형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

요약

여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.

초록

프로 테아 제는 생명체의 여러 생물 학적 경로 병 인; 그들의 필수적인 역할 때문에 집중적으로 공부 효소 따라서, 그들은 중요 한 약 대상입니다. 우리는 재조합 융합 단백질 기판의 사용에 따라 분해 활동의 수사에 대 한 분석 결과 자기 agarose 구슬-기반 플랫폼을 개발 했습니다. 이 분석 결과 시스템의 사용을 설명 하기 위해 한 프로토콜은 1 (hiv-1) 효소 인간 면역 결핍 바이러스 종류의 예제에 제공 됩니다. 도입된 분석 결과 플랫폼 프로 테아 제, mutagenesis, 운동, 금지, 또는 구체적 연구, 효소 활동 측정 등의 생 화 확 적인 특성에 효율적으로 이용 될 수 있다 그리고 그것은 높은 처리량에 적합 있을 수 있습니다. 기판 검사 또는 다른 분해 효소에 적용할 수 있습니다.

이 분석 결과 시스템에 적용 된 기판 포함 N 맨끝 hexahistidine (그₆)과 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 태그, 담배에 대 한 분열 사이트 엣지 바이러스 (TEV)와 에이즈-1 프로 테아 제, C 터미널 형광 단백질. 기판 대장균 세포에 효율적으로 일어날 수 있다 그리고 니켈 (Ni)-킬레이트-코팅된 비즈를 사용 하 여 쉽게 정화. 분석 결과, 동안 비드 연결 된 기판의 분해 절단 fluorimetry에 의해 측정 될 수 있는 형광 분열 파편의 석방을 이끌어 낸다. 또한, 분열 반응 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석할 수 있습니다. 에 젤 renaturation 분석 결과 구성 요소에 대 한 프로토콜 부분 renaturation 형광 단백질의 분자량 및 형광에 따라 그들의 감지 하면 설명도 되어 있습니다.

서문

분해 효소는 대사 경로 및 산업 어플리케이션에 그들의 중요성 때문에 가장 집중적으로 조사 효소 그룹에 속한다. 바이러스 성 질병에 그들의 중요 한 역할, 혈액 응고, 암의 규칙 및 심장 혈관 및 신경 퇴행 성 질환 약물 발견의 분야에서 저명한 대상 프로 테아 제를 만드는. 따라서, 기질 특이성의 상세한 특성 및 관심의 프로 테아 제 (PR)의 프로 파일링 억제제 중추 이며 선호, 비용 효율, 빠르고 강력한 생 화 확 적인 분석 실험^1,2,^{에 의해 수행 됩니다. 3}.

요즘, 복합 프로 파일링에 대 한 신약의 분야에 적용 하는 체 외 효소 분석 실험의 대부분은 균질, 형광 펩타이드 기반 및 높은 처리량 검열 (HTS)-호환 플랫폼⁴. 또한, 레이블이 지정 된 펩 티 드만 라이브러리 심사, 적합 하지 않습니다 하지만 그들은 또한 선택 된 기판에 운동 매개 변수 효소의 결정에 대 한 훌륭한 도구를 제공. 다른 경우에, 어디는 기판의 라벨은 불가능, 분리 기반 분석 분해 반응³의 운동 특성을 평가 하기 위해 가능한 솔루션을 제공할 수 있습니다.

일반적으로, 체 외 효소 분석 실험 기반 기판의 두 종류의 사용: 짧은 펩 티 드 또는 전체 단백질. 어디 짧은 펩 티 드 순서의 분열 분열 속성을 충분히 반영, 이러한 경우에 다음과 같은 표준 방법을 적용 됩니다: (i) 테스트 산화 된 인슐린 B-체인, (ii) 같은 표준 단백질 기질 검사 조합 화학, 또는 (iv)에 의해 만들어진 합성 하 고 붙일 레이블 펩타이드 라이브러리 심사 다른 프로 테아 제, (iii)의 상용 기판 유전자 방법을 사용 하 여, 예를 들면, 생물학 표시 기술^{5, 6}. 기존의 분류 외 다른 새로운 플랫폼도 있습니다 기판 생성 (예를 들어, 대형 프로테옴 파생 된 펩타이드 라이브러리⁷ 또는 재조합 융합 같은 유전 방법의 특별 한 하위의 단백질 기반 기판^8,9,10,,1112).

위에서 언급 한 기판 형식 및 분석 실험의 모두 그들의 자신의 이점 및 한계, 그리고 분석 결과 형식 결합 또는 알려진된 플랫폼의 장점을 향상의 개발은 여전히 수요. 여기 우리는 재조합 형 기질을 이용 하는 형광 효소 분리 기반 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 그의₆ 과 MBP 태그 TEV 홍보, 뒤에의 C-터미널 형광 단백질 (FP) (그림 1A)에 직접 연결 된 기판 시퀀스의 제어 분열 사이트에 융합이 융해 단백질에 의하여 이루어져 있다. 복제는 '복제 카세트'로 관심의 분열 사이트에 대 한 코딩 DNA 순서의 이전 금지 endonucleases 여 선형화 된 식 플라스 미드에 단일 결 찰 반응에 의해 수행할 수 있습니다.

그림 1: 형광 효소 분석 실험의 원리. 프로 테아 제 (A) 형광 기판 및 인간 면역 결핍 바이러스 1 형에 의해 그것의 분열의 도식 표현 (HIV-1) 표시 됩니다. 에이즈-1 효소의 매트릭스/capsid 분열 사이트 시퀀스 내에서 분열 위치를 표시 하는 화살표 (VSQNY * PIVQ). (B)는 형광 기판 분석 하 효소 반응 Ni-NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 의해 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 뿐만 아니라, 워크플로 다이어그램에서와 같이 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

분해 분석 실험 기판-포함 하는 선호도 태그, 분해 분열 사이트 및 형광 단백질이 이미 유사한 재조합 단백질을 사용 하 여 설명 하 고 있지만^8,,910, 시스템 제시 여기 통합 하 고이 방법의 장점에 개선 계획 이다. 중요 한 차이점은이 분석 결과 플랫폼 융합 단백질 기질 단백질 용 해도¹³ 강화 TEV PRs에 대 한 제어 분열 사이트를 포함 하는 MBP 갖추고 있습니다. 또한,는 기판 새로운 세대 형광 단백질, 매우 안정 되 고 기판 집계 방지 단위체 양식을 포함 합니다. MTurquoise2 및 mApple 융합 형태¹⁴의 이전 게시 된 응용 프로그램, 게다가 여기 우리 또한 표시는 단위체를 포함 하는 재조합 형 기판의 사용에 의해 주어진 결과 향상 노란 형광 성 단백질 (mEYFP) 형광 태그. 이로써 우리 다른 형광 단백질 시스템의 호환성을 보여 하 고 몇 가지 일반적인 유형의 효소 분석 실험에 의해 취득 될 수 있는 결과 나타냅니다.

재조합 융합 단백질 대장균 BL21(DE3) 세포에 표현 되 고 니켈 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) 분석 결과 대 한 기판으로 사용 되는-자기-agarose-구슬-첨부 양식 코팅. C 터미널 분열 제품 관심의 효소에 의해 분열 시 상쾌한에 구슬 표면에서 해방 됩니다. 자석 구슬에서 (포함 하는 효소 분열 제품) 상쾌한 분리 후 형광 효소의 분열 속성 확인을 측정할 수 있습니다. 앞에서 설명한 방법을 달리 여기, 시스템에 기판 및 C 터미널 분열 제품의 양은 유일 하 게 정량 상세한 기판 교정 절차에 따라. 분석 결과 시스템 분석 결과 샘플;의 SDS 페이지 분석에 의해 지원 될 수 있습니다. 후속 형광에 젤 시각화는 전기 이동 법 또는 nondenatured 및 변성 형광 구성 요소, 각각¹⁴-젤 renaturation 즉시 적용할 수 있습니다.

유연성과 구조 '복제 카세트'의 다양 한 구성으로 시퀀스의 시간 및 비용 효율적인 삽입을 허용 하 고, 따라서 기판 라이브러리의 생성을 촉진. 모든 분석 결과 단계는 자동화 및 HTS 호환, 이후 시스템 매력적 일 수 있다 특히, 예를 들어, 효소 특이성 측정 및 mutagenesis 연구, 또는 그것은 또한 활용 될 수 있습니다 효과적으로 산업 protease 억제제 심사에 대 한 및/또는 항 바이러스 약물 개발입니다.

효소 활동적인 매개 변수 (k_고양이, K_m) 개발된 분리 기반 분석 결과;에 의해 결정 될 수 있다 따라서, 그것은 적당 한 시간 코스, 기판에 따라 다릅니다, 그리고 억제 연구 등 개별 효소 활동적인 측정을 수행 수 있습니다. 이 자주 활용된 합성 펩타이드 기판에 대 한 좋은 대안을 제공 하는 재조합 융합 단백질 기질 때문에 높은 유사성에 대 한 그들의 polyprotein 기판에, 그들은 자연스럽 게 발생 대표 증명 효소-기질 상호 작용 더 정확 하 게.

