신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

요약

지 루트 중추 (DRG) 주 문화 자주 생리 기능 또는 감각 신경에서 병리학 관련 이벤트를 공부 하는 데 사용 됩니다. 여기, 허리 DRG 문화 neuropeptide FF 수용 체 선택적 길 항 제와 함께 2 자극 입력 신경 전달 물질의 릴리스를 감지를 사용 하 여를 설명 합니다.

초록

지 루트 신경 절 (DRG) 포함 감각 뉴런의 셀 시체. 신경의이 유형은 의사는 유 니 폴라, 주변 조직, 피부, 근육, 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경의 척수 등 혼을 자극 하는 두 개의 축 삭과 이다. 감각 뉴런 체세포 센 세이 션, 터치, 고통, 열, 및 고유 감각을 포함 하 여 전송 합니다. 따라서, DRG 기본 문화 nociception의 셀룰러 메커니즘, 감각 신경, 신경 발달의 생리 기능 연구에 널리 사용 됩니다. 교양된 신경 생리학, 신호 변환, 신경 전달 물질 방출, 또는 칼슘 이미징 연구에 적용할 수 있습니다. DRG 기본 문화권, 과학자 들은 단일 생 화 학적 변화를 모니터링 끊된 DRG 뉴런 문화 수 있습니다 또는 vivo에서 실험과 관련 된 많은 한계를 극복 하는 여러 셀. 에 비해 상업적으로 사용 가능한 DRG hybridoma 세포 선 또는 불멸 하 게 DRG 신경 세포 선, 구성 및 1 차 셀의 속성은 감각 신경 조직에 훨씬 더 비슷합니다. 그러나, 하나의 동물에서 격리 될 수 있는 교양된 DRG 1 차 셀의 제한 된 수의 그것은 연구 대상으로 하는 약물에 대 한 높은 처리 화면을 수행 어렵다. 현재 문서에서 DRG 컬렉션 및 문화를 위한 절차를 설명 합니다. 또한, 우리 교양된 DRG 셀 neuropeptide FF 수용 체 타입-2의 주 작동 근 유도 펩타이드 신경 전달 물질 (칼 시 토 닌 유전자 관련 펩 티 드 (CRGP)와 물질 P (SP))의 릴리스 (NPFFR2)의 처리를 보여 줍니다.

서문

감각 뉴런의 셀 시체 DRG 안에 포함 되어 있습니다. 이러한 뉴런 의사 유 니 폴라 그리고 주변 조직 및 중앙 신경 시스템을 자극. 근육, 피부, 내장 기관, 뼈, 다른 조직. 중에서 발견 되는 감각 신경의 말 초 신경 엔딩 그들은 신경 척수 등 쪽 뿔과 신호에서 엔딩 다음 체세포 센 세이 션^1,2의 다른 상승 통로 통해 두뇌에 전송 주변 감각 신호를 전송 합니다. 체세포 센 세이 션 (즉, 터치, 고통, 고 열 감각)을 인식 하는 움직임과 공간 방향 (고유 감각)^1,3시체가 있습니다. 4가 있다 골격 근육, 피부, 몸의에 응답 하는 그룹 II (Aβ) 섬유의 proprioception 응답 그룹 III (Aδ) (Aα) 섬유 및 그룹 V (C) 고통에 응답 하는 등 기본 구심 축 삭의 서브 그룹 I 고 온도입니다. 나머지는 다른도로 myelinated만 C 섬유 myelinated, 하지 않습니다.

