지 마십시오.

4. 지방 조직 RNA 농도 및 순도의 결정

1. 든 지방 조직 RNA 샘플 했다 갓 추출 및 solubilized 사전-80 ° C 냉동 고에 저장 된, 모든 샘플을 수집 하 고 절차의 시작까지 얼음에 녹여 하도록 허용. 이 다음 단계 또는 여러 냉동/해 동 주기를 피하기 위해 격리의 끝에서 시작의 바로 전에 끝나야 한다.
2. 준비 및 두 집합이 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브를 식별 하 고 관 선반에 넣어.
3. 때 모든 RNA 샘플은 완전히 해 동, 소용돌이 1 s와 얼음에 넣어에 대 한 샘플.
4. 희석의 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여 첫 번째 집합에 RNA 100 1 x 테 솔루션 필터링 RNase 무료 팁 (튜브를 넣어 1 x 테 솔루션의 99 µ L 및 RNA의 1 µ L).
5. 각 샘플에 대해 반복 합니다.
   참고: 볼륨은 cuvette 사용에 따라 각 분 광 광도 계에 대 한 수 있습니다.
6. 일단 모든 샘플 처리는, 소용돌이 각 샘플을 희석.
7. 희석된 RNA 샘플을 처리 하기 전에 빈 (1 x 테)를 사용 하 여 악기를 교정 하는 분 광 광도 계의 프로토콜을 따릅니다.
8. 석 영 cuvette에 희석된 RNA 샘플을 전송 하 고 260에 각 샘플의 농도 결정 nm.
   참고: 분 광 광도 계 팬 들은 마지막 RNA 농도 정보를 제공 하지 않습니다,이 수식을 사용 하 여이 계산: RNA (µ g / µ L) = OD₂₆₀ x (40 µ g RNA/1 000 µ L) x 희석 요소.
9. OD₂₆₀/OD₂₈₀비율을 계산 하 여 각 샘플의 RNA 순도 확인 합니다.
   참고: 비율 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 2.0 주위는 일반적으로 순수한 RNA¹²간주 됩니다. RNA 품질 확인 것이 좋습니다. 위해서는 그렇게, 1 x TBE 버퍼 (89 m m 트리 스 베이스, 89 m m 붕와 2 mM EDTA, pH 8.0)로 만든 1 %agarose 표 백제 젤에 RNA의 1 µ g 넣고 1% 표 백제 솔루션¹³ (그림 3). 아주 좋은 품질의 RNA 보여줍니다 28S와 18S rRNA 밴드 고 28S 밴드는 18 보다 더 긴장 해야 합니다. RNA 품질 허용 때 두 rRNA 밴드 비슷한 강도로 볼 수 있습니다. 18S 밴드는 더 강렬 28S 밴드 보다 고 얼룩은 표시, RNA 저하를 나타내는 순간 RNA 품질 결핍 된다.
10. 각 샘플에 대 한 0.5 µ g / µ L RNA의 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 관을 필요에 따라 샘플을 희석 RNase 무료 물을 사용 하 여 두 번째 집합에 있는 주식에서의 10 µ L를 준비 합니다. 이러한 샘플 RT cDNA를 얻기 위해 사용 됩니다.
11. 일단 모든 샘플 처리 됩니다 RT를 시작 하거나 나중에 사용-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.

5입니다. 리버스-전사 (RT)

