화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

요약

Schmidtea 서 planarian 줄기 세포 및 조직 재생을 공부에 대 한 우수한 모델입니다. 이 게시는 선택적으로 한 기관, 인 두, 화학 나트륨 아 지 드를 동물을 노출 하 여 제거 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 또한 인 두 재생을 모니터링 하기 위한 방법을 설명 합니다.

초록

Planarians는 flatworms는 중생에서 매우 효율적인. 그들은 빚이 수 많은 부상의 모든 종류에 신속 하 게 응답할 수 있는 줄기 세포. 이 동물에 일반적인 부상 모델 조직, 여러 장기를 손상의 다량을 제거 합니다. 극복 하기 위해이 광범위 한 조직 손상, 여기 planarian Schmidtea 지중해에서 단일 기관, 인 두를 선택적으로 제거 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 시 토 크롬 산화 효소 억제제 나트륨 아 지 드를 포함 하는 솔루션에 몸을 담글 동물에 의해 이것을 달성. 나트륨 아 지 드에 짧은 노출 우리가 "화학 절단" 이라고 부르는 동물에서 인 두의 돌출을 하면 화학 절단 전체 인 두를 제거 하 고 작은 상처 인 두 소장에 연결을 생성 합니다. 광범위 한 rinsing 후 모든 절단된 동물 약 1 주일에서 완전 한 기능 인 두를 다시 생성 합니다. 줄기 세포는 시체의 나머지 부분에서 새로운 인 두의 재생 드라이브. 여기, 우리는 자세한 제공 화학 절단에 대 한 프로토콜 및 성공적인 절단 및 중생을 평가 하기 위해 조직학 및 행동 방법을 설명.

서문

재생 재생 용량 전신 재생 특정 무척 추 동물에서에서 척추¹에서 더 제한 된 능력에 이르기까지 동물의 왕국에 걸쳐 발생 하는 현상입니다. 교체 기능 조직의 복잡 한 과정이 고 종종 여러 종류의 세포 동시 복원을 수반 한다. 예를 들어 도롱뇽 다리, osteoblasts, chondrocytes, 신경, 근육, 그리고 될 필요가 상피 세포를 다시 생성 하려면²를 대체 합니다. 이 새로 생성 된 셀 형식 또한 새로운 다리 기능을 촉진 하기 위하여 제대로 구성 해야 합니다. 이러한 복잡 한 프로세스를 이해 기법을 재생 특정 세포 유형 및 기관으로의 통합에 초점을 해야 합니다.

재생 반응의 연구를 단순화 하기 위해 고용 전략 중 하나입니다 대상된 제거 중 특정 종류의 세포 또는 조직의 더 큰 컬렉션. 예를 들어 zebrafish, 표현의 특정 셀에 nitroreductase 그들의 파괴 후에 metronidazole^3,4의 응용 프로그램을 리드. 초파리 애벌레에서 조직의 특정 발기인에서 프로-apoptotic 유전자 표현 imaginal 디스크^5,6의 특정 지역 ablate 선택적으로 수 있습니다. 모두 이러한 전략의 손상을 신속 하지만 제어, 그리고 분자 및 세포 재생에 대 한 책임 메커니즘을 해 부에 사용 되었습니다.

이 원고에서 우리는 선택적으로 ablate planarian Schmidtea 서인 두 라는 전체 장기 하는 방법을 설명 합니다. Planarians는 그들의 다 작의 재생 능력에 대 한 알려진 중생의 클래식 모델도 분 조각 전체 동물 ^7,8을 regrow 수 있습니다. 그들은 줄기 세포를 만능 세포와 혈통 제한 창시자^9,,1011의 구성의 큰, 이질적인 인구가 있다. 이 세포는 증식 하 고 인 두, 신경, 소화 및 배설 시스템, 그리고 근육과 상피 세포^9,,1012를 포함 하 여 모든 누락 된 조직을 대체 하 차별화 합니다. 우리가 알고 있지만 이러한 줄기 세포 재생을 시작, 우리가 완전히 이러한 모든 다른 세포 유형 대체 몰아 분자 메커니즘을 이해 하지 않습니다. 정확한 줄기 세포 응답을 이끌어내는 정의 부상 방법이 복잡 한 과정의 윤곽을 그리 다 수 있습니다.

