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요약

지속적인 화학 물질의 트랜스 및 다세대 효과는 환경과 인간의 건강에 대한 장기적인 결과를 판단하는 데 필수적입니다. 우리는 자유로운 살아있는 선충 예쁜 꼬마 예쁜꼬마선충을 사용하여 트랜스 및 다세대 효과를 연구하기위한 새로운 상세한 방법을 제공합니다.

초록

화학 물질의 독성에 대한 정보는 응용 및 폐기물 관리에 필수적입니다. 낮은 농도에서 화학 물질에 대 한, 장기적인 효과 환경및 인간의 건강에 그들의 결과 판단에 매우 중요 하다. 장기적인 영향을 입증할 때, 최근 연구에서 여러 세대에 걸친 화학 물질의 영향은 새로운 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 자유로운 살아있는 선충 예쁜꼬마선충을 사용하여 여러 세대에 걸쳐 화학 물질의 효과를 연구하기위한 프로토콜을 설명합니다. 2개의 양상이 제시됩니다: (1) trans-generational (TG) 및 (2) 다세대 효과 연구, 후자는 다세대 노출 (MGE) 및 다세대 잔류 (MGR) 효과 연구로 분리됩니다. TG 효과 연구는 부모에 화학 물질 노출자자식에 어떤 잔여 결과 귀착될 수 있는지 여부를 결정하는 간단한 목적을 가진 강건합니다. 효과에 대한 효과가 부모에 측정 된 후, 나트륨 하이포 염염 용액은 부모를 죽이고 자손을 유지하는 데 사용되어 자손에 대한 효과 측정을 용이하게합니다. TG 효과 연구는 부모가 오염 물질에 노출될 때 자손이 영향을 받는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. MGE 및 MGR 효과 연구는 연속적인 세대 노출이 세대에 걸쳐 자손에 적응 반응을 초래할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 체계적으로 사용됩니다. 각 세대에 대한 효과 측정을 용이하게 하기 위해 세대를 구별하기 위해 신중한 픽업 및 이송이 사용됩니다. 우리는 또한 운동 행동, 재생산, 수명, 생화학 및 유전자 발현 변화를 측정하기 위해 프로토콜을 결합했습니다. 몇 가지 예의 실험은 또한 트랜스-및 다세대 효과 연구를 설명하기 위해 제시된다.

서문

화학 물질의 적용 및 폐기물 관리는 특정 농도에서 그 효과의 정보에 크게 의존한다. 특히, 시간은 효과와 농도 사이 또 다른 필수 요소. 즉, 화학 물질, 특히 실제 환경에서 낮은 농도의 화학 물질은 측정 가능한 효과를 유발할 시간이 필요합니다1. 따라서, 연구원은 동물 실험에 있는 노출 기간의 다른 길이를 배열하고, 심지어 전체 수명 주기를 커버합니다. 예를 들어, 마우스는 니코틴에 30, 90 또는 180일 동안 그 독성 효과를 연구하기 위해 2. 그러나, 이러한 노출 기간은 여전히 환경에서 유기체의 세대에 걸쳐 지속 될 수있는 오염 물질 (예를 들어, 지속적인 유기 오염 물질 [POPs])의 장기적인 효과를 해명하기에 충분하지 않습니다. 따라서, 세대에 걸쳐 효과에 대 한 연구 점점 더 많은 관심을 얻고 있다.

세대 간 효과 연구에는 두 가지 주요 측면이 있습니다. 첫 번째는 부모에게 화학 물질 노출이 자손에 어떤 결과를 초래할 수 있는지 여부를 강력하게 테스트 할수있는 트랜스 세대 (TG) 효과 연구입니다 3. 두 번째는 노출 및 잔류 효과 모두에서 고려 사항으로 보다 체계적인 다세대 효과 연구입니다. 한편으로는, 다세대 노출(MGE) 효과는 장기적으로 어려운 환경에 대한 동물의 적응반응을 설명하기 위해 사용된다. 한편, 다세대 잔류(MGR) 효과는 모계 노출이 제1 자손및 생식선 노출에 대한 배아 노출을 수반하기 때문에 노출 후 장기 잔류 결과를 입증하는 데 사용됩니다. 노출 4에서 완전히 1 세대로 세 번째자손을 만드는 자손 .

포유류 (예를 들어, 마우스)는 특히 인간과 관련하여 독성 연구에서 모델 유기체이지만, 세대적 효과를 연구하는 그들의 응용 프로그램은 매우 시간이 많이 걸리고, 비싸고 윤리적으로 관한5. 이에 따라 갑각류 다프니아 마그나6, 곤충 드로소필라 멜라노가스터7 및 제브라피시 다니오 레리오8을포함한 유기체는 대안을 제공한다. 그러나, 이 유기체는 인간과 유사성이 결여되거나, 연구 결과에 있는 특정 장비를 요구합니다.

예쁜꼬마선충은 짧은 수명주기(20°C에서 약 84시간)를 가진 작은 자유생활선충(길이 약 1 mm)이다.9. 이러한 선충은 인간에게 보수적인 많은 생물학적 경로를 공유하며, 따라서 다양한 응력 또는 독성물질(10)의 효과를 설명하기 위해 널리 사용되고 있다. 특히, 선충의 99.5%는 이 유기체가 세대적 효과를 연구하는 데 매우 적합한 헤르마마로디트(hermaphrodites)이며,예를 들어, 중금속과 설폰아미드의 TG 효과 3,11,금 나노입자 및 중성의 MGE 효과 금속12 및 온도13,설폰아미드14의MGR 효과, 감마 조사15 및 린딘4의MGE 및 MGR 효과 모두. 더욱이, 유사 한 결과 화학 물질의 효과 사이 발견 되었다 (예를 들어, zearalenone) 개발 및 쥐와 C. elegans의재생에16,17,추정 하는 이점을 제공할 것 이다 인간에 이 작은 동물에서 효과.

TG 및 MG 효과 연구는 시간이 오래 걸리며 신중한 설계와 성능이 필요합니다. 특히, 앞서 언급한 연구에서 생활 단계 선택, 노출 조건 및 세대 분리 방법에 차이가 존재했습니다. 이러한 차이는 결과 간의 직접적인 비교를 방해하고 결과의 추가 해석을 방해했다. 따라서 TG 및 MG 효과 연구를 안내하는 균일 한 프로토콜을 확립하고 장기적인 결과에서 다양한 독성 물질 또는 오염 물질의 유사한 패턴을 밝히기 위해 더 큰 그림을 제공하는 것이 필수적입니다. 본 프로토콜의 이상 목표는 C. elegans와트랜스 및 다세대 효과를 연구하는 명확한 운영 프로세스를 보여줍니다. 이 프로토콜은 독성물질이나 오염물질의 장기적인 효과를 연구하는 데 관심이 있는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

