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요약

여기 prenylation과 guanosine-5'-3 인산 염 (GTP)를 조사 하는 프로토콜 설명-Rho GTPase의 로드. 이 프로토콜 두 가지 상세 방법의 구성, 즉 막 분류 및 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과. Prenylation와 GTP를 측정 하기 위한 프로토콜을 사용할 수 있습니다 다른 작은 GTPases 다른 로드.

초록

Rho GTPase 가족 Ras superfamily 속하는 고 인 간에 있는 약 20 명의 회원을 포함 한다. Rho GTPases cytoskeletal 역학, 세포 운동 성, 세포 극성, axonal 지침, 기공을 밀매 및 세포 주기 통제를 포함 하 여 다양 한 세포 기능 조절에 중요 하다. Rho GTPase 신호에 변화는 암, 중추 신 경계 질환, 면역 시스템에 종속 질병 등 많은 병 적인 조건에서 필수적인 규제 역할을 재생합니다. (즉, mevalonate 통로 중간에 의해 prenylation)로 GTPases 그리고 GTP 바인딩 posttranslational 수정이이 단백질의 활성화에 영향을 미치는 중요 한 요소는. 이 문서에 두 가지 필수 및 간단한 방법 Rho GTPase의 광범위 한 범위 prenylation 및 GTP 바인딩 활동 감지 제공 됩니다. 사용 된 기술 절차의 세부 사항 설명 단계가이 원고에서.

서문

Rho GTPases 작은 단백질 (21-25 kDa), 진화를 통해 잘 보존 되 고 작은 GTPases의 Ras superfamily에 독특한 subfamily를 형성의 그룹입니다. 이 superfamily 내의 각 subfamily에 공유 G 도메인 코어 GTPase 활동 및 뉴클레오티드 교환1에 관련 된 있다. 로 가족과 다른 Ras 서브패밀리가 차이 5번째 β 물가 및 작은 GTPase 도메인2에 4번째 α 나선 내의 "로 삽입 도메인"의 존재 이다.

최근의 분류에 따라, Rho GTPases Ras GTPase superfamily3에 맞는 단백질 신호의 가족으로 간주 됩니다. 포유류로 GTPases 22 회원 그들의 특정 기능 및 일반적인 특성4 RhoA, Rac1, 및 Cdc42이이 그룹에서 가장 공부 회원 가운데는에 따라 있다. Rho GTPases 분자 스위치를 통해 단백질 posttranslational 수정5에 의존 하는 긴밀 하 게 규제 메커니즘 세포내 신호 통로 통해 에 연결 된다.

GTP 로드 및 가수분해 활성화/비활성화 주기의 작은 GTPases에는 필수적인 메커니즘 고 규제 통해 GTPase 활성화 단백질 (간격). 간격은 GTP 가수분해에 대 한 책임은 GTP-로드 반응에 대 한 책임은 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (조달)와 협력 하 여 작업 하 고. 로 GDP 분리 억제제 (GDIs) 추가 GDP 바인딩된 Rho GTPases 바인딩을 통해 작은 GTPases Rho의 제공합니다. 이 GDP 분리를 억제 하 고 작은 GTPases 활성 세포내 막 사이트에서의 격리를 용이 하 게. 또한 있다 더 뉴클레오티드 가수분해 및 교환 및 컨트롤 GDP 또는 GTP 사이클링1,6,,78GDIs의 prenylation를 포함 하는 Rho GTPase 단백질의 규칙.

GTP-로드 및 Rho GTPase prenylation는 이러한 단백질1,9닥터지 속성을 변경 하 여 cytosol와 세포 막 사이 Rho GTPase의 운동에 참여. 상기 레 귤 레이 터는 세포 막의 인지질과 GDP 또는 GTP 교류 활동10의 다른 변조 단백질 상호 작용. 또한, GDIs, 분리 억제제, GTP 가수분해와 GDP 또는 GTP exchange 모두 차단합니다. GDIs는 GDP에서 비활성 Rho 단백질의 분리 하 고, 따라서, 다운스트림 이펙터와의 상호 작용을 억제합니다. GDIs는 또한 cytosol 및 셀에서 막 사이 GTPases의 순환 조절. Rho GTPases의 활동; 세포 막에 그들의 움직임에 큰 정도에 따라 따라서, GDIs는 그들의 소수 성 지역/도메인11,12숨어 통해 세포질에서 GTPases 격리 수 있습니다 중요 한 레 귤 레이 터로 간주 됩니다.