인 두, 수 유에 필요한 대형 원통형 튜브 이며, 신경, 근육, 분 비 상피 세포^13,29를 포함 합니다. 일반적으로 동물의 복 부 측에 주머니에 숨겨져, 동물의 단일 신체 식품의 존재를 감지 시 열기를 통해 확장 합니다. 선택적으로 인 두를 절단, 하 우리 라는 화학 나트륨 아 지 드, 선 충 C.^14,,1516에 일반적으로 사용된 마 취에서에서 planarians를 담근 다. Planarians에 그것의 사용 처음 애 들러 외에 의해 보고 되었다., 2014 년¹². 나트륨 아 지 드에 노출의 몇 분 안에 planarians 돌출 그들의 pharynges, 그리고 부드러운 동요와 인 두 동물에서 분리. 우리는 인 두의이 완전 하 고 선택적 손실 "화학 절단"로 참조 하십시오. 1 주일 후 절단, 완전 한 기능 인 두 복원된¹²입니다. 인 두 먹이 기를 위해 필요 하기 때문에, 기능 재생 먹이 행동을 모니터링 하 여 측정할 수 있습니다. 아래, 우리는 화학 절단 및 인 두의 재생 및 복원의 먹이 행동을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

프로토콜

1입니다. 준비

1. Planaria 물 준비 ¹⁷
   1. 1 X Montjuïc 소금 솔루션에서 planarians을 유지 관리 합니다. 준비 planarian 물, 개별 재고 솔루션 1 M CaCl₂, 1m MgSO₄, 1 M MgCl₂, 1 M KCl과 초순에 5 M NaCl을 확인 합니다. 필터-0.2 µ m 병 맨 filterfor 장기 저장과 소독.
      참고: (25 ° C에서 18.2 m ω의 저항)와 초순 이온을 제거 된 물만을 사용 하 여 준비 계곡이 소금.
   2. 5 X 소금 솔루션의 1 리터 재고를 준비 하려면 1 M CaCl₂, 1m MgSO₄, MgCl₂, KCl과 900 mL 초순에 5 M NaCl 솔루션의 1.6 mL 0.5 mL의 0.5 mL의 5 mL의 5 mL을 결합 합니다. 이 솔루션에 NaHCO₃ 0.504 g를 추가 하 고 섞어 저 어. 염 산 7.0에 pH를 조정 합니다.
   3. 두이 일 농도 대용량 유리병 등 무 균 용기에 초순에 X 1 재고 솔루션 배 희석 ( 재료의 표참조). 이 1 배 솔루션을 사용 하 여 성별이 없는 planarians를 유지 하기 위한.
      참고: 계곡이 소금 솔루션, 사용 하 여 로컬로 구입한 봄 물 또는 상용 수족관 소금 포함 된 초순 농도 of0.5 g/L¹⁸( 재료의 표참조)를 혼합.
   4. 정적 문화¹⁹에 세균 감염을 방지 하기 위해 항생제를 포함 하는 물에서 planarians을 유지 관리 합니다. 50 mg/mL 초순에 gentamicin 황산의 재고 솔루션을 준비 하 고 필터를 소독. 동물 유지는 컨테이너, gentamicin 황산 50 µ g/mL (1:1000 희석)의 최종 농도에 추가 합니다.
2. 간 붙여넣기의 준비