프로토콜

1. 문화 대장균 OP50

  1. 100 mL 의 물에 4g의 수산화 나트륨을 용해시켜 1M 수산화 나트륨 용액을 준비하십시오.
  2. 1L 원추형 플라스크에 1L의 초순수 1L와 함께 트립톤 10g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 10g을 용해시켜 리소제니 육액(LB) 배지를 준비합니다. 1M 수산화 나트륨 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다.
  3. 1.2단계에서 20개의 원추형 플라스크(최대 허용 부피: 100 mL)로 LB 액상 배지를 각각 50 mL 배지로 Aliquot. 원추형 플라스크를 크래프트 페이퍼로 덮습니다.
  4. LB 액상 배지를 121°C 및 0.105 MPa에서 20분 동안 살균합니다.
  5. 박테리아 현탁물로부터 피펫 200 μL(단계 1.8 참조) 또는 접종 루프를 사용하여 한천으로부터 작은 콜로니를 선택(단계 2.14)을 선택하여, LB 배지에 놓는다.
  6. LB 배지를 37°C에서 150 rpm에서 24-48시간 동안 흔들어 서 배양한다. LB 배지는 갈색 투명 액체에서 탁한 카키 색 서스펜션으로 변경됩니다.
  7. 총 플라스크의 80%에서 세균 현탁액을 사용하여 대장균 OP50을 2.11단계에서 사용할 선충식품으로 제공한다.
  8. 세균 현탁액을 함유한 나머지 플라스크를 4°C의 냉장고에 보관합니다. LB 현탁액의 피펫 200 μL은 신선한 LB 배지의 상측상에 상측(단계 1.4)에 상한 및 후속 배양을 위한 1.6단계를 반복한다.

2. 문화 C. 예쁜꼬마선충

참고: 문화 C. 선충은 표준 방법18에기초하여 단계 2.1 에서 2.11에 따라 사용한다.

  1. K2 HPO4•3H2O 의 22.8 g을 멸균 증류수 100 mL에 용해하십시오.
  2. 멸균 증류수 50 mL에 KH2PO4 6.8 g을 용해시.
  3. 2.1 단계 및 2.2로부터 용액을 혼합하고, 1 M K2HPO 4-KH2PO4 버퍼(pH 6.0, 총 150 mL)를 준비한다.
  4. MgSO4•7H2O의 멸균 증류수 5mL에 1.232 g을 용해시켜 1.0 M MgSO4를 준비하고 0.22 μm 멸균 일회용 멤브레인 필터를 통해 용액을 멸균 용기에 걸러 서 살균합니다.
  5. 멸균 증류수 5mL에 0.554 g의 CaCl 2를 용해시켜 1 M CaCl2를 준비하고 0.22 μm 멸균 일회용 멤브레인 필터를 통해 용액을 멸균 용기에 걸러 서 살균합니다.
  6. 절대 에탄올 5 mL에 0.025 g의 콜레스테롤을 용해시켜 1 M 콜레스테롤 용액을 준비하고 0.22 μm의 멸균 일회용 멤브레인 필터를 통해 용액을 멸균 용기에 걸쳐 살균합니다.
  7. 한천 분말 17 g, 펩톤 2.5 g, 염화나트륨 3 g을 초순수 1L를 함유한 원추형 플라스크 1L에 첨가하여 선충성장배지(NGM) 한천을 준비한다. 2.3단계에서 K2HPO4-KH2PO4 용액 25mL를 추가합니다.
  8. NGM 한천을 121°C에서 2.7단계에서 0.105 MPa로 20분 동안 살균하였다.
  9. NGM 한천을 약 50°C로 냉각시키고, 1 ML의 1 mL을 첨가하여4MMCaCl2,5 mg/mL 콜레스테롤-에탄올 용액을 2.4단계에서 2.6°F로 배지에 넣고 철저히 섞는다.
  10. 접시 당 ~ 10 mL NGM 한천 배지를 100 개의 멸균 페트리 접시 (직경 6.0 cm)에 붓습니다. 페트리 접시의 매체를 실온으로 식혀 고체 한천을 형성합니다.
  11. 피펫 170 μL의 세균 현탁액은 멸균 팁을 사용하여 전술한 NGM 한천상에서 1.7단계까지. NGM 한천을 약간 흔들어 LB 배지를 NGM 한천 표면에 고르게 분배합니다.
  12. NGM 한천을 37°C에서 위쪽으로 접종하여 8-12시간 동안 세균성 잔디를 형성한다.
  13. 2.12 단계에서 세균성 잔디와 한천의 대부분을 사용 하 여 배양 선충 단계 2.15 또는 2.19.
  14. 4°C의 냉장고에서 수분 증발과 오염을 피하기 위해 1또는 2개의 한천을 거꾸로 보관하여 박테리아를 오염시유지합니다.
  15. 스타킹 NGM 한천에 2,000 개 미만의 선충이있을 때 (이전 실험에서 또는 다른 실험실에서 재능), 멸균 팁C. 예쁜 꼬마를 포함하는 NGM 한천의 6 분의 1을 잘라 세균과 새로 준비 NGM 한천에 전송 잔디 (단계 2.13에서). NGM 한천을 후속 배양에 대해 22°C 인큐베이터에 위쪽으로 유지한다.
  16. 스타킹 NGM 한천에 2,000 개 이상의 선충이있을 때, 원심 분리 튜브에 멸균 수 2 mL로 NGM 한천의 선충을 플러시합니다. 2mL의 물을 입력하면 약 1.5mL의 출력이 생성됩니다.
  17. 선충이 30 분 동안 원심 분리튜브에 정착할 수 있게 하십시오. 파이펫팅으로 초월제 1 mL을 버리고 각 튜브에 멸균 수 1 mL을 추가하여 펠릿 (즉, 선충)을 씻으십시오.
  18. 원심분리기 튜브에 선충을 30 분 동안 정착. 파이펫팅에 의해 초월제의 1 mL을 폐기. 선충을 다시 중단하기 위해 각 튜브에 멸균 수 1 mL을 추가하십시오.
  19. 선충 현탁액 (총 약 1.5 mL)을 배관하여 세균성 잔디 (단계 2.13에서)로 각각의 새로운 NGM 한천에 150 μL을 배관하여 총 8-10 개의 새로운 NGM 한천을 만듭니다.
  20. NGM 한천을 2.19단계에서 20°C 인큐베이터에서 업사이드업한 후 후속 배양을 위해 업사이드로 유지한다.
  21. 3일마다 2.15단계 또는 2.16-2.20단계를 반복합니다.