프로토콜

1. 세대 기판 코딩 식 플라스 미드의

1. PacI 및 NheI 금지 endonucleases, pDest 그의₆-MBP FP 식 플라스 미드를 선형화. PDest-그의₆-MBP FP의 세대에 대 한 Bozóki 외.¹⁴를 참조 하십시오.
   1. PDest-그의₆-MBP FP 식 플라스 미드의 1500-2000 µ g, 2 µ L 각 PacI의 추가 및 NheI 금지 endonucleases, 10 x 버퍼의 10 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 nuclease 무료 물 (있) microcentrifuge 관에서 100 µ L.
   2. 1 시간 동안 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
2. DNA 보라색 염료 반응 혼합물에 로드 x 6의 20 µ L을 추가 하 고 분열 제품 사용 하 여 1 %agarose 젤 전기 이동 법으로 분리. 1 kB DNA 사다리 표준으로 적용 됩니다.
3. 태 버퍼 (40 mM Tris, 20 m m 초 산, 1 mM EDTA, pH 8.5) 포함 20 µ L SYBR 녹색 솔루션의 20 mL에 15 분 동안 젤 린스 하 고 날카로운 도구를 사용 하 여 agarose 젤 선형화 플라스 미드의 밴드를 삭제할.
   참고: 어두운 독서 블루 transilluminator (DRBT)에 의해 젤을 조명 하는 동안 약 7-8 kB에서 이산 하 고 밝은 대역으로 나타납니다 선형화 pDest 그의₆-MBP FP 플라스 미드.
4. 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤 조각에서 선형화 식 플라스 미드 정화.
5. 선형화 pDest 그의₆-MBP FP 식 플라스 미드에 기판 시퀀스를 삽입 합니다.
   1. 앞으로 (FWD) 및 역방향 (계) 대장균 코 돈 최적화 oligonucleotide 뇌관 관심의 기판 시퀀스에 대 한 코딩 anneal.
      참고: 단련 한 뇌관 PacI 및 NheI 금지 분열 endonuclease (그림 2)에 해당 하는 응집력 끝 어귀 될 것입니다.
      1. 200 선형화 식 플라스 미드의 믹스 150 ng ng FWD 및 200의 계 oligonucleotide 뇌관 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 튜브와 있을 추가 하 여 17 µ L 볼륨을 조정의 ng.
      2. 2 분 동안 65 ° C에서 그리고, 적어도 2 분 동안 4 ° C에 혼합물을 품 어.
   2. 결 찰 하 여 선형화 플라스 미드로 단련 한 뇌관의 삽입을 수행 합니다.
      1. 선형화 플라스 미드와 단련 한 뇌관을 포함 하는 혼합물에 T4 리가 버퍼 (10 배)의 2 µ L 및 T4 리가의 1 µ L를 추가 합니다.
      2. 16 h 16 ° C에서 결 찰 혼합물을 품 어.

그림 2 : Oligonucleotide 뇌관 분해 분열에 대 한 코딩 시퀀스 사이트. 정방향 및 역방향 뇌관 인코딩하는 VSQNY * 에이즈-1 홍보의 PIVQ 분열 사이트 순서 상호 보완적인 oligonucleotide 뇌관 어 닐 링 후 짧은 이중 가닥 DNA PacI 및 NheI 금지 endonucleases의 해당 끈끈한 끝을 포함 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

6. 결 찰 혼합물의 5 µ L에 의해 BL21(DE3) 유능한 세포의 100 µ L를 변환 하 고 lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지 암 피 실린을 포함 하는 셀을 확산.
   참고: 형광 단백질만 성공적인 결 찰 후 N 맨끝 퓨전 태그와 동일한 열려있는 독서 프레임에 있을 것입니다. 변환 후 몇 일 (관심의 삽입된 분열 사이트에 대 한 코딩 식 플라스 미드를 포함 하는) 식민지 보이는 형광 또는 심지어는 DRBT를 사용 하지 않고 표시 됩니다.
7. 글리세롤 재고 묘사 식민지에서 준비 합니다.
   1. 개별 식민지 파운드 매체 (100 µ g/mL의 최종 농도)에서 암 피 실린 포함의 5 µ L를 포함 50 mL 원심 분리기 튜브로 씻는 다.
   2. 지속적으로 220 rpm; 동요 하면서 8 h 37 ° C에서 그것을 품 어 그런 다음 실 온에서 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확.
   3. 부드럽게 80% 글리세롤 용액 (증류수로 희석) 1 mL에 셀을 일시 중단 하 고 추가 500 µ L 10 mM MgCl₂ 솔루션의는 서 스 펜 션.
   4. 냉동 관에 정지를 전송 하 고-70 ° c.에 주식을 저장
8. DNA 시퀀싱에 의해 생성 된 플라스 미드의 순서를 확인 합니다.
   1. 50 mL 원심 분리기 튜브에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 파운드 매체의 5 ml (1.7 단계에서 준비) 글리세롤 주식의 10 µ L를 추가 합니다.
   2. 지속적으로 220 rpm; 흔들어 동안 16 h 37 ° C에서 현 탁 액을 품 어 그런 다음 4 ° c.에서 10 분 2000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확
   3. 격리 식 플라스 미드 플라스 미드 miniprep에 의해 셀 펠 릿에서 키트 ( 재료의 표참조) DNA 연속을 위한 순화 된 플라스 미드를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라.
      참고: 시퀀싱에 대 한 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3' (앞으로), 5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' (역방향) oligonucleotide 뇌관을 사용할 수 있습니다.

2입니다. 형광 기판의 표현

1. 초보 문화를 준비 합니다.
   1. 50 mL 원심 분리기 튜브에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 파운드 매체의 5 ml (1.7 단계에서 준비) 글리세롤 주식의 10 µ L를 추가 합니다.
   2. 지속적으로 220 rpm에서 떨고 있는 동안 15 h 37 ° C에서 정지를 품 어.
2. 세균성 문화 (5 mL) 50 mL 500 mL 무 균 삼각 플라스 크에 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 신선한 파운드 매체의 전송.
3. 지속적으로 220 rpm에서 떨고 있는 동안 0.6-0.8 600 nm 파장에서의 흡 광도를 37 ° C에서 세포를 성장 한다.
   참고: 항생물질 치료 단계 2.5에 적용 될 경우 권장 되지 않습니다 600 이상 0.6의 흡 광도를 셀 성장 nm.
4. 유도 단백질 표정 1mm 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가 합니다.
5. 항생물질 치료 적용 되지 않으면, 지속적으로 220 rpm에서 흔들어 동안 37 ° C에서 3 h에 대 한 문화를 품 어 고 단계 2.6 프로토콜을 계속 합니다. 항생물질 치료 적용 단계 2.5.1-2.5.3와 프로토콜을 계속 합니다.
   참고: 일부 FPs 대장균 세포에 의해 생산 장시간 성숙 할 수 있습니다 (이전 작업 참조)^16,17; 이러한 경우에 단백질 번역 수 있습니다 필요에 따라 체포 될 항생물질 치료에 의해 기판 솔루션의 형광 수확량을 증가 하기 위하여.
   1. 지속적으로 220 rpm; 흔들어 동안 37 ° C에서 2 h 세포 현 탁 액을 품 어 그런 다음, 추가 (200 µ g/mL의 최종 농도)에 항생물질 솔루션.
   2. 지속적으로 220 rpm에서 흔들어 동안 37 ° C에서 형광 단백질의 숙성 시간에 따라 세포 배양 품 어.
6. 2 x 25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브 청소 및 4 ° c.에 15 분 동안 4000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 하는 문화를의 전송
7. 삭제는 상쾌한 고 적어도 1 시간-70 ° C에서 세균성 세포 펠 릿을 저장 합니다.
   참고: 표현된 형광 기판 포함 된 셀 또는 심지어는 DRBT를 사용 하지 않고 보이는 형광 표시.