Rho GTPase는 최적의 신호 및 기능 활성화 사이클의 모든 단계에 있는, GTP-로드/GTP 가수분해의 동적 주기 중요 하다. 이 과정에서 변경의 모든 종류 셀 함수 Rho GTPase, 세포 극성, 확산, morphogenesis, cytokinesis, 마이그레이션, 접착, 및 생존13,14등 규제에 변경 될 수 있습니다.

현재 프로토콜 제공 한다 독자 작은 RhoA GTPase 활성화를 통해 모니터링 하는 자세한 방법을 그들의 prenylation 및 GDP 또는 GTP 로드의 조사를. 이 메서드는 또한 prenylation 및 다양 한 작은 GTPases의 GTP 바인딩 감지 하 사용할 수 있습니다. GTPases Rac1, Rac2, Rac3, H, K, 또는 N-Ras, Arf, 고로15등의 다른 종류의 활성화의 수준을 측정 하는 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 사용할 수 있습니다. 최근 작은 Rho GTPase prenylation 및 활동8,9,,1416의 규칙에서 포함 되기 위하여 보고 되었다 예를 들어, 약리 에이전트 simvastatin 사용 됩니다.

프로토콜

1. 멤브레인/Cytosol 분류를 사용 하 여 RhoA 지역화의 결정

  1. 세포 문화와 simvastatin 치료
    1. 셀 100 m m에서 접시와 Dulbecco의에 문화 U251의 50000 씨가 글의 중간 (DMEM) (높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]) 수정.
    2. 때 30% 합칠 매체를 제거 하 고 simvastatin 포함 된 매체 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO]에 녹아 simvastatin의 10 µ M), 그것에 추가 하 여 셀을 취급 하 고 37 ° C8에서 36 h에 품 어. 혼자 DMSO를 사용 하 여 차량 통제로.
      참고: 10 백만 셀은 셀의 cytosol 그리고 막 분별이 필요 하다.
  2. 셀의 컬렉션
    1. 37 ° C 배양 기에서 셀을 제거 합니다. confluency 확인을 현미경으로 세포를 봐.
      참고: 셀 70%-80% 합칠 이어야 한다.
    2. 매체를 발음, 셀 1을 씻고 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 버퍼의 5 mL을 추가 (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2포4. H2소개할 140 mg/L, D-포도 당: 1000 mg, EDTA disodium: 373 mg/L) 플레이트와 셀 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 다시 장소 당.
    3. 외피의 5 분 후 EDTA로 매체의 동일한 금액을 포함 하는 15 mL 튜브에 세포와 EDTA를 수집 합니다.
      참고: 튜브에 매체를 데 EDTA를 중화 하 고 세포 막의 어떤 더 소화를 방지 합니다.
    4. 얼음 상자에 튜브를 놓고는 원심 분리기를 진행 합니다.
    5. 1500 x g 4 ° C에서 원심 분리기를 설정 하 고 5 분 동안 세포를 스핀.
    6. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 차가운 PBS의 1 mL을 추가. 셀을 잘 섞는다.
    7. 새로운 1.5 mL 튜브, 4 ° C에서 1500 x g 에서 원심 분리기를 셀 혼합물 (솔루션)를 전송 및 5 분에 대 한 셀을 회전.
    8. (다음 단계에 대 한 버퍼의 볼륨 추정)에 대 한 펠 릿 크기를 확인 하십시오. 얼음에 샘플을 놓습니다. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 완전히 삭제.
    9. (10 mM Tris HCl [pH 7.5], 0.1 mM EDTA, 0.1 m m EGTA, 1 m m dithiothreitol, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일), 혼합 샘플 잘 아래로, pipetting 차가운 버퍼를 추가 하 고, 진행 쥡니다.
  3. 쥡니다