3. C. 예쁜 꼬마의 동기화 된 계란과 L3 애벌레를 준비

  1. NGM 한천에서 새로 생산된 선충과 새로 생산된 달걀을 멸균 원심분리기로 씻어내고, 각 NGM 한천에 2mL의 멸균수를 배출하여 약 1.5mL의 출력을 생성합니다.
  2. 원심 분리관에 선충을 30 분 동안 정착 한 다음 파이펫팅으로 초월제의 85 %를 버립니다.
  3. NaOH 0.6 g과 NaOCl 5 mL (4-6 % 활성 그라데이션, 자세한 내용은 재료 표 참조)을 25 mL의 물로 용해시켜 나트륨 하이포아염소산염 용액을 준비하여 NaOH를 0.5 M 및 NaOCl을 1 %로 가져옵니다.
  4. 3.2 단계 (V 0으로 부피를표시)에서 펠릿을 7 배 V0의 하이포아염소산나트륨 용액 (단계 3.3, 즉, 부피 비 1:7)19와 혼합한다.
  5. 원심분리기 튜브를 2분마다 10-15분 동안 흔들어 애벌레와 성인 선충을 용해시키고; 선충 현탁액의 색상은 탁한에서 취소로 바뀝니다.
  6. 튜브를 20°C에서 3분 동안 700 x g으로 원심분리한 다음 피펫팅에 의해 초자연자를 버린다.
  7. 노화가 동기화된 계란을 세척하기 위해 멸균수의 5배 V0에 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 700 x g에서 20°C에서 3분 동안 원심분리기를 한 다음, 초자연자를 버린다.
  8. 3.7단계를 두 번 반복합니다.
  9. 1배 V0의 멸균수를 튜브에 추가하여 노화와 동기화된 계란을 다시 일시 중단시냅니다.
  10. 2.13단계에서 세균성 잔디가 있는 새로운 NGM 한천에 50 μL을 파이펫팅하여 계란 현탁액을 분배한다. NGM 한천을 20°C 인큐베이터에서 30분 동안 위쪽으로 유지하여 물이 증발하거나 세균성 잔디에 흡착될 수 있도록 합니다. 그런 다음 NGM agars를 후속 문화로 위쪽으로 만듭니다. 시간을 달걀 시간(T계란)으로 표시합니다.
  11. K-배지를 1L의 물에 NaCl 3 g과 KCl 2.36 g을 용해시켜 준비합니다. 121 °C및 0.105 MPa에서 20 분 동안 배지를 살균하고 실온으로 식힙니다.
  12. 시간이 도달 하면 36 T계란후 시간, 선충 L3 유충 단계 (L3 선충)20에도달 합니다. NGM 한천에서 선충을 원심분리기로 씻어내고 각 NGM 한천에 2 mL의 멸균수를 사용하여 약 1.5 mL의 출력을 생성합니다.
  13. 30 분 동안 침전 한 후, 2 시간에서 K-medium으로 (피펫팅으로) 슈퍼 나태한물질의 85 %를 교체하여 용기에서 음식을 소화합니다 3.
  14. 상급자를 버리십시오. K-medium(단계 3.11부터)을 사용하여 선충 현탁액을 후속 실험을 위해 100 μL당 약 200개의 선충으로 조정합니다.

4. 세대 간 효과 연구에 C. 예쁜꼬마선충 사용

  1. 5개의 농도 수준과 하나의 용매 또는 절대 제어, 즉 총 6개의 그룹으로 화학 솔루션을 준비합니다.
  2. 100 μL의 제어 또는 화학 용액을 추가하여 10 개의 우물을 각 그룹 (즉, 총 60 웰)에서 가장자리 효과를 피하기 위해 96 웰 멸균 마이크로 플레이트의 중간 영역에 복제하십시오.
  3. 선충 현탁액을 3.14 단계에서 K-medium으로 3.11 단계에서 10 배로 희석하십시오. 4.2단계에서 60개의 웰각각에 100 μL 선충 현탁액을 추가합니다. 시간을 t0으로표시합니다.
  4. 시간이 t0후 24 h에 도달하면 우물에서 살아있는 선충과 죽은 선충을 계산합니다. 치명적인 평균 농도(LC50)를계산합니다.
  5. LC50 값의 10% 미만의 5농도 시리즈를 준비합니다.
  6. 100 μL의 제어 또는 화학 용액 (단계 4.5에서)을 추가하여 각 그룹 (즉, 총 60 개의 우물)을 각 그룹에서 복제하여 가장자리 효과를 피하기 위해 96 웰 멸균 마이크로 플레이트의 중간 영역에 복제하십시오.
  7. 약 200 L3 선충(단계 3.14에서)을 포함하는 K-배지의 100 μL을 단계 4.6으로부터 60개의 웰각각에 첨가한다. 시간을 T0으로표시합니다.
  8. T0이후 24 ~96시간 동안 노출을 수행합니다.
  9. 노출 후, 각 그룹의 5개의 우물로부터 선충을 파이펫팅(즉, 총 6개의 튜브)에 의해 1.5 mL 원심분리기 튜브로 수집한다.
  10. 선충을 30 분 동안 정착시키고, 파이펫팅으로 상황제를 버리고, 멸균 된 물 1 mL로 바닥에 선충을 다시 일시 중단하고 씻으십시오.
  11. 선충을 30 분 동안 정착시키고, 파이펫팅으로 상황제를 버리고 F0으로 표시된 노출 된 부모 생성의 지표 측정 (섹션 7 참조)을 위해 하단에있는 선충을 사용합니다.
  12. 4.10단계에 따라 4.9단계에서 각 군의 나머지 5개의 우물로부터 선충을 수집, 정착 및 세척한다.
  13. 4.12 단계에서 선충을 30 분 동안 정착시고 피펫팅하여 초월제를 버리고 선충을 다시 일시 중단하기 위해 멸균 수 100 μL을 추가하십시오. 선충 현탁액을 2.13 단계에서 세균성 잔디가 있는 3개의 새로 준비된 NGM 한천에 고르게 옮김을 전달한다.
  14. 선충을 36시간 동안 배양하여 그라비드가 되고 3.1-3.9단계에 따라 연령 동기화를 수행한다. 36 시간 동안 단계 2.13에서 세균성 잔디와 각각의 NGM 한천에 동기화 된 계란을 배양.
  15. NGM 한천의 선충을 4.14 단계에서 6 개의 원심 분리관으로 플러시합니다.
  16. 선충을 30 분 동안 정착시키고 피펫팅으로 상황제를 버립니다. 1 mL의 멸균된 물로 펠릿을 다시 일시 중단하고 세척하십시오.
  17. 선충을 30 분 동안 정착시키고 피펫팅으로 상황제를 버립니다. T1로 표시된 자손 생성의 지표 측정(섹션 7 참조)을 위해 하단에 있는 선충을 사용합니다.

5. 다세대 노출(MGE) 효과 연구에 C. 예쁜꼬마선충 사용

  1. 99.0 mL NGM 한천(단계 2.9로부터)을 1 mL의 제어 또는 화학 적 용액과 혼합합니다(예로서 본 프로토콜에서 저농도 및 고농도, 즉 총 3개의 그룹).
  2. 접시 당 NGM 한천 배지의 약 10 mL를 5.1 단계에서 100 개의 멸균 페트리 접시 (직경 6.0 cm)에 붓습니다. 페트리 접시의 매체를 실온으로 식혀 고체 한천을 형성합니다.
  3. 한천에 피펫 세균 현탁액은 단계 2.11에 따라.
  4. 페트리 접시의 상부 뚜껑을 따로 놓고 세균성 잔디를 자외선(145 μW/cm 2)에 15분 동안 생체 안전 캐비닛에 노출시십시오.
  5. 접종 루프를 사용하여 작은 식민지를 선택하고 1.4 단계에서 한천에서 LB 배지에 놓습니다. LB 배지를 37°C에서 150 rpm의 속도로 24시간 동안 흔들어 서 서 무시할 세균 성장을 확인 하 고, 살해 단계 5.4를 확인 합니다.
  6. 3.9단계에서 부터 한천으로 의성전을 한 달걀로 피펫(5.4단계)한다. 상위 세대 F0에 대한 노출의 시작을 표시하고 Day 0(D0)으로 표시합니다.
  7. 한천을 20°C에서 3d동안 배양한다. 그런 다음 (즉, D3에서 성숙한 선충을 사용하여 F0에서 효과를 측정합니다(섹션 7 참조).
  8. 또한 D3에서는 F0 성숙한 선충을 유리 막대를 사용하여 새로운 NGM 한천 (5.4 단계에서)에 선택하고, 그 끝에는 링으로 구부러진 인공 섬유 와이어가 장착되어 있습니다.
  9. D4에서 NGM 한천에서 성숙한 F0 선충을 골라 버린다. 2세대 노출을 경험하기 위해 새로 부화한 자손 선충을 24시간(D3에서 D4까지)에 F1로 표시합니다.
  10. D6에서는 3일 동안 노출을 경험한 F1 성숙한 선충의 지수(섹션 7 참조)를 측정합니다.
  11. D9에서 5.8-5.10 단계를 반복하고 F1 선충을 사용하여 F2 웜을 재현하고 F2 선충에 미치는 영향을 측정합니다.
  12. D12에서 5.11 단계 반복, F2 선충을 사용 하 여 F3 벌레를 재현 하 고 F3 선충에 미치는 영향을 측정. 같은 방법으로 자손을 재현하고 nth 자손 생성 (Fn)에 대한 MGE 효과를 측정합니다.