3. 세포 파쇄

1. 얼음에 언된 셀 펠 릿을 놓고 15 분 동안 녹여 보자.
2. 펠 릿에 세포의 용 해 버퍼 (50mm NaH₂포₄, 300 mM NaCl, 이미 10 m m, 0.05% 트윈 20, pH 8)의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 일시 중단.
3. 정지를 갓된 phenylmethanesulfonyl-불 소 (PMSF) 프로 테아 제 억제 물 솔루션 (8.7 mg/mL, 에탄올에 용 해)의 10 µ L를 추가 합니다.
4. 현 탁 액을 lysozyme의 2 밀리 그램 및 20 단위의 DNase 추가 하 고 일시 중단.
5. 15 분, 및 소용돌이 얼음에 정지를 품 어 그것 때때로.
6. 1.5 mL microcentrifuge 관에는 서 스 펜 션의 2 x 1 mL를 전송 하 고 3 분, 10 라운드에서 정지를 sonicate 쥡니다 및 5의 s 휴식의 s.
7. 10000 x g ; 실 온에서 20 분에 관을 원심 다음, 각 관에서 형광 상쾌한 (허가 세균성 세포 lysate)을 신중 하 게 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
   참고: 지운된 lysates 형광 기질을 포함 하 또는 심지어는 DRBT를 사용 하지 않고 보이는 형광 표시 하 고 최대 2 주 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그것을 동결 하지 않습니다. 맑게 lysates 샘플 준비 효소 분석 결과 (참조 섹션 4.1)에 대 한 직접 이용 될 수 있다 또는 또한 기판 정화에 대 한 사용할 수 있습니다 (단계 4.5.1 참조).

4. Ni NTA 자석 구슬-기반 효소 분석 결과

참고: 분석 결과 플랫폼의 유연성으로 인해 그것은 최적화할 수 있습니다 다양 한 유형의 연구를. 이러한 이유로, 선택의 효소의 활동 속도 차이로 인해 일부 (어디 표시 됩니다) 분석 결과 매개 변수에 명시적으로 설명 하실 수 없습니다 하지만 개별 목표와 실험 설계를 최적화 하는 데 필요한. 지도,으로 연구의 어떤 종류의 매개 변수는 특정 단계에 표시 됩니다.

1. 샘플 준비
   1. 기판 연결 자석 구슬의 세대
      1. 닫힌된 2 mL 낮은 단백질 바인딩 (참조 테이블의 재료) microcentrifuge 튜브를 포함 하는 새 또는 재활용 (참조 섹션 4.7) Ni NTA 자석 agarose 구슬 자석 입자 집중 (MPC)에 배치 합니다.
         참고: 적용 된 비드 서 스 펜 션의 양을 실험 설계에 따라 설정할 수 것입니다. 우리는 각 실험에서 자석 구슬 솔루션 (5%, v/v)의 1 mL을 사용합니다.
      2. 구슬 벽 그리고/또한 microcentrifuge 튜브;의 뚜껑에 붙어 수 있습니다. 따라서 MPC 구슬의 모든 수집 되어 있는지 확인을 모든 방향에서 거꾸로 설정 합니다.
      3. 상쾌한을 제거 하 고 그것을 폐기.
      4. 세포의 용 해 버퍼 하 여 구슬을 씻어.
         1. 구슬에 세포의 용 해 버퍼의 1.8 mL을 추가 하 고는 MPC에서 닫힌된 튜브를 제거 합니다.
         2. 진동 및/또는 샘플은 완전히 동 질 때까지 튜브를 거꾸로 돌리는 튜브에 비즈를 일시 중단 합니다.
         3. MPC에 다시 튜브를 놓고 뒤집어 그것 구슬 수집 합니다.
         4. 튜브를 열고는 상쾌한을 삭제 합니다.
      5. 구슬에 1.0-1.8 mL는 허가의 lysate (단계 3.7에서에서 준비)를 추가 하 고는 MPC에서 튜브를 제거.
      6. 구슬과 완전히 균질 천천히 30 분 동안 실내 온도에 회전으로 튜브를 회전 때까지 거꾸로 닫힌된 튜브를 설정 합니다.
      7. MPC에 배치 하 고 뚜껑 및 구슬에서 지운된 세포 lysate를 제거 합니다.
         참고: 지운된 세포 lysate 수 있습니다 삭제 또는 추가 사용 하기 위해 저장 (3.7 단계 후 메모를 참조).
      8. 1% 추가 트윈 20 (pH 7) 기판 부착 자석 구슬 (SAMBs).
         참고: SAMBs 또는 심지어는 DRBT를 사용 하지 않고 보이는 형광 표시.
   2. SAMBs의 세척
      1. MPC에 SAMB 서 스 펜 션 튜브를 놓고는 상쾌한을 삭제 합니다.
      2. SAMBs 3를 씻어 각 버퍼 x: 1%의 i) 1.8 mL 트윈 20 (pH 7); ii) 1.8 mL 세척 버퍼 (50mm NaH₂포₄, 300 m m NaCl, 5mm 이미, 0.05% 트윈 20, pH 7); 분열 버퍼 (50mm NaH₂포₄, 300 m NaCl, 0.05% 트윈 20, pH 7 m)의 iii) 1.8 mL.
         참고: 세척 절차 단계 4.1.1.4 참조. 분열 버퍼 실험 필요에 따라 변경 될 수 있습니다 하지만 호환성을 결정 하기 위해 Ni NTA 자석 구슬의 설명서를 확인 하는 것이 좋습니다.
   3. SAMB 재고 솔루션의 준비
      1. SAMB 재고 솔루션을 만드는 세척된 SAMBs를 분열 버퍼를 추가 합니다.
         참고: 후 버퍼를 추가 하지 마십시오 흔들어 또는 튜브를 뒤집어. 분열 버퍼의 볼륨 개별 실험 설계에 따라 달라 집니다 그리고 자석 구슬 (단계 4.1.1.1 참조)의 수와 단계 4.1.4.2에에서 사용 될 볼륨에 따라 계산 해야 합니다. 2 mL 튜브에 대 한 적용 된 볼륨은 최대 1900 µ L ( 표 1참조). SAMB 재고 솔루션의 권장된 마그네틱 비드 밀도 2%-10% (v/v)입니다.

         연구 유형	양의 분열 버퍼 (µ L)
         S-종속 측정 (그림 4)	1600
         시간 과정 측정 (그림 5A)	1600
         저해 연구 (그림 5B)	1900
         pH 의존 연구 (그림 6)	1400

         
         표 1: 측정의 다른 종류에서 SAMB 재고 솔루션을 준비 하는 데 사용 하는 분열 버퍼의 볼륨.
      2. MPC에서 닫힌된 튜브를 제거 합니다. 즉시 SAMB 재고 솔루션을 사용 하거나 24 h까지 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.
   4. SAMB 재고 솔루션을 사용 하 여 분석 결과 샘플의 세대
      참고: 분석 결과의이 부분의 세부 사항을 강력 하 게 개별 실험 설계 (샘플 종류는 표 2에 나와 있습니다)에 따라 달라 집니다.

      샘플 유형	노트
      반응 샘플 (R)	-분열 속성 평가에 사용 -효소와 버퍼 분열에서에서 기판 모두 포함
      기판 빈 샘플 (B)	-자발적인 기판 분리 평가 대 한 사용 (단계 4.6.2 참조) -버퍼 분열에서에서 기판만 포함
      기판 컨트롤 샘플 (C)	-detemining 기질 농도 (단계 4.6.3 참조) -차입 버퍼에서 기판만 포함

      
      표 2: Ni NTA 자석 구슬-기반 효소 분석 결과의 샘플 종류.
      1. 분석 결과 샘플에 대 한 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브의 2 개 mL를 준비 합니다.
         참고: 다른 낮은 단백질 플라스틱 그릇을 바인딩 사용할 수도 있습니다. 라운드 또는 평면 하단 튜브를 사용 하 여 SAMBs의 자유로운 이동 보장. 표 3에서 튜브의 권장 되는 수를 참조 하십시오.

         연구 유형		R	B	C
         S-종속 측정 (그림 4)		5	5	2
         시간 과정 측정 (그림 5A)		6	6	2
         저해 연구 (그림 5B)		7	7	1
         pH 의존 연구 (그림 6)		5	5	1

         
         표 3: 시연된 연구에서 각 샘플 유형에 필요한 2 mL microcentrifuge 튜브의 수입니다.
      2. 동질성까지 SAMB 재고 솔루션을 중단 하 고 즉시 샘플 튜브에 반응에서 분석할 기판의 양을 전송. 권장된 량은 25-300 µ L, 하지만 개별 실험 디자인 (표 4)에 따라 설정 됩니다.
         참고: 모든 SAMBs 튜브의 하단에 측정 된 경우 확인 하십시오. SAMBs는 시험 결과 왜곡할 수 있는 튜브의 벽에 충실 수 있습니다. 다른 볼륨을 순차적으로 측정할 수 있다면, 높은 볼륨 aliquoting를 시작 하 고 펫 피 펫 팁의 변화를 최소화 하려고 합니다.