    1. 5 사이클, 5는 sonicator 설정 s 각, 그리고 반복 3 배.
    2. 얼음에는 쥡니다를 수행 합니다. ultracentrifuge로 이동 합니다.
      참고: 얼음과 차가운 조건 단백질을 보존 하 고 더 신뢰할 수 있는 결과 만들.
  4. Ultracentrifugation
    1. 세포질로 셀 homogenates를 분리 하는 ultracentrifuge를 사용 하 여 막 분수. 4 ° c.에 35 분 100000 x g 에서 원심 분리기를 설정 그림 1에서 보듯이, 펠 릿 크기를 확인 합니다.
      참고: 막 일부분은 튜브의 맨 아래에 하 고 나머지는 다른 세포질 구성 요소.
    2. 펠 릿을 방해 하지 않도록 주의 하면서 완전히는 상쾌한을 수집 합니다. 상쾌한 cytosolic 분수입니다. 새로 분류 관에 상쾌한 장소입니다.
    3. 분리 버퍼 (버퍼 2 세)의 300 µ L 추가 (50 m Tris HCl [pH 7.5] m, 0.15 M NaCl, 1 m m dithiothreitol, 1 %SDS, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일) (막 분수를 포함 한다) 하는 펠 릿을. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
    4. 단백질 결정 및 서쪽 오 점 (immunoblot 분석) 샘플 준비를 진행 합니다.
  5. Immunoblotting
    1. 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5] 0.5 m m 0.5% 비 이온 세제-40, 100 µ M β-글리세롤 3 인산 염, 그리고 0.5% 프로 테아 제 억제 물 칵테일 PMSF)에서 분리 된 분수에서 추출 세포 단백질 준비.
    2. Lowry 방법8 을 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 고 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 0.5 밀리미터 PMSF, 0.5 %nondenaturing 세제, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µ M β-글리세롤 3 인산 염, 및 0.5%의 볼륨 계산 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 샘플 사이 단백질의 농도 정상화.
    3. 5 분 동안 90 ° C에서 샘플을 열 고 단백질을 분리 하는 15 %SDS 페이지 젤에 샘플의 15-20 µ L을 로드 합니다.
      참고: 각 샘플에 대 한 단백질의 1 µ g를 로드 합니다. 그에 따라 실행 해야 하는 볼륨을 계산 합니다.
    4. 조건 (500 nM 글리신, 50 mM Tris HCl, 및 20% 메탄올) 실 온 (RT) 100 V에서 2 h, 감소에서 나일론 막 분리 단백질을 전송 합니다.
      참고: 성공적인 단백질 전송 확인, Ponceau 얼룩 사용 하거나 멤브레인에 단백질 마커를 시각화 합니다.
    5. 5% 탈지 말린 우유와 세제 (TBS/0.01% 비 세제;를 포함 하는 1 x Tris 버퍼 염 막 차단 TBST) 특이 항 체 바인딩 또는 RT 하룻밤에 4 ° C에서 1 시간에 대 한 차단에
    6. Immunoblotting 분석에 대 한 1 차 항 체를 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
      참고:이 실험에서 Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH, 및 팬 Cadherin 사용 되었다 1에 1% 우유에 희석 1:1,000에 x TBST. 팬-Cadherin와 GAPDH 막 각각 cytosolic 분수 순도 확인에 사용 되었다.
    7. 3 막 세척 세척 버퍼 1 x 20 분에 대 한 x TBST.
    8. 반대로 토끼 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-(RT에서 1 시간)에 대 한 각 기본 항 체에 대 한 활용 된 이차 항 체.
    9. 에 말을 씻어 20 분에 대 한 3 배 향상 된 화학 (ECL) 감지 그들을 개발 하 고.