   1. Planarians 유기의 다이어트에 성공할 풀을 먹이 쇠고기 간, 구매 신선한 간 고 24 h. 프로세스 제거 부드럽게 벗 여 간 캡슐화 막 캡슐. 간 ~ 1 cm 조각으로 잘라 하 고 블레이드를 사용 하 여 다쳤어요을 모든 간 정 맥과 동맥을 삭제.
   2. Macerate 간 조각 음식 밀 또는 푸드 프로세서를 사용 하 고 와이어 메쉬 음식 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 과자 봉지에 결합 하 고 주사기 또는 35 mm 페 트리 접시로 분배. 수 유, 전에 기포 제거를 부드럽게 원심.
   3. 간 1 년 및 이전에 사용 하 여 해 동-80 ° C에서의 aliquots를 저장 합니다. 녹고, 후 다시 한 번, 어떤 남은 간 동결 또는 24 h까지 4 ° C에서 저장.
3. 동물의 유지 보수
   1. Planarians는 성장 하 고 먹이 기의 주파수에 따라 다양 한 크기로 축소 됩니다. 피드 planarians 모든 다른 주 (14 일에 한 번). 장기적인 대량 문화에 대 한 ( 재료의 표참조) 다양 한 크기의 플라스틱 용기를 사용 합니다.
   2. 동물 먹이 상자에 간 한 완두콩 크기의 방울을 배치 하는 금속 주걱 또는 플라스틱 전송 피펫으로 사용 합니다. 동물 상자를 청소 하기 전에 1-2 헤 제거 나머지 음식 먹을 수 있습니다.
   3. 먹이 하지 않을 경우 벌레 먹이 (직접 수 유 후 한 번 그리고 한 번 2 일 후), 면 주 2 회 또는 주 1 회 청소. 청소, 상자에서 planarians를 유지 하면서 신중 하 게 물을 붓는 의해 플라스틱 비 커에 물을 드레인. 상자 표면 종이 타월로 닦아 다음 상자는 깨끗 한 때까지 모든 면에서 반복.
   4. 물 (약 ¾ 상자 볼륨)를 장착 하 고 50 µ g/mL의 최종 농도에 gentamicin 추가. 어두운 캐비닛에 또는 20 ° C 배양 기에서 동물을 저장 합니다.
4. 벌레의 선택
   1. 5-7 일 이전 지 루 했다 벌레를 선택 합니다.
      참고: 그것은 훨씬 더가 최근 (1-2 일전 절단) 먹이 벌레에서 pharynges 절단 어렵다. 먹이 동물 또한 더에 민감합니다 나트륨 아 지 드.
   2. 벌레는 약 6 m m 길이 선택 합니다. 벌레의 크기를 예측 하려면 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에 그것을 전송. 플랫 6-에서 눈금자 또는 페 트리 접시 아래 5 x 5 mm 방안 놓고 그것을 크롤 링 하는 동안 벌레 길이 측정 합니다.
      참고: 길이 6 m m 보다 작은 벌레는 절단 하기 더 어렵다.
5. 나트륨 아 지 드의 준비
   1. 나트륨 아 지 드 가루 planaria 물에 용 해 하 여 100 m m 솔루션을 준비 합니다.
      주의: 나트륨 아 지 드 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다. 나트륨 아 지 드 구로 버리지 마십시오. 다음 사용 하 여, 개별적으로 유해 폐기물 처리에 대 한 수집.