         연구 유형			R		B		C
         S-종속 측정 (그림 4)			25-50-100-150-250		25-50-100-150-250		25
         시간 과정 측정 (그림 5A)			25		25		25
         저해 연구 (그림 5B)			120		120		120
         pH 의존 연구 (그림 6)			100		100		100

         
         표 4: SAMB 솔루션의 시연된 연구에서 각 샘플 형식의 샘플 튜브 측정.
      3. MPC에 aliquoted SAMB 정지를 포함 하는 샘플 튜브를 놓고 약간 MPC를 앞뒤로 이동 합니다.
      4. 신중 하 게는 SAMBs에서에서 상쾌한을 제거 하 고 그것을 폐기.
      5. MPC에서 튜브를 제거 하 고는 SAMBs를 신중 하 게 계산 된 양의 반응 버퍼 (분열 또는 차입 버퍼 [100 mM EDTA, 0.05% 트윈 20, pH 7])를 추가 합니다.
         참고: 개별 실험 디자인 (표 5)에 따라 버퍼 볼륨을 계산 합니다. 2 mL 튜브에 대 한 반응 혼합물 (이 단계에서 추가 될 반응 버퍼의 볼륨 + 단계 4.2.3에서에서 추가할 솔루션의 볼륨)의 권장된 최종 볼륨은 50-150 µ L. 추가 버퍼에서 세척 되는 SAMBs의 모든 있는지 확인. 차입 버퍼 분열 버퍼 기판 제어 (C) 샘플의 경우에 대신 사용 됩니다. 저해 연구에 대 한 선택의 억제제가이 단계에서 추가 하는 것이 좋습니다.

         연구 유형	양의 반응 버퍼 (µ L)
         S-종속 측정 (그림 4)	68 µ L 분열 버퍼
         시간 과정 측정 (그림 5A)	68 µ L 분열 버퍼
         저해 연구 (그림 5B)	67.3 µ L 분열 버퍼 + 0.7 µ L 억제제 재고 솔루션 *
         pH 의존 연구 (그림 6)	69.5 µ L 분열 버퍼 * *

         
         표 5: 시연된 연구에 반응 버퍼의 볼륨. * Amprenavir 디 메 틸-⁚;에 해결 되었다 amprenavir 재고 솔루션 (1에서까지 nM 1 µ M 농도) 억제 연구에 적용 된 ( 그림 5B참조). * * PH 6.0-8.5에서에서 원거리 적용된 분열 버퍼의 pH
      6. 튜브의 뚜껑을 닫습니다. 이제 샘플 분석 결과 대 한 준비가 되었습니다.
         참고: 샘플 최대 24 h, 4 ° C에서 저장 될 수 있다 하지만 저장은 SAMB 재고 솔루션 준비 후 즉시 사용 하는 경우만 (단계 4.1.3.2 참조).
2. 분해 반응의 개시
   1. 실험 필요에 따라 분해 효소 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 그것은 분열의 버퍼를 사용 하 여 분해 하는 효소를 희석 하 고 좋습니다. 에이즈-1¹⁴ TEV PRs¹⁸ 의 정화에 대 한 프로토콜 이전 출판 되었습니다.
   2. Thermoshaker의 교 반 속도 (600 rpm) 및 (표 6) 부 화 온도 설정 합니다.

      연구 유형	부 화 온도 (° C)
      S-종속 측정 (그림 4)	37
      시간 과정 측정 (그림 5A)	37
      저해 연구 (그림 5B)	37
      pH 의존 연구 (그림 6)	30

      
      표 6: 다른 연구 종류에 적용 하는 외피 온도. 에이즈-1 홍보, 37 ° C는 권장, 30 ° C는 권장 TEV 홍보
   3. 분해 반응을 초기화 하기 위한 반응 샘플을 효소 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 공백 기판 (B) 및 C 샘플, 분열 버퍼 (버퍼 효소)와 추가 차입 버퍼, 각각 합니다. 볼륨 개별 실험 필요 (표 7)에 따라 계산 될 것입니다. 2 mL 튜브에 대 한 반응 혼합물 (단계 4.1.4.5에서에서 추가 반응 버퍼의 볼륨 +이 단계에서 추가 될 솔루션의 볼륨)의 권장된 최종 볼륨은 50-150 µ L.

      연구 유형	양의 효소 솔루션/효소 버퍼/차입 버퍼 (µ L)
      S-종속 측정 (그림 4)	2
      시간 과정 측정 (그림 5A)	2
      저해 연구 (그림 5B)	2
      pH 의존 연구 (그림 6)	0.5

      
      표 7: 검증 된 연구의 경우 분석 결과 샘플의 초기화 하는 동안 추가 효소 솔루션/효소 버퍼/차입 버퍼의 볼륨.
   4. 부드럽게 튜브를 이동 하 여 신중 하 게 비즈를 약동 하 고 이미 떨고 thermoshaker 튜브를 즉시 넣습니다.
      참고: 수동 샘플 종료 개시; 보다 더 많은 시간이 걸립니다 (4.3 절을 참조) 따라서, 적어도 2 분의 등록된 지연 반응의 개시 사이 좋습니다.
   5. 실험 설계 (표 8)에 따라 샘플을 품 어.

      연구 유형	보육 시간 (분)
      S-종속 측정 (그림 4A)	7
      S-종속 측정 (그림 4B)	120
      시간 과정 측정 (그림 5A)	0-2.5-5-10-15-20
      저해 연구 (그림 5B)	10
      pH 의존 연구 (그림 6)	60

      
      표 8: 보육 시간 다른 측정에서 분석 결과 샘플에 적용.
3. 분해 반응의 Termination
   1. 쉐이 커, 부 화의 끝에 30 s 사전에서 샘플을 신속 하 게 그것을 회전.
   2. MPC에 튜브를 배치, 그것은 15 대 서 s, 약간 MPC를 앞뒤로 이동 하 고.
   3. 뚜껑 열고 접시 또는 새로운 튜브는 상쾌한을 신중 하 게 전송 합니다.
      참고:는 피 펫의 끝을 가진 집중된 비즈를 만지지 마십시오. C 샘플 및 분열의 고차를 가진 R 샘플의 수집된 상쾌한 보이는 형광 또는 심지어는 DRBT를 사용 하지 않고 표시할 수 있습니다.
4. 형광 검출
   1. 검은 반 지역 microplate에 분리 된 샘플 supernatants의 2 x 30 µ L를 전송 합니다.
   2. 적절 한 여기 및 방출 필터를 사용 하 여 형광을 측정 합니다.
      참고: 분열 버퍼 및 차입 버퍼의 기본 형광을 측정 합니다. 선택 필터 조합 필요 측정된 형광 단백질 (표 9) 기반으로 합니다.

      형광 단백질	여기 필터 (nm)	배기 필터 (nm)
      mTurqiouse2	355/40	460/25
      mEYFP	544/15	590/10
      mApple	544/15	590/10

      
      표 9: 여기 및 방출 필터 다른 형광 단백질을 검출 하는 데 사용.
5. 교정
   참고: 단계 4.6.1, 형광 강도 값의 분열-또는 차입-버퍼-해결에서 보정 곡선을 생성 하 다른 농도에서 순화 된 기판 측정 필요.
   1. 형광 성 기질을 정화.
      참고: 정수, SAMBs 기판 빈 (B) 샘플의 효소 분석 결과 수집 될 수 있습니다, 또는 새로운 SAMB 정지 수 또한 준비 (4.1.1와 4.1.2 참조 섹션).
      1. MPC 분열 버퍼 (2%-10%, v/v)의 1 mL에 SAMBs와 함께 튜브를 놓고 MPC 거꾸로 모든 방향으로 선회 하 여 자석 구슬 수집 합니다.
      2. 튜브를 열고 분열 버퍼 튜브와 뚜껑에서 모두 제거 합니다.
      3. MPC에서 튜브를 제거 하 고 추가 차입 버퍼의 400-600 µ L를 SAMBs.
      4. 천천히 5 분 동안 실 온에서 회전자와 닫힌된 튜브를 회전 합니다.
      5. MPC에 튜브를 놓고 거꾸로 MPC를 설정 하 여 비즈를 수집 합니다.
      6. 순화 그대로 형광 기판 (eluate)을 포함 하는 상쾌한을 제거 하 고 새로운 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
         참고: Eluate 명확 하 게 보이는 형광 또는 심지어는 DRBT를 사용 하지 않고 표시 합니다.
   2. 병렬 버퍼 교환 두 0.5 mL 10 K 한 장치를 사용 하 여 수행 합니다.
      1. 각 한 장치로 절반 양의 준비 eluate (200-300 µ L)를 측정 합니다.
      2. 후 각 원심 분리 단계에서 희석 첫 번째 및 두 번째 외 장치 차입 버퍼와 분열 버퍼에 집중된 eluate 각각.
      3. 복구 후 120-200 µ L 사이 같은 볼륨에 다른 버퍼에 해결 집중된 샘플을 조정 합니다.
         참고: 지금 분열 버퍼 해결 기판의 단백질 함량은 동일 차입 버퍼 해결 기판; 따라서, 그것 아니다 단백질 단계 4.5.3, 후자의 하나씩의 콘텐츠를 결정 하는 데 필요한 단백질 농도 측정에 사용 되는 방법 EDTA를 방해할 경우.
   3. 기판의 단백질 콘텐츠 280에서 흡 광도 측정 하 여 차입 또는 분열 버퍼에 해산 결정 nm.
      참고: 다른 방법 (예: 브래드 퍼 드 또는 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 실험)도 사용할 수 있습니다 단백질 농도 측정을 하지만 EDTA (차입 버퍼에 존재 하는) 또는 형광 기판의 흡수도 가능한 간섭 해야 고려. 4.5.4 단계에서 적용할 기판 솔루션의 초기 단백질 함량 0.4-2.0 사이 좋습니다 mg/mL는 보정을 생성 하기 위해서는 적절 한 범위에서 곡선. 소 광 계수 표 10 를 참조 하십시오.