Nociceptors는 기본 감각 신경, 수행 조직 손상에 대 한 잠재적인 유해 자극 (기계적, 열, 및 화학 자극)에 의해 활성화 됩니다. 이러한 신경 myelinated Aδ 섬유 및 unmyelinated C 섬유^1,4구성 됩니다. 신경 성장 인자 (NGF, trkA 수용 체), CGRP, 및 sp. 수용 체를 표현 하는 Aδ 섬유 C 섬유는 peptidergic 및 peptidergic가 아닌 C 섬유로 분류 됩니다. 다른 한편으로, 비 peptidergic C 섬유 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF, RET, 그리고 GFR 수용 체), isolectin IB4, 및 ATP 문을 단 이온 채널 하위 (P2X3)^5,,67에 대 한 수용 체를 표현 한다. Nociceptors는 이온 채널의 식에 의해 구별 될 수 있으며 neurotrophic 요인에 의해 활성화, cytokines, neuropeptides, ATP, 또는 다른 화학 화합물⁸. 자극, 시 신경 전달 물질, 포함 CGRP, SP, 그리고 조미료 nociceptive 신호²전송 하 등 척추 경적에 감각 신경 터미널에서 해제 될 수 있습니다. DRG는 뉴런의 구성 뿐만 아니라 그러나 또한 위성 glial 세포를 포함. 위성 세포는 감각 뉴런을 둘러싸고 고 기계 및 대사 지원^9,10를 제공 합니다. 흥미롭게도, 거기에 위성 glial 세포는 DRG에 통증 감각¹¹조절에 관련 되어있을 수 있습니다 나타내는 증거의 성장 시체가입니다.

감각 뉴런 가장 자주 사용 하는 기본 신경 세포¹² 고 전기 생리학, 신호 변환, 및 신경 전달 물질 방출 연구 활용 보고 되었습니다. 그들은 또한 일반적으로 신경 개발, 염증 성 통증, neuropathic 고통, (같은 가려움증), 피부 감각 및 축 삭 가지^12,13,,1415의 세포 메커니즘을 탐구 하는 데 사용 됩니다. DRG 기본 문화 실험 과목에서 수행할 수 없는 연구를 수행 하는 과학자를 수 있도록 단일 또는 여러 셀에 생 화 확 적인 변화를 평가 하기 위해 해리 뉴런으로 양식 수 있습니다. 최근, DRG 변환 연구¹⁶에 크게 혜택을 받을 수 있는 인간 장기 기증자에서 성공적으로 경작 했다. 다른 한편으로, 감각 신경으로 DRG explants 교양도 수 있습니다. DRG explants Schwann 세포 등 위성 glial 세포, 신경 세포의 원래 조직 아키텍처를 유지 하 고 특히 유용¹⁷신경 및 비 신경 세포 간의 상호 작용을 공부. DRG 주 문화는 2.5 h 이내 쉽게 준비 될 수 있습니다. 셀 구성 및 속성은 소스, DRG의 반사 고 등, 특정 DRG (요 추 또는 흉부 DRG) 실험 수요에 따라 수집 될 수 있습니다. 배아 및 신생아 DRG 뉴런의 문화 필요 NGF 생존과 축 삭 파생물을 유도 하지만 성인 뉴런의 문화 미디어^12,17에 neurotrophic 요인의 추가 요구 하지 않습니다. 또한 상용 DRG hybridoma 세포 라인 ND7/23, F11, 실험 동물의 사용을 필요로 하지 않는 등이 있다. 그러나, 일시적인 수용 체 잠재력 양이온의 부족 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 식 (작은 감각 nociceptive 뉴런에 대 한 중요 한 표식) 및 부적당 유전자 식 프로필 제한¹⁸그들의 응용 프로그램. 최근, 라인 쥐 (50B11)¹⁹ 에서 파생 된 DRG 신경 세포를 불멸 하 게 마우스 (MED17.11)²⁰, 위해 적당 한에서 사용 높은 처리량 스크린 연구 대상으로 하는 약물에 대 한. 그러나, 유전자 발현 프로 파일링이 셀 라인을 아직 수행할 수 있다. 따라서, 감각 신경 세포를 불멸 하 게 세포를 비교 검증 실험은 여전히 진행 중입니다.