2. 인 두 절단

1. 장소는 직경 35 mm 페 트리 접시에에서 벌레. 조심 스럽게 플라스틱 전송 피펫으로 사용 하 여 접시에서 모든 planarian 물 제거.
   참고: 20 6 mm 웜 최대이 크기의 접시에 편안 하 게 가질 수 있습니다.
2. 현미경 아래 접시를 놓고 여러 벌레를 동시에 볼 수 있도록 확대 조정 (예: 10 배 확대). 100mm 나트륨 아 지 드 솔루션에 planarian 물을 바꿉니다.
   참고: 35 mm 페 트리 접시, 나트륨 아 지 드의 약 5 mL는 충분 합니다. 솔루션에는 planarians 잠수함 완전히 한다. 필요에 따라 더 큰 접시를 위한 솔루션 볼륨을 조정 합니다.
3. 현미경 및 이동 하는 첫 번째 3-4 분 요리에서 후 렴에서 동물을 모니터링 합니다.
4. 인 두의 돌출; 현미경을 통해 관찰 인 두 인 두 주머니에서 밀려 나 되며 완전히 확장 (길이 약 1 m m) 그림 1B와 같이.
   참고: 그것은 인 두 더 진행 하기 전에 완전히 확장 완료 될 때까지 대기 하는 것이 중요입니다. 인 두는 동물에서 나온다, 일단 전체 확장 약 1 분 걸립니다.
5. 사용 하 여 플라스틱 전송 피펫으로 접시 주위 동물 물 총. 피펫으로에 동물을 빨 아 하 고 강제로 그들을 풀어 접시에 몇 번. 이 활기찬 pipetting 인 두 완전히 확장, 분리를 발생 합니다.
6. 그림 1C와 같이 또는 그것의 길이 따라 세로 또는 가로로 미세 집게 ( 재료의 표참조)의 쌍을 사용 하 여 그것의 둘레에 따라 인 두를 파악. 집게에 슬쩍 하는 인 두와 함께 위쪽으로 초승달 모양으로 동물을 들어올립니다. 동물 발생으로 표면 장력 동물 로부터 분리 하 인 두를 발생 합니다.
   참고: 강력한 소용돌이 없는 적절 한 작은 동물 (1-3 m m 길이)의 pharynges를 제거 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다. 파고 또는 다른 동물의 신체 부상 하지 마십시오.
7. 전송 피펫으로 사용 하 여 신선한 planaria 물을 포함 하는 새로운 요리를 절단된 동물을 이동 합니다.
8. 일단, 절단된 동물 planaria 물, 완전히 교환 물 세 번에 철저 하 게 린스. Gentamicin의 50µg/mL와 planaria 물을 포함 하는 새로운 접시에 전송.
   참고: 이러한 세 가지 세척 하는 동안 완전 한 버퍼 교환 나트륨 아 지 드의 제거를 위해 필수적입니다.
9. 다음 날, 신선한 planaria 물 gentamicin의 50 µ g/mL를 포함 하는 접시에 물을 바꿉니다. 그 후 모든 다른 일을 반복 합니다.

3입니다. 절단 후 인 두 제거의 평가

1. 그림 2A와 같이 어두운 장소는 인 두의 성공적인 제거 후 등장 했다 여부 결정 (10-20 배 확대)와 현미경 동물을 검사 합니다.
2. 또는, 수정 하 고 표 백제 피어슨 연구진이 설명 하는 프로토콜에 따라 동물 ²⁰. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 streptavidin 붙일 활용에 하룻밤 담가 동물 (1 mg/mL 희석 1: 500 X 0.3%를 포함 하는 인산 염 Buffered 염 분 1에 트리톤 X). 80% glycerol/20% 1 X 인산 Buffered 염 분 및 형광 stereomicroscope (그림 2B) 아래 이미지에에서 슬라이드에 동물을 탑재 합니다.
   참고: 이 원고에 있는 모든 이미지는 1.0 X 목적으로 형광 stereomicroscope에 체포 했다.