      기판	분자량 (다)	소 광 계수 (M-1 c m-1, 280에 nm 측정 물에)
      그의6-MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2	72101.7	96845
      그의6-MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2	72042.7	95355
      그의6-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP	72367.1	94325
      그의6-MBP-VSQNY * PIVQ-mApple	72145.9	105200

      
      표 10: 분자 무게 그리고 다른 재조합 형광 성 융해 단백질 기판의 소멸 계수.
   4. 적어도 8 개의 단계, 차입-와에서 각각 사용 하 여 차입 또는 분열 버퍼는 희석에 대 한 분열 버퍼 해결 기판 솔루션에서에서 두 가지 직렬 희석을 준비 합니다.
   5. 검은 반 지역 microplate에 각 희석 점의 30 µ L를 전송 합니다.
   6. 4.4.2 단계에서 적용 하는 설정을 사용 하는 fluorimeter와 형광을 측정 합니다.
      참고: 분열 및 차입 버퍼의 기본 형광을 측정 합니다.
6. 분석 결과의 평가
   1. 보정 곡선을 플롯.
      1. 농도 (mM) (단계 4.5.4에서에서 사용), 순화 된 기판 솔루션의 단백질 콘텐츠 4.5.3 단계에서 결정에 따라 계산 합니다.
      2. (분열 버퍼 또는 차입 버퍼) 적용된 희석 버퍼의 기본 RFU 값으로 직렬 희석 포인트의 상대 형광 강도 값 (RFU)를 수정 합니다.
      3. 분열-또는 차입-버퍼-해결 순화 된 기판의 어 금 니 농도 대 한 수정 된 RFU 값을 플롯 하 고 선형 회귀 (힘 0 절편)을 수행 합니다.
         참고: 높은 R² 값 (˃0.97) 형광 형광 단백질의 농도 사이 좋은 선형 상관 관계를 나타냅니다. 이 경우에 회귀선의 기울기 4.6.2 및 4.6.3 단계에서 시험된 범위에 분석 결과 부품의 농도 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 실험 오류 및 데이터 포인트 분배 교정;의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 데이터에 의해 R² 와 기울기 값 영향을 여부를 확인 하기 위해 확대/축소 그래프 ( 그림3에서 참조)로 도움으로 그래픽 평가 수행할 수 있습니다.
   2. 반응 샘플의 C-터미널 형광 분열 제품의 금액을 계산 합니다.
      1. 해당 B 샘플의 RFU 값 각 R 샘플의 RFU 값을 수정 합니다.
      2. 수정 나누어 분열 제품 농도 (mM)에 반응 샘플에서 계산 분열 버퍼 기반으로 교정의 기울기에 의해 RFU 값 곡선 (단계 4.6.1.3 참조).
   3. 반응 샘플에 적용 된 기질 농도 계산 합니다.
      1. 기본 차입 버퍼 RFU 값 C 샘플의 RFU 값을 수정 합니다.
      2. 그들의 교정 나누어 C 샘플의 supernatants에 (mM)에 eluted 기판의 농도 계산 차입 버퍼 기반으로 교정의 기울기에 의해 RFU 값 곡선 (단계 4.6.1.3 참조).
      3. 단계 4.1.4.2, 다음 식에 따라 분석 결과 샘플을 만들기 위한 사용 SAMB 재고 솔루션의 (mM)에 기질 농도를 확인 합니다.
         
         여기, c_SAMB 섹션 4.1.3; 준비 SAMB 재고 용액의 몰 농도 c_C C 샘플 단계 4.6.3.3;에서 계산에 eluted 기판의 어 금 니 농도 V_r 단계 4.1.4.5에서에서 반응 버퍼와 단계 4.2.3에서에서 효소 버퍼의 추가 의해 생성 하는 반응 혼합물의 볼륨은.; 그리고 V_SAMB C 샘플 (단계 4.1.4.2) SAMB 재고 솔루션의 볼륨.
      4. SAMB 재고 솔루션 (mM)에서 볼륨 (µ L)에 따라 각 반응 샘플 튜브 단계 4.1.4.2에서 측정의 어 금 니 농도에 따라 각 R 샘플에서 기판의 몰 농도 계산 합니다.
   4. 데이터 처리를 수행 합니다.
      참고: 데이터 분석 실험의 목표에 따라 달라 집니다. 비디오의 예가 나와 데이터 처리에 대 한 기판 종속 운동 연구 에이즈-1 홍보에 그의₆-MBP-VSQNY를 사용 하 여 * PIVQ mTurquoise2 기판. 초기 속도 값 C 터미널 분열 파편의 수에서 계산 되 고 적용 된 기질 농도 대해 그려집니다. 운동 매개 변수 Michaelis Menten 비선형 회귀 분석에 의해 결정 됩니다.
7. 마그네틱 구슬의 재활용
   참고: 분석을 수행한 후 자기 agarose 구슬 수 수 수집 및 재활용.
   1. MPC와 사용된 자석 구슬 수집 하 고는 상쾌한 삭제.
      1. 주어진 순서 대로 다음 버퍼의 1.8 mL와 구슬 세척: 재생 버퍼 A (0.05% 트윈 20, 0.5 M NaOH), 재생 버퍼 B (0.05% 트윈 20), 재생 버퍼 C (0.05% 트윈 20, 100 mM EDTA, pH 8), 재생 버퍼 B, 재생 버퍼 D ( 0.05% 트윈 20, 100 mM이₄, pH 8), 재생 버퍼 B, 및 재생 버퍼 E (0.5% 트윈 20, 30% 에탄올, pH 7).
         참고: 세척 절차 단계 4.1.1.4 참조.
   2. 재생 버퍼 E 4 ° c.에에서 재활용된 구슬 저장

5. 페이지 분석

1. 샘플 준비
   참고: Ni NTA 자석 구슬-기반 분석을 수행한 후 분석 결과 supernatants는 페이지에서 분석할 수 있습니다. 이 경우에, 5.1.1, 5.1.2 단계를 건너뜁니다. 그러나, 그것은 또한 관심 있는 protease와 솔루션에 소화 후 정화 형광 기판 솔루션 및/또는 그들의 분열 파편을 분석 가능. 이 경우에, 계속 단계 5.1.1 프로토콜.
   1. 4.5.1 단계에 따라 정화 형광 기판 솔루션을 준비 합니다.
   2. 솔루션에서 소화를 수행 합니다.
      1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 소화를 샘플 차입 0.5 mL 10 K 한 장치와 약 수에 분열 버퍼와 버퍼를 교환 합니다.
         참고: 우리 aliquoted 페이지 분석에 대 한 68 µ L의 각 기판 샘플 튜브 수와 기판 솔루션 aliquoted을 볼륨 개별 실험 설계에 따라 최적화할 수 있습니다.
      2. 샘플에 효소 솔루션을 추가 합니다.
         참고: 페이지 분석을 위해 우리가 적용 2 µ L V-1 홍보,¹⁴, Bozóki 그 외 여러분 의해 설명 된 대로 준비 하지만 볼륨 개별 실험 설계에 따라 최적화 될 수 있습니다. 분해 하는 효소를 희석 분열 버퍼를 사용 하는 것이 좋습니다.
      3. 실험 설계에 따라 샘플을 품 어.
         참고: 페이지 분석에 대 한 우리 incubated 반응 혼합물에서 37 ° C, 하지만 보육 시간 45 분에 대 한 고 온도 실험 설계에 따라 설정 될 필요가 있다.
      4. 5.1.3 단계를 수행 하 여 반응을 종료.
   3. 페이지에 대 한 샘플을 준비 합니다.
      참고: 형광 기판 포함 된 샘플 페이지는 nondenaturing 또는 변성 메서드에 의해 준비 수 있습니다. Nondenaturing 또는 변성 조건의 사용에 대 한 각각 5.1.3.1 또는 5.1.3.2, 단계를 따르십시오.
      1. Nondenatured 샘플을 준비: nondenaturing 샘플 로딩 버퍼 (300 mM Tris, 20% 글리세롤, 0.05 %bromophenol 블루, pH 6.8) x 6의 6 µ L 30 µ L 샘플의 혼합.
      2. 변성된 샘플 준비: 변성 샘플 로딩 버퍼 (300 mM Tris, 20% 글리세롤, 0.05 %bromophenol 블루, 12 %SDS, 100 m m β-mercaptoethanol, pH 6.8), x 6의 6 µ L와 샘플의 30 µ L를 혼합 하 고 10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열.
2. SDS 페이지 분석
   참고: 필요에 따라, 경우에 nondenatured (에서 준비 단계 5.1.3.1) 샘플 분석 하는, 네이티브 페이지도 수행할 수 있습니다. 이 경우에, 섹션 5.3 건너뜁니다.
   1. SDS polyacrylamide 젤 (겹쳐 쌓이는 젤 분리 14%와 4% 사용)를 준비 하 고 전기 이동 법 버퍼 (2.5 m m Tris, 19.2 m m 글리신, 0.01 %SDS) 탱크를 채우십시오.
   2. Polyacrylamide 젤의 우물을 (5.1.3.1 또는 5.1.3.2 단계에서 준비) 샘플을 추가 하 고 120 V 전압에서 전기 영동을 수행.
   3. 실행 중인 모듈에서 젤 카세트를 제거 하 고 세척 탱크에 젤을 배치.
      참고: Nondenatured 샘플 이미 젤, 또는 DRBT는 맨 눈으로도 볼 수 있다.
3. 에 젤 renaturation 및 형광 단백질의 검출
   참고: 변성된 샘플 (준비 단계 5.1.3.2)는 DRBT에 있는 형광 단백질을 감지, SDS 씻는 젤에서 부분적으로 renature 하는 단백질을 해야 합니다.
   1. 젤을 ~ 100 mL의 증류수를 추가 하 고 30 분 이상 젤을 씻어 내어 주세요.
      참고: SDS 제거 개선, 물 매 10 분을 대체 하거나 최대 60 분까지 씻어.
   2. DRBT를 사용 하 여 또는 자외선 이미징 형광 단백질을 시각화.
4. 기존의 Coomassie 젤의 얼룩
   1. Nonfluorescent 단백질을 시각화 하기 위해 화려한 Coomassie 파란 염료와 젤 얼룩.