NPFFR2는 DRG에 합성 이며 척추 등 쪽 뿔²¹에 감각 신경 터미널 translocated. 이 문서에서 우리는 요 추 DRG 세포를 배양 하 고 신경 전달 물질, CGRP와 sp.의 분리를 유도 하는 NPFFR2의 길 항 제와 함께 그들을 치료에 대 한 프로토콜을 제공 NPFFR2에 대 한 의존 더 NPFFR2 작은 간섭 RNA (siRNA), 교양된 DRG 셀으로 페 수를 사용 하 여 테스트 됩니다.

프로토콜

실험 동물을 사용 하는 여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 장 공 대학 (13-014 곳)에 의해 승인 되었다.

1. 실험 쥐에서 요 추 DRG 수집

1. 요 추 DRG 컬렉션에 대 한 3 주 된 Sprague-Dawley (SD) 쥐에 2를 사용 합니다.
   참고: DRG 뉴런 쥐에서 4 주 이상 수집 여기에 설명 된 문화 조건 하에서 잘 성장 하지 않습니다.
2. 압력솥에 모든 수술 기구를 소독.
3. Tiletamine 및 zolazepam (20 mg/kg, 복 주입 (IP))의 1:1 혼합물으로 쥐를 anesthetize 하 고 동물 발가락 꼬 집 음 시험에서는 발 철수 응답 될 때까지 기다립니다.
   참고: 다른 마 취 전략이이 프로토콜에 성공적으로 사용할 수 있습니다.
4. 상업적인 단두대로 잘린 여 쥐를 희생.
5. 단두대를 사용 하 여 격리 forelimb와 대 퇴 골 사이 쥐의 몸 트렁크. 수집 지역의 다이어그램 그림 1A 를 참조 하십시오.
   참고: 꼬리 커트 라인 대 퇴 골에 그냥 rostral 이어야 한다. 요 추 L6 DRG 컷된 사이트는 척추에서 너무 높은 경우 excised 될 것입니다.
6. 흉 골을 따라 고 해 부가 위 (그림 2A-) 모든 장기/조직 제거.
7. 쥐의 등 쪽 부분을 수집 하 고 피부를 제거 하는 트렁크의 측면을 따라 자릅니다. 해 부 등 트렁크의 사진 그림 1B 를 참조 하십시오.
8. DRG를 수집 하기 전에 얼음에 티슈를 준비 합니다. 모피와 장갑, 혈액을 청소 하 고 단계로 진행 하기 전에 75% 에탄올으로 소독.
9. 요 추 척추를 취재 하는 근육을 제거 합니다. 첫째, 척추 (왼쪽과 오른쪽)의 측면을 따라 두 개의 상처와 한 측면 허리 척추의 rostral 범위를 표시 하 게. 그런 다음, 뼈 절단 겸 자 (그림 2A-b)와 척추의 등 쪽 근육을 제거 합니다.
10. 뼈 절단 집게와 척추의 등 쪽 부분을 제거 하 고 척수를 노출.
11. 해 부가 위 (그림 2A-c) 및 집게 (그림 2A-d) 척수를 제거 합니다.
12. 마지막 갈비뼈 (흉부 척추 13)에서 척추를 계산 하 여 요 추 DRG를 식별 합니다. 그림 1C 척추 위치의 다이어그램을 참조 하십시오.
13. 2 mL 차가운 혈 청 무료 매체와 35 m m 문화 접시에 양측 허리 DRG (L1-L6) 마이크로-가 위 (그림 2A-f)를 수집 합니다. 신경 섬유 (같이 그림 1C) DRG, 연결에서 다음 문화의 순도 향상 시키기 위해 문화 접시에 그것을 전송.
    참고: 수집된 DRG 1 시간 약에 대 한 얼음에 매체에 보관 수 있습니다. 한편, 여러 쥐 DRG의 더 큰 수영장을 만들려면 안락사 될 수 있습니다.

2. 기본 문화 쥐 목재 DRG의

참고: 다음 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.

1. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 mM 나트륨 pyruvate 그리고 1에서 1 x 페니실린/스 문화 매체를 준비 DMEM F12 x.
2. 외 투 세포 배양 24-잘 접시 200 µ g/mL 폴 리-L-리 신 2 h에 대 한 다음 멸 균된 물으로 세척 처리.
3. 전 적어도 30 분 동안 사용 하기 전에 37 ° C CO₂ 배양 기에서 1 mL 문화 매체와 문화 접시를 품 어.
4. 층 류 후드에 DRG 포함 35 m m 접시를 전송 하 고 피 펫에 의해 혈 청 무료 매체와 DRG 3 번 씻어.
   참고: 접시의 외부 청소 되어야 한다 75% 에탄올과 후드로 전송 하기 전에. 35 mm 접시 DRG (이 실험 디자인의 요구에 따라 달라 집니다) 쥐의 숫자에서를 포함할 수 있습니다.
5. 이동은 DRG (단일 쥐에서 여러 쥐에서 결합 또는) 새로운 35mm 문화 요리를 멸 균 핀셋 (그림 2A-e)와 콜라 유형 IA의 2 mL (1 mg/mL 혈 청 자유로운 매체에) 포함.
   참고: 콜라 솔루션은 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여 살 균 되어야 한다.
6. 30 분 동안 37 ° C CO₂ 배양 기에서 콜라 솔루션에서 DRG 다이제스트.
7. 콜라 솔루션을 제거 하 고 세척 2 ml 행 크의 DRG 3 번 균형 소금물 (HBSS).
   참고: 있을 수 있습니다 잔여 섬유 또는 솔루션으로는 DRG 내려와 조직. 피 펫 세척 솔루션으로 그들을 제거 합니다.
8. 2 mL 중 DRG 포함 35 mm 접시 및 다이제스트 30 분 동안 37 ° C CO₂ 배양 기에서 DRG로 0.05% 트립 신-EDTA를 예 열을 추가 합니다.
9. DRG 포함 된 솔루션의 2 개 mL를 이동 15 mL 원심 분리기 튜브 유리 피 펫에 의해.
   참고:는 DRG 수에 충실 유리 피펫은 그래서 주의이 단계를 수행 해야 합니다. 유리 피 펫 (약 0.5 mL)의 테이퍼 끝에서 DRG 포함 된 솔루션을 유지 하 고 천천히 솔루션 원심 분리기 관으로 전송 하지 않고 일시 중지 DRG 손실을 방지할 수 있습니다.
10. 290 x g 4 ° c.에서 5 분에 솔루션을 원심 제거는 상쾌한 고 다른 2 mL 혈 청 무료 매체는 DRG resuspend를 추가 합니다.
11. 지난번에 2 회 변경 하지만 단계 2.10 미리 데워 진된 문화 매체를 혈 청 자유로운 매체를 반복 합니다.
12. DRG 약 60 번 불꽃 연마 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 수동으로 triturate (길이 230 m m와 팁 머리 내경 1 m m). 비 광택 피 펫을 불꽃 연마 파스퇴르 피펫으로의 오리 피스를 비교 하는 사진에 대 한 그림 2B를 참조 하십시오.
    참고: 내부 불꽃 연마 파스퇴르 피 펫의 직경은 약 10% 제어 피 펫 보다 작은 및 테이퍼 끝의 안쪽 부드러운 되어야 합니다. 세포를 분쇄 할 때 거품을 만들 수 없습니다 주의 해야 합니다.
13. CO₂ 배양 기에서 폴 리-L-리 신-코팅 접시를 제거 합니다. 요리에서 incubated 문화 매체를 발음 하 고 코팅된 접시에 해리 셀 씨.
14. 씨앗 한 쥐 (양자 컬렉션에서 L1-L6, 12 총 DRG)에서 DRG 셀 24-잘 접시; 4 웰 스도 24-잘 접시의 한 잘에 약 5 x 10⁴ 의 세포가 있다.
    참고:이 밀도 출시 CGRP 또는 SP의 검출에 적합 하 고 또한 immunostaining에 적합. 서쪽 오 점 또는 RNA 추출, 6 잘 플레이트의 한 음에 한 쥐 (양자 L1-L6)에서 DRG 셀 씨.
15. 10 µ M cytarabine (아 라-C)의 추가 함께 다음 날에 문화 매체와 100 ng/mL NGF, 교체 하 고 새로 매체 그 후 매 2 일.
    참고: 흉부 DRG 또한 수 또한 될 교양이 프로토콜에 의해 흉부 척추에서 수집 된 있다.