2. 작은 G-단백질 활성화 분석 결과 사용 하 여 RhoA GTP 부하의 측정

  1. 수 10, 000 셀/mL와 문화 100 m m에서 U251 셀 접시.
  2. 1.1.2 단계에서 설명한 대로 30% 합칠 때, 셀 simvastatin 취급 합니다.
  3. 인큐베이터에서 배양 배지를 가져온다. Confluency 확인 하려면 현미경 세포를 봐. 셀 70%-80% 합칠 인지 확인 합니다. 얼음에 페 트리 접시를 놓고, 미디어, 발음 및 3 셀을 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS (pH 7.2) x.
  4. PBS 발음 PBS의 모든 잔재를 제거 하는 추가 분에 대 한 얼음에 페 트리 접시를 기울기.
    참고: 잔여 PBS는 부정적인이 분석 결과 적용 됩니다.
  5. 셀 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제를 포함 하는 얼음 세포의 용 해 버퍼의 700 µ L 볼륨에 lyse
    참고: 700 µ L는 일반적으로 충분히 100 mm 페 트리 접시에 대 한. 표 1 각 문화 선박에 대 한 적절 한 볼륨을 찾을 수를 참조 하십시오.
  6. 셀 스 크레이 퍼와 세포 lysate를 수확. 이 기술에 대 한 문화 접시 경사.
  7. 레이블이 지정 된 얼음 cryotube는 lysate 전송 하 고 얼음에 그것을 유지.
  8. 소용돌이 사용 하 여 철저 하 게 혼합. 단백질 분석 결과, 샘플에서 단백질 농도 측정에 대 한 lysate의 10 µ L을 유지.
  9. 스냅-동결 나머지 세포 lysate 액체 질소.
    참고: 셀 스냅-동결 그들을 피하기 위해 RhoA GTPase의 활동의 손실에 지도할 수 있는 반복 된 냉동/해 동 주기 전에 lysate의 여러 aliquots를 준비 합니다.
  10. 스냅-냉동 cryotubes-80 ° C 냉장고를 전송 고 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 대 한 샘플을 저장 합니다.
    참고: 팬 들은 14 일 이상에 대 한 샘플의 정보를 저장 하지 마십시오. 신속 하 게 작업 하 고 10 분 이상 얼음 샘플을 떠나지 않을. 결코 동시에 모든 접시를 처리 합니다.
  11. Lowry 방법8 을 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 고 계산 샘플 사이 단백질의 농도 정상화 하는 세포의 용 해 버퍼의 볼륨.
    참고: 최고의 농도 보통 1 mg/mL; 그러나, 0.3-2 mg/mL 수 있습니다 감지.
  12. microtube에 세포의 용 해 버퍼의 60 µ L 및 바인딩 버퍼의 60 µ L을 추가 하 여 빈 컨트롤을 준비 합니다.
    참고: 빈 제어 항 원 제외 하 고 모든 시 약은 고 배경 빼기 위해 사용 된다.
  13. 12 µ L로 제어 단백질의 세포의 용 해 버퍼의 48 µ L, 바인딩 버퍼의 60 µ L을 추가 하 여 긍정적인 통제를 준비 합니다.
    참고: 긍정적인 통제는 모든 시 약 플러스로-A-GTP에 대 한 확인 된 항 원.
  14. 그 가방로 선호도 접시 하 고 얼음에 그것을 배치.
  15. 얼음 처럼 차가운 증류수의 100 µ L 우물에 분말을 디졸브. 얼음에 플레이트를 유지.
  16. 25 ° c.로 설정 물 욕조에 스냅 냉동 세포 lysates 녹여
  17. 계산 된 양의 단백질 농도 정상화에 각 샘플 (2.11 단계)에서 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
    참고: 세포의 용 해 버퍼의 구성에 변화를 초래 하지 않도록을 (를 사용 하 여 진공 튜브 흡 인기) 셀을 세척 후 PBS를 제거 합니다. 샘플 단백질 0.8 사이의 GTPase 활성화 분석 실험에서 샘플 간의 정확한 비교를 위해 2 mg/mL 농도를 맞춰야합니다 표 2 는이 분석 결과에 사용할 버퍼에 대 한 정보를 제공 합니다.
  18. 정규화 된 얼음 샘플의 60 µ L microtubes에 전송 하 고 바인딩 버퍼; 60 µ L을 추가 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 얼음에 그들을 유지.
  19. 완전히 물/솔루션에서에서 제거는 미 판 활발 한 터치 하 여 실험실 매트에 5 ~ 7 하드 도청 뒤.