6. 다세대 잔류(MGR) 효과 연구에 C. 예쁜꼬마선충 사용

  1. 5.1-5.7단계를 반복합니다. D3에서 화학 물질을 추가하지 않고 새로운 NGM 한천에 F0 성숙한 선충을 선택하십시오 (단계 2.13에서).
  2. D4에서 성숙한 F0 선충을 골라 버리십시오. 새로 부화한 자손 선충을 이 24시간 내에 T1 선충으로 표시하십시오.
  3. D6에서 3일 동안 성장한 T1 성숙한 선충의 지수(섹션 7 참조)를 측정합니다.
  4. D9에서 6.2-6.3 단계를 반복하고 T1 선충을 사용하여 T2 선충을 재현하고 T1 선충에서 효과를 측정합니다.
  5. D12에서 6.4 단계를 반복하여 T2 선충을 사용하여 T3 선충을 재현하고 T2 선충에서 효과를 측정합니다. 같은 방법을 통해, 자손을 재현하고 F0의 nth 자손 생성 (Tn) 선충, 또는 단계 5.12에서 Fn의 nth 자손 (Tn') 선충에 MGR 효과를 측정합니다.

7. 측정 지표

  1. 운동 동작을 측정합니다.
    1. 멸균수를 사용하여 NGM 한천에서 선충을 씻어 내고 원심 분리관으로 수집합니다. 선충을 30 분 동안 정착시키고, 상황제를 버리고 펠릿에 선충을 사용하여 효과 측정하십시오.
    2. 1 mL의 멸균 수로 펠릿의 선충을 다시 중단하고 단계 2.10에서 세균성 잔디없이 NGM 한천에 피펫.
    3. 해부 현미경을 사용하여 60초 간격 내에서 인두의 후방 전구가 이동 경로의 수직 방향을 따라 방향을 변경하는 시간을 지칭하는 (수의) 신체 굽힘 주파수(BBF)에 대해 선충을 채점한다.
    4. 해부 현미경을 사용하여 60초 간격으로 후진 회전 및 오메가 턴(OT)을 포함하여 이동 방향이 90° 이상 변하는 시간을 의미하는 반전 운동(RM)을 점수화합니다. OT는 선충의 머리가 그리스 문자 오메가 (Ω)와 같은 선충 모양을 만드는 꼬리를 만지거나 거의 만질 때 움직임을 말합니다.
      참고: 적어도 6개의 선충은 각 실험 복제본에서 각 치료에 대해 조사되었다.
MGE(F0 to F3)가 3군(1개의 대조군 및 2개의 노출 치료)을 가진 재생 및 수명에 미치는 효과에 대한 예.
하루MGE 연구를 위한 NGM 한천 번호설명
수명재생산
030 (F0 노출)각 그룹에 대해 10개의 복제가 F0-1-1-0에서 F0-3-10-0으로 표시되고, 마지막 숫자는 생존 일자입니다.
1개30 (F0은 1d 생존)F0-1-1-0에서 F0-3-10-0으로 F0-1-1-1에서 F0-3-10-1로 변경해야 합니다.
2개30 (F0 은 2 d 생존)F0-1-1-1에서 F0-3-10-1로 F0-1-1-2로 변경해야 합니다.
3 d까지 F0 선충을 전송할 필요가 없습니다.
3개30 (F0 은 선충 이송 및 수집 후 삭제 된 3 d 생존)3 d 후, F0 선충은 성숙하고 36 새로운 NGM 한천 (각 한천에 2 선충)은 생존과 번식을 관찰하는 데 사용됩니다.
36 (F0-1-1-3 ~ F0-3-12-3)예비 실험은 F0 선충의 수를 배열하기 위해 수행되어야한다, 다세대 작업을 성공하기위한 적어도 200 자손을 보장.
특히, MGR 효과 연구 하는 경우, F0 선충 화학 노출 없이 명확한 NGM 한천에 전송 해야 합니다., 그리고 T1 시작으로 주목 해야 한다.
F0 선충의 대부분은 화학 및 유전 지수를 측정하기 위해 수집되고 F0의 30 한천은 삭제됩니다.
4개36 (F0-1-1-4 ~ F0-3-12-4)36 (F1-1-1-1 ~ F1-3-12-1)수명 및 재생에 대한 측정은 매일 전송이 필요합니다.
F0-1-1-3에서 F0-3-12-3에 부모 선충은 F0-1-1-4에 F0-3-12-4로 표시된 새로운 NGM 한천에 선택됩니다.
F0-1-1-3에서 F0-3-12-3 한천의 나머지 자손 선충(즉, MGE의 F1 또는 T1)은 1d로 성장했으며 마커는 F1-1-1-1에서 F1-3-12-1로 변경됩니다. 이 한천은 또한 매일 전송F1의 수명을 모니터링하는 데 사용됩니다.
5개36 (F0-1-1-5 ~ F0-3-12-5)36 (F1-1-1-2 ~ F1-3-12-2)F1-1-1-1-1에 F1-3-12-1 한천에 선충은 2 d 성장하고 쉽게 관찰되고 선충이 계산되고, 마커는 F1-1-1-2F1-3-12-2로 변경됩니다.
36 (F0-1-1-4 ~ F0-3-12-4)F0-1-1-4에서 F0-3-12-4 한천의 자손 선충은 1 d로 성장했습니다.
6개36 (F0-1-1-6 ~ F0-3-12-6)36 (F0-1-1-4 ~ F0-3-12-4, 카운트 후 클리어)F1-1-1-2에서 F1-3-12-2 한천에 대한 선충은 3 d로 성장하고 마커는 F1-1-1-3F1-3-12-3로 변경됩니다. 특히, F1 선충은 이 날 F2를 재현하기 시작, F1 선충은 F2-1-1-0F1-3-12-0에 F2-1-1-0을 만드는 새로운 NGM 한천에 전송되어야한다. MGR 연구의 경우, T2는 오늘부터 시작됩니다.
36 (F1-1-1-3 ~ F1-3-12-3)36 (F0-1-1-5 ~ F0-3-12-5)이것은 화학 노출에 의해 연기될 수 있고, 그러므로 유연한 변경은 후속 세대를 위한 충분한 선충을 지키기 위하여 각 실험에서 수행되어야 합니다.
36 (F2-1-1-0 ~ F1-3-12-0)F0-1-1-4에서 F0-3-12-4 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
F0-1-1-5에서 F0-3-12-5 한천에 대한 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
7명36 (F0-1-1-7 ~ F0-3-12-7)36 (F0-1-1-5 ~ F0-3-12-5, 카운트 후 클리어)F0-1-1-5에서 F0-3-12-5 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-4 ~ F1-3-12-4)36 (F0-1-1-6 ~ F0-3-12-6)F1-1-1-1에서 F1-3-12-1 agars, F0-1-1-4에서 F0-3-12-4 agars 및 F0-1-1-5에서 F0-3-12-5의 전체 선충 번호는 F0의 초기 재생을 계산하는 데 사용됩니다.
36 (F2-1-1-1 ~ F2-3-12-1)F0-1-1-6에서 F0-3-12-6 한천에 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F2-1-1-0에서 F1-3-12-0으로 의 F2 선충은 1d로 성장했으며 마커는 F2-1-1-1에서 F2-3-12-1로 변경됩니다.
8개36 (F0-1-1-8 ~ F0-3-12-8)36 (F0-1-1-6 ~ F0-3-12-6, 카운트 후 클리어)F0-1-1-6에서 F0-3-12-6 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-5 ~ F1-3-12-5)36 (F0-1-1-7 ~ F0-3-12-7)F0-1-1-7에서 F0-3-12-7 한천에 F0의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-2 ~ F2-3-12-2)36 (F1-1-1-4 ~ F1-3-12-4)F1-1-1-4에서 F1-3-12-4 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-1-F2-3-12-1, 카운트 후 F2-1-1-2에서 F2-3-12-2로 변경)F2-1-1-1에서 F2-3-12-1의 선충은 2d로 성장했으며 선충은 계산되며 마커는 F2-1-1-2에서 F2-3-12-2로 변경됩니다.