3. transfection DRG 셀에 NPFFR2 siRNA의

1. NPFFR2 siRNA의 transfection를 수행 하 고 siRNA 제조 업체의 프로토콜에 따라 제어.
   참고: 프로토콜 경우 선택한 transfection 시 약은 우리가 사용 하는 한에서 다른 적응 해야 합니다 ( 테이블의 자료를 참조).
2. 셀 도금 후 3 일에 0.5 mL 전 따뜻한 혈 청 무료 매체 매체를 변경 하 고 1 시간에 대 한 37 ° C CO₂ 배양 기에서 DRG를 품 어.
3. 추가 50 12.5 µ L 세럼 무료 중간에 (1 µ L RNase 무료 물)에 siRNA의 nM.
4. 10 µ L 혈 청 자유로운 매체에 2.5 µ L transfection 시 약을 추가 합니다.
5. 실 온에서 10 분을 위한 단계 3.3 및 3.4 여 플라스틱, 그리고이 혼합된 transfection를 품 어 솔루션에서 솔루션을 믹스.
6. Transfection 솔루션 한 DRG 포함 된 24-잘 접시에 추가 하 고 부드럽게 흔들어 매체 솔루션을 혼합.
   참고: 여러 transfection 솔루션 동시에 여러 우물 페 될 필요가 있는 경우 배포 한다.
7. 6 h에 대 한 37 ° C CO₂ 배양 기에서 DRG를 품 어.
8. 0.5 mL를 추가/문화 매체의, 포함 된 20% 태아 둔감 한 혈 청 100 밀리미터 나트륨 pyruvate, 1 x 1에서 페니실린/스 x DMEM-F12, 10 µ M 아 라-C와 100 ng/mL NGF, 24-잘 접시에 추가.
9. 또 다른 66 h (새로 고침 48 h에 매체)에 대 한 37 ° C CO₂ 배양 기에서 DRG를 품 어.

4. 기본 DRG 세포에서 신경 전달 물질의 방출

1. 하루 6 셀 (72 h siRNA transfection 후)를 도금 했다, 후 200 µ L 세럼 무료 매체, 문화 매체를 변경 하 고 30 분 동안 37 ° C CO₂ 배양 기에서 세포를 품 어.
2. 1 µ L 자극 chemical(s)를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 미디어 믹스. 지정 된 시간에 대 한 37 ° C 공동₂ 인큐베이터에 접시를 품 어.
   참고:이 문서에서는, 경작된 한 세포 했다 자극 NPFFR2 주 작동 근, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-페-NH₂, 5 nmol)와 1 시간에 대 한.
3. 문화 요리와 일시 중단 된 모든 불순물을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기에서 문화 매체를 수집 합니다.
4. 원심에서는 상쾌한을 수집 하 고 필요에 따라 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 샘플을 희석. 효소 immunoassay (EIA) 키트와 함께 신경 전달 물질의 레벨을 시험 하 고
   참고: 여기는 supernatants 했다 희석된 1: 100 CGRP의 수준을 분석 하기 전에. 상쾌한 sp.의 수준을 분석 하기 전에 희석 하지는