1. 지방 조직 RNA 샘플 했다 갓 0.5 µ g / µ L 희석 또는 사전-80 ° C 냉동 고에 저장, 모든 예제 및 시 약을 수집 하 고 절차의 시작까지 얼음에 녹여 하도록 허용.
2. 얼음에 PCR 튜브 스트립 랙 위에. 일단 감기 충분히 준비 하 고 식별 집합이 RNase 무료 PCR 튜브 제거 하 고 선반에 넣어. 빈 값을 포함 합니다.
3. 준비 하는 RNA의 DNase 치료에 대 한 반응: 다음의 (샘플 + 1 샘플의 필요한 금액)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): 반응 버퍼 MgCl₂, DNase I (1 U / µ l)과 RNase 무료의 7.5 µ L를 사용 하 여 물의 0.5 µ L X 10의 1 µ L 필터링 팁입니다. 각 관에 9 µ L를 분배.
4. 각 스트립에 빠른 스핀 미니 스핀에 모든 스트립 원심 튜브의 하단에 샘플을가지고 모자를 넣어 해당 튜브를 각 샘플에서 RNA의 µ 0.5 µ g/L의 1 µ L를 추가 합니다. 빈에 대 한 RNA 무료 물 1 µ L를 추가 합니다.
5. 모든 튜브 스트립 열 cycler 또는 얼음에 선반에 다시 튜브 스트립을 넣어 30 분 동안 37 ° C에가 열 블록에 품 어.
6. 각 튜브를 EDTA (50 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 모든 튜브 스트립 튜브 스트립 다시 얼음에 선반에 넣어 10 분 65 ° C에서 난방 블록이 나 열 cycler에 품 어.
7. 다음의 (샘플 플러스 1 샘플의 필요한 수)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): 임의의 hexamers (0.2 µ g / µ L)와 dNTP 믹스 (10 m m의 농도에서 4 개의 deoxynucleotides의 각 포함)의 1 µ L의 1 µ L. 필터링 팁을 사용 하 여 각 튜브에 마스터 믹스 2 µ L를 분배. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
8. 모든 튜브 스트립 열 cycler 또는 얼음에 랙 튜브 스트립을 다시 넣어 5 분 65 ° C에서 난방 블록에서 품 어.
9. 다음의 (샘플 플러스 1 샘플의 필요한 수)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): RT 버퍼, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 1 µ L, 역전사 (200 U / µ L)의 0.25 µ L과 nuclease 무료 물 1.75 µ L x 5의 4 µ L. 필터링된 팁을 사용 하 여 각 관에서 7 µ L를 분배. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
10. 다음 프로그램을 설정 하 여 열 cycler에서 RT 수행: 25 ° C, 50 ° C, 85 ° c.에 5 분에서 30 분에서 10 분 얼음에 선반에 다시 튜브 스트립 넣어.
11. 준비 및 집합이 RNase 무료 PCR 튜브 스트립을 식별 하 고 선반에 넣어.
12. 각 샘플에 대 한 원하는 양의 초순 수를 사용 하 여 새로운 튜브 스트립에 주식에서 1:5 희석된 cDNA 준비 합니다. 1:5 희석된 cDNA 샘플 실시간 PCR를 위해 사용 됩니다.
13. 모든 샘플 처리 됩니다 일단 실시간 PCR 시작 하거나 나중에 사용-20 ° C 냉동 고에 (재고 및 희석된 샘플) 샘플을 저장.

6. 실시간 PCR 지방 조직에서 유전자 발현에 대 한

참고: 형광 염료가 빛에 노출 하지 마십시오. 프로토콜 아래 참조 유전자 s16¹⁴의 확대를 설명합니다. 뇌관 및 PCR 조건 관심사의 유전자에 따라 수정할 수 합니다.