결과

그림 1A 는 특정 분열 사이트 시퀀스에서 에이즈-1 홍보에서 처리할 수 있는 대표적인 형광 재조합 단백질 기판의 도식 구조를 보여 줍니다. 그림 1B 는 기판 생산 및 Ni NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 및/또는 페이지를 포함 하 여 효소 분석 실험에 있는 그들의 가능한 응용 프로그램을 나타냅니다.

Fluorimetry에 의해 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면, 교정 절차는 형광 기판 및 분열 제품 수량을 결정 하는 데 필요한. 이 위해 다른 버퍼 조건에서 다른 기판의 형광 강도 값 측정 될 필요가 있고 분석 농도 범위 (그림 3)에 그들의 농도에 상관 될 필요가. 기판 및 분석 결과 샘플에서 분열 제품의 금액을 결정 하기 위해 보정 곡선의 기울기 값을 적용할 수 있습니다. 보정 곡선의 (표 11) 기판에 삽입 하는 분열 사이트 시퀀스의 독립 이며 잠재적으로 일련의 동일한 유형의 형광 단백질을 융합 하는 기판에 사용할 수 있습니다. 확대/축소 그래프 (그림 3) 뿐만 아니라 낮은 농도 범위를 확대 하려면 모든 선형 재발에 대 한 표시 됩니다. 그것은 보정 데이터 포인트의 적절 한 분배는 믿을 수 있는 교정에 대 한 필요 하기 때문에 신중 하 게 수행 해야 하는 것이 중요. 이러한 이유로 두 가지 직렬 희석 적용 됩니다 교정, 샘플 준비 하 R² 값은 형광 단백질의 농도 형광 경우에 충분 한 수의 데이터 요소 사이 좋은 상관 관계를 나타냅니다 때문에 가 전체 농도 범위를 커버 하는 데 사용 되었습니다. 또한, 실험 오류 높은 영향을 미칠 수; 교정의 정확성 따라서, 회귀 선의 그래픽 평가 할 수 있습니다 또한.

효소 분석 결과, 반응 속도 (그림 4A)에 기질 농도의 효력의 검사를 포함 하 여 다양 한 효소 측정을 수행할 수 있습니다. 비선형 회귀에 의해 데이터 효소 활동적인 매개 변수 (예: v_최대 및 K_m)를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 부족 한 비드 현 탁 액 및 분산 및 부적 절 한 반응 종료 차선의 결과 (그림 4B), 신뢰할 수 있는 효소 운동 값을 계산 하는 데 적합 하지 않습니다 발생할 수 있습니다.

시간에 제품 대형의 의존 (예를 들면, 동안에 분열 반응 매개 변수 최적화) 분석 결과 (그림 5A)에 의해 확인할 수 있습니다. 효소 활성 억제제 존재 수도 있습니다 (그림 5B)는 활성 효소 농도 및 억제 상수에 대 한 조사. 동일한 방법론을 사용 하 여, 다른 억제제의 효과 수 있습니다 또한 상영 분석 결과 의해.

효소 분석 실험은 효소 활동에 pH의 효과 조사할 때 유용 합니다. 그림 6A TEV 홍보, 넓은 최적의 pH 범위 (pH 6-9)의 예 의해 pH 의존을 효소 활동의 나타냅니다. PH 의존 효소 활동의 공부 (또는 데 산 성 pH 최적 효소 측정 될 필요가) 경우는 구슬에 재조합 형 기판의 선호도 바인딩 약간 산 성 pH에서 제한 될 수 있습니다 고려 하는 데 필요한. 구슬 (그림 6B)에서 기판의 높은 분리 시험 결과의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 구슬에서 자발적인 기판 분리를 고려, 반응 샘플 측정 값 그 B 샘플 수정 해야 합니다.

그림 7 (그림 7A) 블루 빛 transillumination를 사용 하 여 nondenatured 형광 단백질 그들의 색깔에 따라 젤에 분화 될 수 있다 보여준다. 기판/분열 파편의 분자 무게의 결정은 필요한 경우, 조건을 변성 시키기 사용할 수 있습니다 또한 샘플 준비, 형광 단백질 부분적으로 젤에 renatured 수 있습니다 자외선 조명에 의해 검출 될 수 있기 때문에 (그림 7B) 또는 Coomassie 얼룩 (그림 ℃). R 샘플 분석, C 터미널 분열 제품 있다면 표시 (그림 ℃), N 맨끝 분열 파편 및 uncleaved 기판 구슬에 부착 된 유지. 때때로, 단백질 nondenaturing 조건 (그림 ℃)를 사용 하 여에 불구 하 고 부분적으로 변성 될 수 있습니다 그리고 nondenatured 단백질 더 풍부한 동안, 변성된 형태도 샘플에서 감지. 이 현상은 분해 분열의 검출에 영향을 주지 않습니다 하지만 양적 densitometry nondenatured 샘플의 경우 고려 되어야.

자세한 설명은 2 mL 튜브-기반 분석 결과 대해서만 표시 됩니다, 분석 결과 96 잘 접시 기반 시스템 (그림 8), (표시 되지 않음) 본 연구실에서 이미 성공적으로 테스트 되었습니다에 대 한 적응 될 수 있습니다. 96 잘 접시 적응 형식 fluorimetric와 전기 이동 분석, 뿐만 아니라, 완벽 하 게 호환 이며, 획득된 데이터 또한 평가 될 수 있습니다이 문서에서 설명 하는 방법에 따라.