  20. 중복에 우물을 정규화 된 샘플, 빈 제어, 그리고 긍정적인 통제의 50 µ L를 추가 합니다.
  21. 300 rpm에서 4 ° C에서 30 분 동안 궤도 통에 접시를 놓습니다.
    참고: 떨고 단계는 매우 중요 하다, 그리고 300 rpm에서 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하는 것이 좋습니다.
  22. 터치 하 여 접시에서 샘플을 취소 하 고 그들을 세척 2 x 200 µ L에서 실시간 적극적으로 버퍼를 세척 세척 버퍼 우물에서 각 세척 후 flicking, 두 드려서, 다음을 실시간에 벤치에 접시를 유지
  23. 각 우물에 RT 항 원 제시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 2 분에 대 한 RT에서 품 어.
  24. 우물에서 솔루션으로 터치 하 고 씻어 우물 3 실시간에 버퍼를 세척의 200 µ L x
  25. 각 우물에 갓된 1/250 안티-RhoA 1 차적인 항 체의 50 µ L를 추가 합니다.
  26. 300 rpm 설정 25 ° c에서 45 분 동안 궤도 통에 접시를 놓으십시오 우물에서 솔루션을 터치 합니다.
  27. 세척 단계 2를 반복 (단계 2.24) x.
  28. 각 우물에 갓된 1/250 안티 RhoA 이차 항 체의 50 µ L를 추가 합니다.
  29. 25 ° c.로 설정 하는 300 rpm에서 45 분 동안 궤도 통 위에 접시를 놓습니다
  30. HRP의 검출 시 약 시 약 A와 B. 시 약의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비
  31. 각 우물에서 솔루션으로 터치 한 우물 3 세척 실시간에 버퍼를 세척의 200 µ L x
  32. 각 우물에 갓된 HRP 검출 시 약의 50 µ L를 추가 합니다.
  33. 최대 신호를 적절 한 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 결과 분석 하는 3-5 분 이내 발광 신호를 읽어.
    참고: 읽기 해야 합니다 이동 3-5 분 이내 최대 신호를 얻을. "테스트 플레이트" 실행 적절 한 세포를 확인 하기 위해 버퍼 볼륨 사용 되 고 세포 lysates 단백질 농도 충분히 높은 RhoA GTPase 활동 감지. (테스트 플레이트 단백질 농도 허용 범위 내에서 떨어지는 경우 확인 하 고 적절 한 세포의 용 해 버퍼 사용 중인 볼륨 인지 확인 하는 데 사용 하는 셀의 접시가입니다.) 긍정적인 통제 읽어야 한다 4-에 10 배 빈 우물 보다 높은 선형 범위 내에 있는 경우. 그렇지 않은 경우에 루미 노 제조 업체를 컨설팅 하 여 조정 합니다. 표 3에 루미 노에 대 한 설정은 제공 됩니다.
  34. 고 열 어디 제목을 읽고 샘플, 의미, 표준 편차, rep1, rep2, rep3, rep4, 각 샘플에 수행 되는 복제의 수를 표시 하는 원시 데이터를 입력 합니다.
  35. 의미, 입력 수식 =average(Xn:Yn) 어디 X rep1, Y에 대 한 열 지정자 = = rep4, 및 n 열 지정자에 근무 중인 행의 행 번호를 =.
  36. 표준 편차 stdev (Xn:Yn) = 수식 입력 여기서 X rep1, Y에 대 한 열 지정자 = = rep4, 및 n 열 지정자에 근무 중인 행의 행 번호를 =.
  37. Rep1, rep2, 등 으로 복제 데이터를 입력
  38. 데이터를 입력 한 후 샘플, 의미, 및 표준 편차를 선택할 클릭 및 드래그 메서드를 사용 합니다.
  39. 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어에서 차트 만들기는 내부 미니 바 차트와 광장 처럼 보이는 대 한 함수를 선택 합니다.
    참고:이 차트 만드는 과정은 디자인 차트 입력 한 데이터에 따라 불가능 한다.
  40. 세로 막대형 차트 를 선택 하 고, 입력된 값에 대 한 의미 번호 지정.
    참고: 의미 숫자에 대 한 차트를 만든 처음, 그리고 y 축 오차 막대에 대 한 표준 편차 열 지정 다음. 이렇게 하려면 그래프 막대를 두 번 클릭 하 고, y 축 오류 탭을 선택 하 고, 사용자 지정 옵션을 클릭 한 표준 편차 데이터의 위치를 입력 하려면 워크시트에서 영역을 선택. 원하는 차트의 창조 후에 비교 하는 데 필요한 그룹 사이의 차이 볼 수 있습니다.