1. CDNA 샘플 갓 희석된 1: 5을 했다 또는-20 ° C 냉장고에 미리 저장 된, 모든 샘플 및 시 약을 수집 하 고 절차의 시작까지 얼음에 녹여 하도록 허용.
2. 실시간 PCR 튜브 스트립 랙 얼음에 넣어. 일단 감기를 충분히 준비 하 고 실시간에의 한 집합을 식별 PCR 튜브 제거 하 고 선반에 넣어. 각 샘플 및 중복에서 빈 준비.
3. 다음의 (샘플 플러스 1 샘플의 필요한 수)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): 초순, 형광 염료 (예: SYBR 녹색)의 5 µ L, 앞으로 뇌관의 0.3 µ L 및 역방향 뇌관의 0.3 µ L의 1.9 µ L. 각 관에서 7.5 µ L를 분배.
4. 각 샘플에서 해당 튜브 1:5 희석된 cDNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. 공백에 대 한 초순 수의 2.5 µ L를 추가 합니다. 각 스트립에 모자를 넣어.
5. 실시간 PCR에 다음 프로그램을 설정 하려면 제조업체의 지침에 따라: 95 ° C 및 15의 40 주기에서 10 분에서 50 ° C, 30 s s 60 ° C, 30에서 70 ° c.에 s 실시간 PCR 기계의 회전자에 샘플 스트립을 넣어 하 고 프로그램을 시작 합니다.
   참고: 열 cycler 조건 사용 기구 및 관심사의 유전자에 따라 달라질 수 있습니다. 그림 3 보기 leptin mRNA 증폭 참조 유전자 S16 mRNA 증폭^14,15정규화에 mRNA 식 결과.

결과

검 시 절차에 따라 3 개의 흰색 adipose 조직 수집 되었고 쥐 (N와 HF 다이어트 먹이 쥐)의 두 그룹에서가 중. 예상 했던 대로, 쥐 HF 다이어트 최종 몸 무게와 체중 증가 littermates N 다이어트 (표 1)에 비해 증가 했다. 이러한 관측 함께 했다 이상 2-fold 증가 비만 생쥐에서 PGF, PRF, SCF의 무게에 그에 비해 N 다이어트에.

격리 ...

토론

다음 먹이 HF-다이어트, 비만 쥐 몸 및 백색 지방 조직 가중치 N 규정식 먹인 쥐에 비해 증가을 발견 했다. 페 놀 솔루션을 사용 하 여 추출 하는 RNA 좋은 순도와 샘플을 굴복. Leptin은 주로 지방 조직에 의해 생산 하는 adipokine 및 지방 대량¹⁶와 긍정적으로 상관 관계 알려져 있다. 예상 했던 대로, leptin mRNA 식 그들의 뚱뚱한 질량을 가진 concomitance에서 비만 생쥐에서 증가 했다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL seringes
1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0)
22 G needles
26 G needles
75% Ethanol
Block heater (dry bath)
Chloroform	Sigma	C2432-500mL
dATP	Thermo scientific	R0141
dCTP	Thermo scientific	R0151
dGTP	Thermo scientific	R0161
DNase I (1 U/µl)	Thermo scientific	EN0521
dTTP	Thermo scientific	R0171
Faststart Universal SYBR green Master (Rox)	Roche	4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye	Roche	4913914001
Filtered tips
Forceps	Instrumentarium	HB275
Gauze
Hammer
High fat rodent diet	Bio-Serv, Frenchtown, NJ	F3282
Isopropanol	Laboratoire MAT	IH-0101
Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM
Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM
Liquid nitrogen
Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer)	Thermo scientific	EP0742
Nanopure water (referred as ultrapure water)
Nitrile examination gloves
Nitrile gloves
Normal rodent diet	Harlan Laboratories, Madison, WI	Harlan 2018
P1000 pipetman
P2 pipetman
P20 pipetman
P200 pipetman
Phenol solution (TRIzol)	Ambion Life Technologies	15598018
Pre-identified aluminium foil
Quartz spectrophotometer cuvette
Rack for PCR tube strips
Racks for RT-PCR tube strips
Random hexamers	Invitrogen	58875
Real-time PCR Rotor Gene system	Corbett research	RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler
Refrigerated bench-top centrifuge
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo scientific	EO0381
RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes
RNase-free 1.5 mL screw cap tubes
RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps
RNase-free water	Hyclone	SH30538.02
RT-PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Corbett 3000
RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps
S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM
S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 3100 pro
Stainless steel mortar and pestle
Surgical pads	Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad
Surgical scissors	Intrumentarium	130.450.11
Thermal cycler
Thermal cycler	Biometra	Thermocycler
Vortex mixer
Weighing spatula