9개36 (F0-1-1-9 ~ F0-3-12-9)36 (F0-1-1-7 ~ F0-3-12-7, 카운트 후 클리어)F0-1-1-7에서 F0-3-12-7 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-6 ~ F1-3-12-6)36 (F1-1-1-4 ~ F1-3-12-4, 카운트 후 클리어)F1-1-1-4에서 F1-3-12-4 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-3 ~ F2-3-12-3)36 (F0-1-1-8 ~ F0-3-12-8)F0-1-1-8에서 F0-3-12-8 한천에 F0의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-0 ~ F3-3-12-0)36 (F1-1-1-5 ~ F1-3-12-5)F1-1-1-5에서 F1-3-12-5 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F2-1-1-2에서 F2-3-12-2의 선충은 3일 동안 성장했으며 마커는 F2-1-1-3에서 F2-3-12-3으로 변경됩니다. F2 선충은 오늘 재현하기 시작하고 그들은 36 새로운 NGM 한천이 필요하고 F3-3-12-0에 F3-1-1-0으로 표시로 전송됩니다. MGR 연구의 경우, T3는 오늘부터 시작됩니다.
10개36 (F0-1-1-10 ~ F0-3-12-10)36 (F0-1-1-8 ~ F0-3-12-8, 카운트 후 클리어)F0-1-1-8에서 F0-3-12-8 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-7 ~ F1-3-12-7)36 (F1-1-1-5 ~ F1-3-12-5, 카운트 후 클리어)F1-1-1-5에서 F1-3-12-5 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-4 ~ F2-3-12-4)36 (F0-1-1-9 ~ F0-3-12-9)F2-1-1-1에서 F2-3-12-1, F1-1-1-4에서 F1-3-12-4 agars 및 F1-1-1-5에서 F1-3-12-5의 전체 선충 번호를 사용하여 F1의 초기 재생을 계산합니다.
36 (F3-1-1-1 ~ F3-3-12-1)36 (F1-1-1-6 ~ F1-3-12-6)F0-1-1-9에서 F0-3-12-9 한천에 F0의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F1-1-1-6에서 F1-3-12-6 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F3-1-1-0에서 F3-3-12-0 한천의 자손 선충은 1d로 성장했으며 마커는 F3-1-1-1에서 F3-3-12-1로 변경됩니다.
특히, F0 선충의 번식은 처음 며칠 후에 크게 감소할 것입니다. 따라서, 선충 전달은 D10 이후에 매일 요구되는 것이 엄격히 요구되지 않으며 2일마다 수행될 수 있다. 그러나, 생존은 여전히 매일 관찰을 필요로한다.
F1(T1, T1'), F2(T2, T2') 및 F3(T3, T3')에도 동일한 규칙이 적용됩니다.
11세36 (F0-1-1-11 ~ F0-3-12-11)36 (F0-1-1-9에서 F0-3-12-9로, 카운트 후 클리어)F0-1-1-9에서 F0-3-12-9 한천의 자손 선충은 2d동안 성장했으며, 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-8 ~ F1-3-12-8)36 (F1-1-1-6 ~ F1-3-12-6, 카운트 후 클리어)F1-1-1-6에서 F1-3-12-6 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-5 ~ F2-3-12-5)36 (F0-1-1-10 ~ F0-3-12-10)F0-1-10에서 F0-3-12-10 한천에 F0의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
36 (F3-1-1-2 ~ F3-3-12-2)36 (F1-1-1-7 ~ F1-3-12-7)F1-1-1-7에서 F1-3-12-7 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-4 ~ F2-3-12-4)F2-1-1-4에서 F2-3-12-4 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-1-F3-3-12-1, 카운팅 후 F3-1-1-2에서 F3-3-12-2로 변경)F3-1-1-1에서 F3-3-12-1 한천에 대한 선충은 2 d로 성장했으며 선충은 계산되고 마커는 F3-1-1-2에서 F3-3-12-2로 변경됩니다.
12세36 (F0-1-1-12 ~ F0-3-12-12)36 (F0-1-1-10 ~ F0-3-12-10, 카운트 후 클리어)F0-1-10에서 F0-3-12-10 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-9 ~ F1-3-12-9)36 (F1-1-1-7 ~ F1-3-12-7, 카운트 후 클리어)F1-1-1-7에서 F1-3-12-7 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-6 ~ F2-3-12-6)36 (F2-1-1-4 ~ F2-3-12-4, 카운트 후 클리어)F2-1-1-4에서 F2-3-12-4 한천의 자손 선충은 2d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-3 ~ F3-3-12-3)36 (F0-1-1-11 ~ F0-3-12-11)F0-1-1-11에서 F0-3-12-11 한천에 대한 F0의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
36 (F4-1-1-0 ~ F4-3-12-0)36 (F1-1-1-8 ~ F1-3-12-8)F1-1-1-8에서 F1-3-12-8 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-5 ~ F2-3-12-5)F2-1-1-5에서 F2-3-12-5 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F3-1-1-2에서 F3-3-12-2 한천의 선충은 3d로 성장했으며 마커는 F3-1-1-3에서 F3-3-12-3으로 변경됩니다. F3 선충은 오늘 재현하기 시작하고 그들은 36 새로운 NGM 한천이 필요하고 F4-3-12-0에 F4-1-1-0으로 표시로 전송됩니다. MGR 연구의 경우 F3(즉, T1')의 자손이 오늘 부터 시작됩니다.
13세36 (F0-1-1-13 ~ F0-3-12-13)36 (F0-1-1-11 ~ F0-3-12-11, 카운트 후 클리어)F0-1-1-11에서 F0-3-12-11에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-10 ~ F1-3-12-10)36 (F1-1-1-8 ~ F1-3-12-8, 카운트 후 클리어)F1-1-1-8에서 F1-3-12-8 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-7 ~ F2-3-12-9)36 (F2-1-1-5 ~ F2-3-12-5, 카운트 후 클리어)F2-1-1-5에서 F2-3-12-5 한천의 자손 선충은 2d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-4 ~ F3-3-12-4)36 (F0-1-1-12 ~ F0-3-12-12)F3-1-1-1에서 F3-3-12-1, F2-1-1-4에서 F2-3-12-4 agars 및 F2-1-1-5에서 F2-3-12-5의 전체 선충 번호를 사용하여 F2의 초기 재생을 계산합니다.
36 (F4-1-1-1 ~ F4-3-12-1)36 (F1-1-1-9 ~ F1-3-12-9)F0-1-1-12에서 F0-3-12-12 한천에 F0의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-6 ~ F2-3-12-6)F1-1-1-9에서 F1-3-12-9 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F2-1-1-6에서 F2-3-12-6 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F4-1-1-0에서 F4-3-12-0으로 F3의 자손 선충은 1d로 성장했으며 마커는 F4-1-1-1에서 F4-3-12-1로 변경됩니다.