그림 3 : 교정 곡선. 대표 기판 보정 곡선을 다른 C 터미널 형광 태그를 융합 하는 두 개의 재조합 기판의 예제와 함께 보여 줍니다: (A 와 B) 그의₆-MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 및 (C 와 D ) 그의₆-MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP. 확대/축소 숫자도 0-0.005에서 데이터 포인트의 선형 회귀를 나타내는 표시 됩니다 m m 기질 농도 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 4 : 효소 활동적인 매개 변수 결정. 기판 종속 운동 측정 했다 HIV-1 홍보 수행 (41.2의 마지막 활성 농도에 nM). 초기 속도 값 기질 농도 대 한 표시 했다 그리고 Michaelis Menten 비선형 회귀 분석을 수행 했다. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 2). (A) A 대표 최적의 결과 그의₆-MBP-VSQNY의 예제와 함께 표시 됩니다 * PIVQ mApple 퓨전 단백질 기질. (B) A 대표 차선의 결과 그에 대 한 표시 됩니다₆-MBP-KARVL * AEAM mTurquoise2 기판, 적절 한 기질 농도의 설정은 SAMB 재고 솔루션의 부족 한 균질 때문에 문제 상대적으로 높은 오류 부적 절 한 반응 종료 인해 발생 하는 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 시간-코스와 억제 연구. (A) 그의 ₆-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP (0.00326 m m의 최종 농도)에서 재조합 융합 단백질 기판 했다 HIV-1 홍보에 의해 죽 습 (41.2의 마지막 활성 농도에 nM), 및 형광 성 PIVQ-mEYFP 분해 파편의 릴리스를 측정 했다 시간-과정 분석을 수행 합니다. 측정은 포인트 5 다른 시간에 실행 되었다. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 2). (B) 그의₆-MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP 에이즈-1 홍보 활동에 amprenavir의 억제 효과 확인 하려면 (0.0015 m m)에서 기판으로 사용 되었다 (163.8의 총 농도에 nM). 데이터를 절반 최대한 억제 농도 (IC50) 평가 될 수 있는 플롯과 활성 효소 농도 의해 (41.2의 마지막 활성 농도 nM) 적용된 HIV-1 PR의 수 또한 계산 저해 곡선에. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6 : 효소 활동 및 자발적인 기판 분리 박사에의 의존을 공부 (A)는 그의₆-MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 기판 (0.033 m m)에 TEV PR의 효소 활동 측정 하는 데 사용 되었다 (91.42의 마지막 총 농도에서 nM) 분열 버퍼 다른 pH 6.5-8.5의 범위를 설정. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 2). 그려진된 데이터 되었습니다 이전¹⁴출판. (B) 기판 빈 샘플는 그의 자발적인 분리의 상대 형광 강도 값에 따라₆-MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 기판 (0.033 m m) 자석 구슬에서 분열 버퍼를 사용 하 여 공부 했다 과 다른 산도, 6.0 8.5 사이. 그려진된 데이터 되었습니다 이전¹⁴출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7 : 다른 방법으로는 젤에 단백질을 감지. (A) Uncleaved 및 nondenaturing 샘플 준비 후 HIV-1 홍보 소화 퓨전 단백질 기판 SDS 페이지 후 블루 빛 transillumination에 의해 시각화 했다. 분열 반응 솔루션에 소화에 의해 수행 되었다. (B) 페이지, 직후만 nondenatured 단백질에서에서 검출 될 수 젤 UV 조명, SDS의 제거 후에 의해 이전 변성된 형광 단백질 되었다 renatured 부분적으로 감지 하 고. 샘플의 Ni NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 supernatants에서 준비 되었다. (C) Coomassie 얼룩도 사용할 수 있습니다-젤 renaturation 후 단백질 검출. 젤-5 월에 SDS 현재 네이티브 단백질의 부분 변성 하지만 네이티브 샘플, nondenatured 형태는 더 풍부. 샘플의 Ni NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 supernatants에서 준비 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 8 : 분석 결과 플랫폼의 96 잘 접시 기반 적응. (A) 분석 결과 2 mL 튜브 뿐만 아니라 또한 96 잘 접시의 우물에서 수행할 수 있습니다. 여기에 우리가 야생-타입 (wt) 또는 돌연변이 (mut-1 mut-4)을 포함할 수 있는 형광 기판의 시리즈를 사용 하 여 가상 효소의 특이성을 연구 분석 결과의 응용 프로그램에 대 한 도식 적인 표현을 표시 분열 사이트 시퀀스. 자석 구슬 처리, 96-잘 호환 자성 입자 집중 (MPC)는 실험에 사용 될 것입니다. 모든 표시 된 볼륨은 단일 잘 관련이 있습니다. 다른 기판의 절단 효율성 비교를 기판 변환 관련의 기판 빈 수정 RFU 값을 고려 하 고 반응 샘플의 기판 빈 수정 RFU 값의 비율에서 평가 될 수 있다 100으로 기판 제어 샘플입니다. (B) 후 직접 또는 nondenaturing 및 변성 샘플의 경우에 젤 renaturation 후 fluorimetry, 분리 supernatants의 샘플 페이지, 및 형광 단백질 구성 요소 또한 분석할 수 분석 결과 분석할 수 준비, 각각. 세 가지 분석 결과 샘플 종류 또한 각 그림에 설명 된: C 기판 제어, B = = 기판 빈, 그리고 R = 반응. 기판 제어 샘플 기판 빈 동안 차입 버퍼에 있고 반응 샘플 분열 버퍼에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

버퍼	형광 단백질	슬로프 (%)의 CV %
차입	mTurquoise2	6.04
분열		9.11
차입	mApple	10.92
분열		12.68

표 11: 기판 교정 곡선의 차이 (%CV) 값의 계수. 재조합 형 단백질 기판의 형광 삽입된 분열 사이트에 따라 달라 집니다 여부를 테스트 하려면 교정 mApple mTurquoise2 융합 기판 (6 변종, 각 포함 하는 다른 분열 사이트의 시리즈에 의해 수행 되었다 에이즈-1 효소의 시퀀스), 차입 및 분열 버퍼에서 둘 다. 우리는 슬로프의 CV % 값은 단일 기판 교정 기판 변형 같은 형광 태그를 포함 하 여 수행 하는 다른 측정의 평가 위해 이용 될 수 있다 의미는 모든 경우에, 15% 미만 발견.

토론

분해 효소의 집중 산업 및 학술 조사 및 급속 하 고 저렴 한 HTS 호환 효소 분석 플랫폼에 대 한 일정 한 수요 적절 하 게, 우리가 개발한 자석 구슬-기반 형광 효소 분석 결과입니다. 분석 결과 널리 활용된 합성 펩 티 드 기질에 새로운 대안이 될 수 있는 재조합 융합 단백질의 사용을 기반으로 합니다.

개발된 시험 형식에서 융합 단백질 기판은 Ni 킬레이트 코팅 자석 agarose 구슬의 표면에 움직일 수 있습니다. 기판 첨부 파일 그의₆ 선호도 태그 직접 접는 촉진 하 고 기판¹³의 물 가용성을 향상 MBP 태그 융합은 융합 단백질의 N 맨끝에 의해 제공 됩니다. MBP은 TEV PR의 분열 사이트와 관심의 효소에 선행 된다. 전 수 역할 분석 결과에서 제어 분열 사이트 조사를 효소에 의해 처리 될 수 있습니다 후자의. 분열이 사이트는 상호 교환; 관심의 분열 사이트에 대 한 코딩 짧은 dsDNA 시퀀스는 결 찰에 의해 식 플라스 미드의 유연한 '복제 카세트'에 삽입할 수 있습니다. 재조합 융합 단백질 효소 해방, 형광 C 터미널 분열 제품 분해 분열 ( 따라 발표의 끝점 검출을 가능 하 게 C 터미널, 매우 안정적인, 단위체 형광 단백질 태그 포함 그림 1A). 다른 버퍼에 해결 정화 형광 그대로 기판 기판 및 분열 제품의 어 금 니 농도 평가 하기 위해 교정도 사용 됩니다. 또한, fluorimetry, 후 분석 결과 구성 요소 분석할 수 있습니다 SDS 페이지 뿐만 아니라. 두 기본 (nondenatured)와 변성된 형광 성 단백질 구상 될 수 있다는 젤에는 전기 이동 법 후 즉시 또는 다음에 젤 renaturation 후 각각. 이 추가 절차에 함께 한 기존의 Coomassie 화려한 블루 얼룩-5 월 시험 결과 (그림 1B)의 확인에 대 한 효율적으로 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 자동 환경에 완전히 적응 될 수 있는 한 낮은 볼륨 형식 간단 하 고 쉬운-을-실행 단계 분석 결과 절차에 의하여 이루어져 있다. 그러나, 독립적으로 수동으로 또는 자동화 시스템 분석 결과 수행, 분석 결과의 다음과 같은 부분으로 간주 됩니다 하지 중요 되며 절차를 수행 하는 동안 특별 한 주의 필요로. i) 자석 구슬 솔루션의. 균질 자석 구슬 솔루션 분석 결과, 모두 정화와 세척 단계에 걸쳐 사용 되어야 한다. 특히, 효소 분석 실험의 안정성 강하게에 따라 제대로 aliquoting 기판 부착 자석 구슬 (SAMB) 재고 솔루션. 서 스 펜 션 및 분산의 효과 증가 하기 위하여 2%와 10% (v/v) 사이의 구슬 농도 설정 하는 것이 좋습니다. 샘플 준비, 사용 하는 동안 버퍼 (예: 트라이 톤 X-100 또는 트윈 20) 비 세제까지 보충의 2%도 플라스틱 표면에 자석 구슬의 부착 저하 될 수 있습니다. 샘플 튜브의 벽에 구슬의 부착 구슬 정지 샘플 튜브의 벽에 대신에 튜브의 바닥을 신중 하 게 적용 되는 경우에 피할 수 있습니다. 효소 반응 동안 자석 구슬의 동질성 또한 중요 하 고 지속적으로 부 화 시 600 rpm에서 샘플을 떨고에 의해 지켜질 수 있다. V-하단 튜브의 사용 권장 하지 않습니다 동안 비즈는 제대로 둥근 또는 플랫 플라스틱 그릇에 분산 됩니다. 부적 절 한 비드 균질으로 인 한 차선의 결과 그림 4B에서 표시 됩니다. 2) 반응 샘플의 해지입니다.  방법의 또 다른 이점은 이다 효소 반응 열 변성 치료 또는 어떤 잠재적으로 방해 화학¹⁵의 사용 없이 종료 될 수 있습니다. 종료 자석 구슬 기존의 마그네틱 입자 집중 장치를 사용 하 여 반응 혼합물에서 분리 하 여 수행할 수 있습니다. 제거 반응 버퍼에 포함 되어 있는 활성 효소 생성 된 C 터미널 형광 분열 제품 uncleaved 기판 구슬에 연결 된 남아 있다. 반응 버퍼에 활성 효소의 존재로 인해 분리 절차를 신뢰할 수 있는 끝점 검출을 위한 신중 하 게 수행 해야 합니다. 집중 장치에 샘플 튜브를 배치 하기 전에 짧은 회전 원심 분리를 적용 하는 것이 좋습니다. 집중 장치에 튜브를 삽입 후 적어도 15 제공 수집 구슬에 대 한 s. 뒤로-및-앞뒤 구분의 약간의 운동 구슬의 수집을 용이 하 게 수 있습니다. 분리를 수동으로 수행된 하는 동안 종료 일반적으로 더 많은 시간이 걸립니다 보다는 반응의 개시 하는 것을 고려 하시기 바랍니다. 따라서, 약 2 분 등록 지연이 좋습니다는 식 이라고 사이 동일한 보육 시간 모든 샘플에 적용 하는 경우.