5. CGRP와 SP EIA

1. 즉시 CGRP 또는 SP EIA 키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 샘플을 분석 합니다.
   참고: 프로토콜 사용 하는 장비에 따라 달라 집니다.
2. 워시 버퍼 키트에서 제공 된 5 번 CGRP EIA 웰 스 린스 합니다.
3. CGRP EIA 우물으로 100 µ L 안티 CGRP acetylcholinesterase (통증) 추적 프로그램으로 100 µ L 샘플을 추가 하 고 50 µ L 샘플 50 µ L 안티-SP 통증 추적 프로그램, 50 µ L 안티-SP 원으로 SP EIA 우물에 추가.
4. 키트 내에서 제공 되는 플라스틱 필름 CGRP와 SP 우물을 봉인.
5. 4 ° c.에 하룻밤 우물을 품 어
6. 5 번 CGRP와 웰 스 워시 또는 SP 버퍼를 세척 하 고 우물에서 모든 잔여 솔루션을 제거.
7. 해당 EIA 키트 내 공급 CGRP 또는 SP 우물에 덮어 200 µ L의 시 약을 추가 합니다.
8. 실 온에서 30 분 동안 CGRP 웰 스를 품 어 고 실 온에서 90 분 동안 SP 웰 스를 품 어. 두 분석 실험에 대 한 빛에서 우물을 보호 합니다.
9. Nm 파장 414 번호판 읽기 및 해당 EIA 악기에 따라 결과 계산.
   참고: 항상 손으로 우물의 바닥을 만지지 마십시오 고 Ellman의 시 약을 추가 하기 전에 물티슈를 청소 하는 렌즈에 의해 잘 아래에서 물 얼룩을 청소.

결과

24-잘 접시에 배양 쥐 요 추 DRG 뉴런 glial 세포 증식을 억제 하기 위해 추가 아 라-C와 신경 성장을 지원 하기 위해 NGF 문화 매체에서 성장 했다. 생활의 형태 DRG 세포 관찰 되었다. 그림 3에서 같이, 단일 뉴런의 세포 체 하루 1 접시의 바닥에 연결 되었고 관찰에 대 한 선택. 축 삭 성장 하루 1-3에서에서 모니터링 했다. Glial 세포 복제 하 고 프로세스를 둘...

토론

현재 문서에서 수집, 효소 분리 및 쥐 요 추의 문화 시연 DRG. NGF는 科 지원, DRG 뉴런의 축 삭 셀 시드 후 3 일 이내 연장. 확장된 축 삭 후 셀 셀 소마에서 합성 되 고 축 삭 섬유 따라 전송 CGRP 단백질에 대 한 스테인드 했다 명확 하 게 관찰 했다. 위성 세포 또한 확장을 일 이내 뉴런을 둘러싸고이 나누어 glial 세포를 허용 처리 합니다. 이 프로토콜에 의해 성장 주 DRG 세포는 감각 신경 조절 세포 메커?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)	Virbac	Zoletil 50	anaesthetic
Fetal bovine serum	Biological Industries	04-001-1	Culture Medium
sodium pyruvate	Sigma	S8636	Culture Medium
penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-033-1	Culture Medium
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Culture Medium
Poly-l-lysine	Sigma	P9011	Coating dish
Collagenase IA	Sigma	9001-12-1	Enzyme digestion
Hank's balanced salt solution	Invitrogen	14170-112	Culture Medium
Trypsin EDTA	Biological Industries	03-051-5	Enzyme digestion
Pasteur pipette	Hilgenberg	3150102	Cell trituration
Cytarabine (Ara-C)	Sigma	C6645	Culture Medium
NGF	Millipore	NC011	Culture Medium
NPFFR2 siRNA	Dharmacon	L-099691-02-0005	Transfection
Non-targeting siRNA	Dharmacon	L-001810-10-05	Transfection
NeuroPORTER Reagent	Genlantis	T400150	Transfection reagent
dNPA	Genemed Synthesis	N/A	NPFFR2 agonist
CGRP ELISA	Cayman	589001	EIA
SP ELISA	Cayman	583751	EIA
CGRP antibody	Calbiochem	PC205L	IHC
DAPI	Roche	10236276001	IHC