14세36 (F0-1-1-14 ~ F0-3-12-14)36 (F0-1-1-12 ~ F0-3-12-12, 카운트 후 클리어)F0-1-1-12에서 F0-3-12-12 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-11 ~ F1-3-12-11)36 (F1-1-1-9에서 F1-3-12-9로, 카운트 후 클리어)F1-1-1-9에서 F1-3-12-9 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-8 ~ F2-3-12-8)36 (F2-1-1-6 ~ F2-3-12-6, 카운트 후 클리어)F2-1-1-6에서 F2-3-12-6 한천에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-5 ~ F3-3-12-5)36 (F4-1-1-1에서 F4-3-12-1로, 카운트 후 클리어)F4-1-1-1에서 F4-3-12-1에 F3의 자손 선충은 2 d로 성장하고 선충이 계산 된 후 한천이 제거됩니다. MGR 연구의 경우, T1의 선충은 2d로 성장했으며 다음 날 (D15)에 T2를 재현하기 시작하고 T2는 D18에서 T3를 재현하기 시작합니다. 야생형 C. 예쁜꼬마선충의 수명은 15일로 예시된다. 그런 다음 T3의 수명이 D33에 종료됩니다.
36 (F0-1-1-13 ~ F0-3-12-13)F0-1-1-13에서 F0-3-12-13 한천에 F0의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F1-1-1-10 ~ F1-3-12-10)F1-1-1-10에서 F1-3-12-10 한천에 F1의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
36 (F2-1-1-7 ~ F2-3-12-7)F2-1-1-7에서 F2-3-12-7 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-4 ~ F3-3-12-4)F3-1-1-4에서 F2-3-12-4 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
15세36 (F0-1-1-15 ~ F0-3-12-15)36 (F0-1-1-13 ~ F0-3-12-13, 카운트 후 클리어)F0-1-1-13에서 F0-3-12-13 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-12 ~ F1-3-12-12)36 (F1-1-1-10 ~ F1-3-12-10, 카운트 후 클리어)F1-1-1-10에서 F1-3-12-10 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-9 ~ F2-3-12-9)36 (F2-1-1-7 ~ F2-3-12-7, 카운트 후 클리어)F2-1-1-7에서 F2-3-12-7 한천에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장하고, 한천은 선충을 계산 한 후 삭제됩니다.
36 (F3-1-1-6 ~ F3-3-12-6)36 (F3-1-1-4 ~ F3-3-12-4, 카운트 후 클리어)F3-1-1-4에서 F3-3-1-4에 대한 F3의 자손 선충은 F3-3-12-4 한천이 2d 동안 성장했으며 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F0-1-1-14 ~ F0-3-12-14)F0-1-1-14에서 F0-3-12-14 한천에 대한 F0의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
36 (F1-1-1-11 ~ F1-3-12-11)F1-1-1-11에서 F1-3-12-11 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-8 ~ F2-3-12-8)F2-1-1-8에서 F2-3-12-8 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-5 ~ F3-3-12-5)F3-1-1-5에서 F2-3-12-5 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
16세36 (F0-1-1-15 ~ F0-3-12-15, 오버)36 (F0-1-1-14 ~ F0-3-12-14, 카운트 후 클리어)야생형 C. 예쁜꼬마선충의 수명은 15일로 예시된다. 따라서 F0은 노출 이후 16일째 이전에 모두 사망해야 합니다.
36 (F1-1-1-13 ~ F1-3-12-13)36 (F1-1-1-11 ~ F1-3-12-11, 카운트 후 클리어)F0-1-1-14에서 F0-3-12-14 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-10 ~ F2-3-12-10)36 (F2-1-1-8 ~ F2-3-12-8, 카운트 후 클리어)F1-1-1-11에서 F1-3-12-11에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-7 ~ F3-3-12-7)36 (F3-1-1-5 ~ F3-3-12-5, 카운트 후 클리어)F2-1-1-8에서 F2-3-12-8 한천에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F0-1-1-15 ~ F0-3-12-15)F3-1-1-5에서 F3-3-12-5 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-12 ~ F1-3-12-12)F4-1-1-1에서 F4-3-12-1, F3-1-1-4에서 F3-3-12-4 agars 및 F3-1-1-5에서 F3-3-12-5의 전체 선충 번호를 사용하여 F3의 초기 재생을 계산합니다.
36 (F2-1-1-9 ~ F2-3-12-9)F0-1-1-15에서 F0-3-12-15 한천에 F0의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-6 ~ F3-3-12-6)F1-1-1-12에서 F1-3-12-12 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F2-1-1-9에서 F2-3-12-9 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
F3-1-1-6에서 F2-3-12-6 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
17세36 (F1-1-1-14 ~ F1-3-12-14)36 (F0-1-1-15 ~ F0-3-12-15, 카운트 후 클리어, 오버)F0-1-1-15에서 F0-3-12-15 한천에 대한 F0의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다. 더 이상 F0 자손이 없을 것입니다.
36 (F2-1-1-11 ~ F2-3-12-11)36 (F1-1-1-12 ~ F1-3-12-12, 카운트 후 클리어)F1-1-1-12에서 F1-3-12-12 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-8 ~ F3-3-12-8)36 (F2-1-1-9에서 F2-3-12-9로, 카운트 후 클리어)F2-1-1-9에서 F2-3-12-9 한천의 자손 선충은 2d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-6에서 F3-3-12-6, 카운트 후 클리어)F3-1-1-6에서 F3-3-1-6에 F3의 자손 선충은 F3-3-12-6 한천이 2d 동안 성장했으며 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-13 ~ F1-3-12-13)F1-1-1-13에서 F1-3-12-13 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-10 ~ F2-3-12-10)F2-1-10에서 F2-3-12-10 한천에 F2의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
36 (F3-1-1-7 ~ F3-3-12-7)F3-1-1-7에서 F2-3-12-7 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