결과

막의 분류:

Ultracentrifugation 막과 cytosol 부품의 분류를 위해 사용 되었다. 그림 1에서 보듯이 상쾌한 cytosolic 분수를 포함 하 고 펠 릿 포함 막 분수. U251 세포에서 얻은 cytosolic andmembrane 분수에 RhoA의 풍부한 simvastatin immunoblotting를 사용 하 여 함께 치료 후 시험 되었다. 순 결 하 고 막 그리고 cytosol...

토론

여기는 작은 GTPase prenylation 및 작은 GTPase subcellular 지 방화 (cytosol 대 막)와 로드로 GTP로 표시 하는 GTP 바인딩 측정 하는 정확한 방법에 설명 합니다. 작은 GTPases 진 핵 세포에 표현 되 고 세포질 확산, 운동 성, 및 구조에서 필수적인 역할. Prenylation와 GTP 바인딩 GTPase 활동의 규칙에 관련 된 따라서, prenylation 및이 단백질의 GTP 바인딩 분석 실험 세포 생물학1,

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

Saeid Ghavami 건강 과학 센터 운영 부여, 부여와 연구 매니토바 새로운 탐정 운영 보조금 운영 하는 CHRIM에 의해 지원 되었다. 자바드 Alizadeh 연구 매니토바 재학에 의해 지원 되었다. Shahla Shojaei MITACS 가속 박사 친목 건강 과학 재단 운영 보조금 지원 했다. 아 델이 Moghadam 조셉 W. 고 든에 의해 개최 되었다 그랜트를 운영 하는 NSERC에 의해 지원 되었다. 아미르 A. Zeki NIH/NHLBI K08 수상 (1K08HL114882-01A1)에 의해 지원 되었다. 마렉 J. 로스 친절 하 게 인정에서 지원 NCN #2016/21/B/NZ1/02812, 고급 연구 (지역 센터-발 드 루아르, 프랑스)의 스마트 루아르 밸리 일반 프로그램을 통해 르 STUDIUM 연구소에서 지원 하 고 공동 투자는 마리에 의해 퀴리 Sklodowska 작업 # 665790를 부여 합니다. 시몬 다 실바로 사 UMGF 재학에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM high GlucoseVWR (Canada)VWRL0101-0500
Fetal Bovine SerumVWR (Canada)CA45001-106
Penicillin/StreptomycinVWR (Canada)97062-806
EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid)VWR (Canada)CA71007-118
EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid)VWR (Canada)CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Dithiothreitol)VWR (Canada)CA97061-340
Ammonium PersulfateVWR (Canada)CABDH9214-500G
Tris-HydroxymethylaminomethaneVWR (Canada)CA71009-186
30% Acrylamide/Bis SolutionBiorad (Canada)1610158
TEMEDBiorad (Canada)1610801
Protease Inhibitor cocktailSigma/Aldrich (Canada)P8340-5ML1:75 dilution
Rho-GTPase Antibody Sampler KitCell Signaling (Canada)99681:1000 dilution
Pan-Cadherin antibodyCell Signaling (Canada)40681:1000 dilution
GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology (USA)sc-697781:3000 dilution
RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format)Cytoskeleton Inc. (USA)BK121Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016.
RhoA AntibodyCell Signaling2117
ECLAmersham-Pharmacia BiotechRPN2209
Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibodySigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate ReaderMolecular Devices 1612071ASpectrophotometer
Nonidet P-40Sigma11332473001non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol
DMSOSigmaD8418-50ML
PBSSigmaP5493-1L
Phophatase Inhibitor cocktailSigmaP5726-5ML1:75 Dilution

참고문헌

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