4. 먹이 행동을 측정 하 여 인 두 중생의 평가

1. 간의 준비
   1. Microcentrifuge 또는 원뿔 튜브로 간 붙여넣기의 필요한 수량을 전송 합니다. 짧게 공기 방울을 제거 하려면 회전. 간, 양을 견적 하 고 그 볼륨의 1/5와 빨간 식용 색소의 총 볼륨의 2 %planaria 물 추가. 예를 들어 1000 µ L 간 붙여넣기를 planaria 물 200 µ L 24 µ L의 식용 색소를 추가 합니다.
   2. Using 플라스틱 유 봉, 피 펫 팁 또는 금속 주걱, 식용 색소는 간 붙여넣기에 고르게 분포 되어 때까지 철저 하 게 혼합. 다시 짧게 스핀. 간 붙여넣기 24 h 4 ° C에서 저장 하거나 장기 저장을 위한-80 ° C에서 aliquots에 동결 될 수 있습니다.
   3. 최대 25 동물 테스트, 접시 (약 1 µ L 당 동물 간 붙여넣기의) 당 간 붙여넣기의 25 µ L를 준비.
2. 동물 먹이
   1. 화학 절단 후 7 일 새로운 배양 접시에 동물을 전송. 10-15 동물 테스트를 사용 하 여 35mm 접시; 15 동물 60 mm 페 트리 접시에 시험 되어야 한다. 어둠 속에서, 그대로, 약 1 시간 전에 수 유에 대 한 동물을 유지.
   2. 가 위를 사용 하 여, 좁은 엔드의 ½ cm 대략 트리밍에 의해 P200 피 펫 팁의 너비를 늘립니다. 피펫으로 25 µ L의 접시에 빨간 간 붙여넣기.
      참고: 트리밍 끝 pipetting 점성 간 붙여넣기 쉽게 만든다. 간 표면에 떠 있는 않도록 분배 하는 동안 접시의 바닥에 팁을 터치 합니다.
   3. 30 분 동안 먹을 동물을 수 있습니다.
   4. 흰색 바탕에 동물을 배치 하거나 10-20 배 확대 현미경 아래에서 그들을 검토 하 여 먹은 동물의 수를 점수.
   5. 수 유, 후 간 접시에서 제거 하 고 청소 합니다.

결과

나트륨 아 지 드에 노출 동물 스트레칭 하 고 몸부림을 일으키는 planarians의 정상적인 운동 성 방해. 이러한 움직임은 동물의 복 부 측에서 등장 하는 인 두 고 나트륨 아 지 드 솔루션에서 약 6 분, 후 인 두의 흰색 팁을 볼 수 있다 (그림 1B-왼쪽된 패널). 몇 분 후, 동물 적극적으로 계약 하 고 완전히 몸 밖으로 강제로 그것을 추진 하 여 인 ...

토론

이 프로토콜 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 인 두의 선택적 절제 하는 방법을 설명 합니다. Planarians에 다른 대상된 제거 연구 대뇌²¹ 또는 약리 치료 dopaminergic 신경²²ablate을 제거 하려면 수정된 수술을 사용 했습니다. 기존 방법에 비해 화학 절단의 중요 한 장점 중 하나입니다 그것은 수술을 요구 하지 않습니다. Planarian 시체의 나머지 부분에 비해 인 두의 경직 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)	Fisher Chemical	C79-3	Montjuïc salt solution
Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)	Fisher Chemical	M65-3	Montjuïc salt solution
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2)	Acros/VWR	41341-5000	Montjuïc salt solution
Potassium Chloride (KCl)	Acros Organics/VWR	196770010	Montjuïc salt solution
Sodium Chloride (NaCl)	Acros Organics/VWR	207790050	Montjuïc salt solution
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Acros Organics/VWR	123360010	Montjuïc salt solution
Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot	ThermoFisher Scientific/VWR	2324-0015	Storing planaria water
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands	Amazon	Planaria water
Gentamicin Sulfate	Gemini Bio-products	400-100P	Planaria water
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Mincing liver
Disposable pastry bags-16”, 12 pack	Wilton	Amazon	Liver aliquots
5 mL syringes	BD/VWR	309647	Liver aliquots
Petri dishes-35mm/60mm	Greiner Bio-One/VWR	82050-536/82050-544
Plastic containers (various sizes)	Ziploc	Amazon	Housing planarians in static culture
Sodium Azide	Sigma	S2002
Transfer pipette	Globe Scientific	138030
Forceps - Dumont Tweezer, Style 5	Electron Microscopy Sciences	72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100	Sigma	T8787
DAPI	ThermoFisher	62247
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-1