설명된 분해 분석 결과의 원리는 비교적 간단 하다; 그러나, 시스템의 유연 하 고 안정적인 기판 구조 보장 합니다. 분석 결과의 개별 최적화 선호도 구슬의 적용된 조건, 시 약, 첨가제와의 호환성만 제한 될 수 있습니다. 계약 제조 업체의 프로토콜, 우리 또한 그 Ni NTA 구슬 표면에 기판의 선호도 바인딩 실질적으로 약화 pH ≤에 6.5¹⁵발견. 따라서 기판 빈 샘플 반응 견본을 병렬을 적용 하는 것이 좋습니다 그리고 자발적인 기판 분리의 속도 결과의 평가 도중 고려 될 필요가 있다.

어디 자기 구슬-기반 분석 구슬-호환 되지 않는 구성 요소 또는 낮은 산도의 사용으로 인해 수행할 수 없습니다, 이러한 경우에 순화 된 재조합 형 기판의 솔루션에 소화도 적용할 수 있습니다. 이러한 경우에 반응 혼합물은 전기 이동 법에 의해 분석 될 수 있다 고 설명된 프로토콜에 따라 젤에 단백질을 구상 될 수 있다. 분해 활동을 조사, 솔루션에서 소화 및 단백질의 젤에서 검출 될 수 있습니다 fluorimetry의 대체 도구. 설계 기판 시스템의 참신은 SDS 페이지를 변성 시키기 후에 젤 renaturation 단계의 응용 이다. 네이티브 (nondenatured) 형광 단백질 전기 이동 법 동안 그들의 형광을 유지 하는 동안 변성 (그림 7B) 시 형광 속성은 폐지 됩니다. 그러나, 변성된 단백질의 형광 젤에서 SDS의 제거에 의해 부분적으로 복구할 수 있습니다. 따라서, 변성 조건을 사용 하 여 반응 컴포넌트의 분리 가능 하 게 형광 기반 뿐만 아니라 분자 무게-기반 식별. Coomassie 스테인드 젤의 분석에 비해 형광에서 젤 탐지의 또 다른 장점은 이다 (네이티브 또는 renatured) 형광 단백질은 쉽게 그들의 형광에 따라 젤에 확인할 수 있습니다 ( 그림 7참조). 분열 반응 nonfluorescent 오염 물질을 포함 하는 샘플에서 수행 하는 경우 또는 매우 닮은 서로 분자 무게 단백질이 중요 한 수 있습니다.

효소 분석 실험을 사용 하 여 유사 하 게 설계 된 기판에 이미 출판 이전^8,,910, 그리고 비록 이러한 경우에 대 한 관심의 분열이 사이트는 또한 선호도 태그 사이 형광 단백질, 제시 하는 분석 결과 시스템 여기 뿐만 아니라 기술된 아이디어를 반복 하지만 이전 플랫폼의 다른 장점 결합 한 고도 더 개선 완료: i) MBP 융합 파트너의 활용 ii)는 TEV 홍보 제어 분열 사이트, iii의 존재) 새로 설계 된 단위체 FPs, 및 iv를 사용 하 여) 독특한 기판 교정 절차의 응용 프로그램. 자체 분석 결과 특히 효소 특이성 및 운동 연구, 비싼 계측에 대 한 필요 없이 시간 및 비용 효율적인 방법으로 안전에 유용 하도록 설계 되었습니다. 메서드는 두 산업 및 학술 연구 목적 적합 하 고 저렴 한 도구 될 목적 이다. '복제 카세트' 식 플라스 미드의 유연성으로 인해 시스템 재조합 기판 라이브러리의 신속 하 고 저렴 한 세대에 대 한 적합 한 수 있습니다. 여기 설명된 분석 결과 기질 특이성, 효소 mutagenesis의 구현에 대 한 가능한 도구 이며, 억제 연구 하 고, 또한, 효소 활동을 수행 하는 다른 도구를 제공. (운동 매개 변수의 결심에 세균성 세포 파쇄)에서 분석 결과 플랫폼 HTS 및 자동화 기반 환경에 적응 시킬 수 있다 하 고, 산업 protease 억제제 검사 및 항 바이러스 약물에 잠재적으로, 적용 될 수 있습니다. 개발입니다. 또한, 경쟁력 있는 베이스에 대 한 분석 결과의 적응은 또한 우리의 실험실의 범위 미래에. 같은 경쟁 분석 결과, 다른 C 터미널 형광 태그-는 조사는 연구의 기본 설정 같은 분열 반응에 동시에 사용할 수를 융합 두 다른 기판 각 포함 하는 다른 분열 사이트 주어진된 대상 시퀀스에 대 한 효소입니다. 또한, 96 잘 접시 적응 분석 결과 양식 (그림 8)의 사용은 또한 되 고 최적화 돌연변이 검사 수정된 분열 사이트 시퀀스 시스테인 프로 테아 제 경우 기판의 시리즈를 사용 하 여.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10K Amicon tubes	Merck-Millipore	UFC501096
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	M6250
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1	Bio-Rad	1610148
Acetic acid	Merck	100063
Agarose	SERVA	11404.04
Alpha Imager HP gel documentation system	ProteinSimple
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	A3678
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge	Beckman Coulter	392185
Black half-area plates	Greiner bio-One	675086
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	B0126
CutSmart buffer (10x)	New England Biolabs	B7204S	For plasmid linearization (step 1.1.1)
Dark Reader transilluminator	Clare Chemical Research	DR-45M
DNase I	New England Biolabs	M0303L
Dynamag-2 magnetic particle concentrator	Thermo Fischer Scientific	12321D
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells	Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)	C600003
Ethanol	Merc-Millipore	100983
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	798681
Gel Loading Dye, Purple (6X)	New England Biolabs	B7024S
Glycerol	Merck	356350
Glycine	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	G7126
High-Speed Plasmid Mini Kit	GeneAid	PD300
Imidazole	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	56750
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)	AM9464
Jouan CR 412 centrifuge	Jouan	CR412
Labinco LD-76 Rotator	Labinco	7600
Luria-Bertani (LB) broth	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	L3022
Lysozyme	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	L6876
Magnesium chloride	Scharlau	MA0036
MERCK eurolab ultrasonic bath	MERCK	USR54H
Millifuge Eppendorf spin centrifuge	Millipore	CT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell	Bio-Rad
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	T9281
NanoDrop 2000	Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonuclease	New England Biolabs	R3131L
Nickel(II) sulfate (NiSO4)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	656895
Ni-NTA magnetic agarose beads	Qiagen	36113
Orbital shaker	Biosan	OS-20
PacI restriction endonuclease	New England Biolabs	R0547L
PageBlue Protein Staining Solution	Thermo Fischer Scientific	24620
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	P7626
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes	Eppendorf	22431102
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
Snijders Press-to-Mix shaker	Gemini	34524
Sodium-acetate trihydrate	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	S7670
Sodium-chloride	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	S9888
Sodium-hydroxide	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Thermo Fischer Scientific	S7563
T4 DNA ligase	Promega	M180A
Thermo shaker	Biosan	TS-100	with SC-24 accessory block
Tris	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)	P2287
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter	Wallac Oy, Turku, Finland