18세36 (F1-1-1-15 ~ F1-3-12-15)36 (F1-1-1-13 ~ F1-3-12-13, 카운트 후 클리어)F1-1-1-13에서 F1-3-12-13 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-12 ~ F2-3-12-12)36 (F2-1-1-10 ~ F2-3-12-10, 카운트 후 클리어)F2-1-10에서 F2-3-12-10에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-9 ~ F3-3-12-9)36 (F3-1-1-7 ~ F3-3-12-7, 카운트 후 클리어)F3-1-1-7에서 F3-3-1-7에 F3의 자손 선충은 F3-3-12-7 한천이 2 d 동안 성장했으며 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-14 ~ F1-3-12-14)F1-1-1-14에서 F1-3-12-14 한천에 F1의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
36 (F2-1-1-11 ~ F2-3-12-11)F2-1-1-11에서 F2-3-12-11 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-8 ~ F3-3-12-8)F3-1-1-8에서 F2-3-12-8 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
MGR 연구에서 T2'는 오늘 T3를 재현하기 시작합니다. 야생형 C. 예쁜꼬마선충의 수명은 15일로 예시된다. 그런 다음 T3의 수명이 D33에 종료됩니다.
19세36 (F1-1-1-15 ~ F1-3-12-15, 오버)36 (F1-1-1-14 ~ F1-3-12-14, 카운트 후 클리어)F1-1-1-14에서 F1-3-12-14 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-13 ~ F2-3-12-13)36 (F2-1-1-11 ~ F2-3-12-11, 카운트 후 클리어)F2-1-11에서 F2-3-12-11에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-10 ~ F3-3-12-10)36 (F3-1-1-8 ~ F3-3-12-8, 카운트 후 클리어)F3-1-1-8에서 F3-3-12-8 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F1-1-1-15 ~ F1-3-12-15)F1-1-1-15에서 F1-3-12-15 한천에 F1의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F2-1-1-12 ~ F2-3-12-12)F2-1-1-12에서 F2-3-12-12 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-9 ~ F3-3-12-9)F3-1-1-9에서 F2-3-12-9 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
20개36 (F2-1-1-14 ~ F2-3-12-14)36 (F1-1-1-15 ~ F1-3-12-15, 카운트 후 클리어)F1-1-1-14에서 F1-3-12-14 한천에 대한 F1의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다. 더 이상 F1 자손이 없습니다.
36 (F3-1-1-11 ~ F3-3-12-11)36 (F2-1-1-12 ~ F2-3-12-12, 카운트 후 클리어)F2-1-1-12에서 F2-3-12-12 에 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-9에서 F3-3-12-9로, 카운트 후 클리어)F3-1-1-9에서 F3-3-12-9 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-13 ~ F2-3-12-13)F2-1-1-13에서 F2-3-12-13 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-10 ~ F3-3-12-10)F3-1-10에서 F2-3-12-10 한천에 F3의 자손 선충은 1 d동안 성장했습니다.
21세36 (F2-1-1-15 ~ F2-3-12-15)36 (F2-1-1-13 ~ F2-3-12-13, 카운트 후 클리어)F2-1-1-13에서 F2-3-12-13 한천의 자손 선충은 2d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-12 ~ F3-3-12-12)36 (F3-1-1-10 ~ F3-3-12-10, 카운트 후 클리어)F3-1-10에서 F3-3-1-10에 있는 F3의 자손 선충은 F3-3-12-10 한천으로 2d 동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F2-1-1-14 ~ F2-3-12-14)F2-1-1-14에서 F2-3-12-14 한천에 F2의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
36 (F3-1-1-11 ~ F3-3-12-11)F3-1-11에서 F2-3-12-11 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
22세36 (F2-1-1-15 ~ F2-3-12-15, 오버)36 (F2-1-1-14 ~ F2-3-12-14, 카운트 후 클리어)F2-1-14에서 F2-3-12-14 한천에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-13 ~ F3-3-12-13)36 (F3-1-1-11 ~ F3-3-12-11, 카운트 후 클리어)F3-1-1-11에서 F3-3-12-11에 대한 F3의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-12 ~ F3-3-12-12)F3-1-1-12에서 F2-3-12-12 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
23세36 (F3-1-1-14 ~ F3-3-12-14)36 (F2-1-1-15 ~ F2-3-12-15, 카운트 후 클리어)F2-1-1-15에서 F2-3-12-15 한천에 대한 F2의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다. 더 이상 F2 자손이 없을 것입니다.
36 (F3-1-1-12 ~ F3-3-12-12, 카운트 후 클리어)F3-1-1-12에서 F3-3-12-12에 대한 F3의 자손 선충은 2 d동안 성장했으며, 선충이 계산된 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-13 ~ F3-3-12-13)F3-1-1-13에서 F2-3-12-13 한천에 대한 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
24세36 (F3-1-1-15 ~ F3-3-12-15)36 (F3-1-1-13 ~ F3-3-12-13, 카운트 후 클리어)F3-1-1-13에서 F3-3-12-13 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-14 ~ F3-3-12-14)F3-1-1-14에서 F2-3-12-14 한천에 대한 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
25개36 (F3-1-1-15 ~ F3-3-12-15, 오버)36 (F3-1-1-14 ~ F3-3-12-14, 카운트 후 클리어)F3-1-1-14에서 F3-3-12-14 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
36 (F3-1-1-15 ~ F3-3-12-15)F3-1-1-15에서 F2-3-12-15 한천에 F3의 자손 선충은 1 d에 대한 성장했다.
26세36 (F3-1-1-15 ~ F3-3-12-15, 카운트 후 클리어)F3-1-1-15에서 F3-3-12-15 한천의 자손 선충은 2d 동안 성장했으며 선충을 계산한 후 한천이 제거됩니다.
특히, MGR 연구에서, F3의 첫 번째 비 노출 자손 (즉, T3') D18에 태어날 것 이다. 야생형 C. 예쁜꼬마선충의 수명은 15일로 예시된다. 그런 다음 T3의 수명이 D33에 종료됩니다.
MGE와 MGR 연구 모두 선충 수명이 길어지면 더 많은 날을 다룰 것입니다.

표 1: 마커 및 해당 정의 목록입니다.

  1. MGE 효과 연구에서 재생 및 수명을 측정합니다.
    1. D0에서 5.6 단계를 반복합니다. 한천(각각 10개의 복제를 가진 3군)을Fx-b-c로 표시하여 x가 생성 수를 지칭하는 경우, 그룹 번호(대조군의 경우 1, 낮은 농도의 경우 2, 고농도의 경우 3개)를 의미한다. ); b는 1에서 10까지의 복제를 말합니다. c는 노출 기간을 나타냅니다(0은 시작을 나타냅니다). D0의 경우 한천을 F0-1-1-0에서 F0-3-10-0으로 표시합니다. 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
    2. D1에서, 한천에 선충 성장을 확인하고, F0-1-1-0에서 F0-3-10-0F0-1-1F0-3-1-1에 마커를 변경F0-3-10-1.
    3. D2에서 한천의 선충 성장을 확인하고 마커 F0-1-1-2를 F0-3-10-2로 변경합니다.
    4. D3에서, 단계 5.4에서 2 NGM 한천과 함께 12 개의 새로운 NGM 한천에 각 그룹에서 24 F0 선충을 선택하십시오. 한천을 F0-1-1-3으로 표시하여 F0-3-12-3으로 표시합니다.
    5. D4에서는 5.4단계에서 새로운 NGM 한천을 따서 두 부모 선충을 F0-1-1-3에서 F0-3-12-3으로 옮김을 전송합니다. F0-1-1-4에 F0-1-1-4로 새로운 NGM 한천을 표시합니다. F0-1-1-3의 마커를 F0-3-12-3에서 F1-1-1에서 F1-3-12-1로 변경하여 F0(즉, F1)의 자손을 F0(즉, F1)의 자손을 재현하기 시작한 후 첫날에 나타냅니다.
    6. D5에서는 해부 현미경을 사용하여 선충이 2 일 성장한 F1-1-1-1aa에 선충을 계산합니다. F1-1-1-1을 F1-3-12-1 한천으로 허용하여 연속적인 세대를 위해 F2를 재현하십시오.
    7. 5.4단계에서 새로운 NGM 한천을 따서 두 모선선들을 F0-1-1-4에서 F0-3-12-4 한천으로 옮김을 옮김. F0-1-1-5로 NGM 한천을 F0-3-12-5로 표시합니다. F0-1-1-4의 마크를 F0-3-12-4에서 F1-1-1-2에서 F1-3-12-2로 변경하여 F0의 자손을 나타내려면 F0(즉, F1)의 자손을 F0이 재현하기 시작한 후 이틀 이내에 나타냅니다.
    8. D6에서는 F1-1-1-2의 선충을 F1-3-12-2 한천으로 계산합니다. 부모 선충을 F0-1-1-5에서 F0-3-12-5 한천으로 F0-1-1-6에서 F0-3-12-6으로 옮김. F0-1-1-5의 마커를 F0-3-12-5에서 F1-1-1-3으로 변경하여 F0(즉, F1)의 자손을 F0(즉, F1)의 자손을 재현하기 시작한 후 3일 이내에 나타냅니다.
    9. F1-1-1-1에서 F1-3-12-1 한천의 선충은 3일 동안 성장했습니다. MGE 효과 연구를 성공으로 F2를 재현하는 데 사용합니다. 같은 방법으로, F2 선충을 사용하여 F3를 재현하여 MGE 효과 연구를 계속합니다.
    10. 같은 방법을 통해, 매일 두 부모 선충을 전송하고 다음 날 자손 선충을 계산, 6 NGM 한천에서 부모 선충까지 (즉, 각 그룹의 총 한천의 절반) 재생을 중지합니다.
    11. 전체 재생 기간 동안 총 자손 수를 총 무리 크기로 계산합니다. 처음 3일 이내에 자손 번호를 사용하여 부모의 초기 복제를 나타냅니다.
    12. 부모 선충 재생이 6 NGM 한천에서 중단되는 날을 사용하여 번식 기간을 추정하십시오. 각 부모가 살아남은 날을 수명으로 사용하십시오.
    13. F0에 대해 수행한 것과 동일한 방법으로 초기 재생, 재생 기간, 총 무리 크기 및 수명을 얻을 수 있습니다. 유사하게, 전술한 절차를 반복함으로써, F2(fn)의 재생 및 수명 정보를 얻을 수 있다.
  2. MGR 효과 연구에서 재생 및 수명을 측정합니다.
    1. 단계 7.2.4단계 5.4에서 NGM 한천을 2.13단계에서 로 변경하여 수행한다.
  3. 생화학 적 지수를 측정합니다.
    1. NGM 한천에서 선충을 멸균수로 씻어 내고 원심 분리관으로 수집합니다. 선충을 30 분 동안 정착시키고 상황제를 버리십시오. 효과 측정을 위해 펠릿에 선충을 사용하십시오.
    2. 선충을 세척하기 위해 1.5 mL 원심 분리튜브에서 선충(pellets)에 얼음-차가운 인산완충식염수(PBS, pH 7.0)를 1 mL를 첨가한다.
    3. 4 °C에서 5 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리기를 조심스럽게 피펫으로 초자연자를 버립니다.
    4. 액체 질소 또는 -80 °C 냉동고에서 펠릿을 동결합니다.
    5. 얼음 욕조에서 유봉을 사용하여 펠릿을 균질화하십시오. 200 μL 얼음 차가운 PBS를 사용하여 유봉을 꺼내기 전에 유봉의 잔류 액체를 원심 분리관으로 세척하십시오.
    6. 10,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 다시 사용하고, 상용 키트를 사용하여 생화학 물질의 활동 또는 양을 결정하기 위해 상급물질을 사용한다(자세한 내용은 재료 표 참조).
    7. 샘플에서 총 단백질(TP)의 양을 측정하고, 그 결과를 다른 생화학적 지표를 나타내는 분모로 사용하여, 시료 들 간의 선충 수 간의 차이를 제거할 수 있도록 한다.
  4. 유전자 발현을 측정합니다.
    1. 7.4.1에서 7.4.4단계반복합니다. 제조자의 지침21에따라 상업용 RNA 추출 키트를 사용하여 선충 샘플로부터 총 RNA를 분리합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
    2. RNA를 사용하여 제조업체의 지침21에따라 cDNA를 합성합니다.
    3. 제조사의 지시에 따라 SYBR 그린 RT-PCR 키트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에서 cDNA 샘플을 분석한다(재료표 참조)21.
    4. 2-ΔΔCT 방법22에의해 선택된 유전자의 상대발현 수준을 정량화하고, GDP-2(또는 다른 기준 유전자)의 발현 수준을 음성 참조로 취급한다.

결과

여기서는 트랜스 제너레이션(TG), 다세대 노출(MGE) 및 다세대 잔류(MGR) 효과 연구에서 C. elegans를 사용하여 세대에 걸쳐 화학 물질의 효과를 연구하는 프로토콜을 설명합니다. 우리 자신의 연구 결과는 예로 제시된다. 한 연구는 운동 행동에 중금속의 TG 효과를 제시3. 다른 두 연구는 재생 및 생화학 및 유전 지수 측정에 설포메톡사졸과 린딘의 MGE 및 ...

토론

설명된 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 다음 제안을 고려해야 합니다. 멸균 환경에서 전체 실험 작업을 수행합니다. 부적절한 작동은 대장균 균주의 오염을 초래할 수 있습니다, 예를 들어, 곰팡이와 계귀는 C. 예쁜 꼬마의 정상적인 성장을 방해하고 따라서 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. C. 예쁜꼬마선충을 기르는 것을 설명하는 섹션에서는 육안이나 현미경으로 NG...

공개

저자는 국가 과학 기술 주요 수질 오염 제어 및 처리 프로젝트 (2017ZX07201004) 및 중국의 국제 과학 기술 협력 프로그램 (No. 2016YFE0123700)의 재정 지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
 agar powderOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 
96-well sterile microplateCostar?Corning?America
Autoclave sterilizerTomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinetLongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China10043-52-4
centrifuge  5417REppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubesAxygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterolSinopharm chemical reagent company Ltd, China57-88-5
Dimethyl sulfoxideVETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America67-68-5
disodium hydrogen phosphateSinopharm chemical reagent company Ltd, China7558-79-4
ethanolSinopharm chemical reagent company Ltd, China64-17-5
FilterThermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubatorYiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, China16788-57-1
kraft paper
Mcroplate ReaderBoitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, China10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TDBM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
PipetteEppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China7447-40-7
potassium dihydrogen phosphateSinopharm chemical reagent company Ltd, China7778-77-0
Qiagen RNeasy kitsQiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kitsQiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chlorideSinopharm chemical reagent company Ltd, China7647-14-5
sodium hydroxideSinopharm chemical reagent company Ltd, China1310-73-2
sodium hypochlorite solutionAladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China7681-52-9
tryptoneOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK73049-73-7
yeast extractOXOID, Thermo Fisher Scientific, UK119-44-8

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