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요약

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

초록

정자 생성은 포유류에서 남성 생식 세포 분화의 고도로 주문 된 과정을 정의 합니다. 고환에서, 전사 및 번역은 결합 되지 않습니다, RBPs에 의해 조율 된 유전자 발현의 포스트 전사 조절의 중요성을 밑줄. RBP의 기계적 역할을 명료 하 게 하기 위해, 가교 면역 침전 (CLIP) 방법론은 내 인 성 직접 RNA 표적을 포착 하 고 실제 상호작용 부위를 정의 하는데 사용 될 수 있다. 향상 된 클립 (eCLIP)은 기존 클립에 비해 여러 가지 장점을 제공 하는 새롭게 개발 된 방법입니다. 그러나, eCLIP의 사용은 지금까지 확장 된 응용 프로그램에 대 한 호출, 셀 라인에 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 고환에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아 제를 연구 하기 위해 eCLIP을 사용 했습니다. MOV10 및 MOV10L1 예상한 바와 같이, 우리는 MOV10 우세 하 게 mRNA의 3 ' 미 번역 지역 (UTRs)에 결합 하 고 MOV10L1 선택적으로 Piwi 상호 작용 RNA (피 르 나) 전 구체 전사체에 묶는 것을 발견 합니다. 우리의 eCLIP 방법은 깊은 시퀀싱을 진행 하기 위한 영장으로 서브 클론의 소규모 시퀀싱 및 자격을 갖춘 라이브러리의 가용성을 통해 다양 한 RBPs에 의해 바인딩된 주요 RNA 종의 빠른 결정을 할 수 있습니다. 본 연구는 포유류 고환에서의 eCLIP에 대 한 적용 가능한 기초를 확립 한다.

서문

포유류 고환은 다 수의 정자를 생산 하기 위해 복잡 한 세포 분화 프로그램이 순환적으로 실행 되는 우수한 발달 모델을 나타낸다. 이 모델의 독특한 가치는 정자의 특정 단계에서 전사 불 활성화의 출현에 놓여 있으며, 일반적으로 meiotic 성 염색체 불 활성화 (MSCI)가 발생 하면1,2 및 둥근 spermatogenesis가 발생할 때 세정 동안 급격 한 핵 압축. 이 연속적인 전사 이벤트는 RNA 결합 단백질 (RBPs)이 전사체를 형성 하 고 남성의 비 옥을 유지 하는 중요 한 역할을 하는 전사 후 유전자 조절을 필요로 합니다.

생체 내에서 개별 rbp의 선의의 rna 표적을 규명 하기 위해, 상기 가교 면역 침전 (CLIP) 법은 통상의 rna 면역 침전 (RIP)을 넘어서는것을 기준으로4,5를 개발 하였으며,7 , 자외선 (UV) 가교 결합, 엄격한 세척 및 겔 전달을 포함 하는 주요 단계의 혼 입에 의해 신호 특이성을 향상 시킨다. 고 처리량 시퀀싱과 결합 된 클립의 진보 된 응용은 게놈 전체 수준8에서 단백질 RNA 상호작용을 프로 파일링 하는 것에 큰 관심을 불러 일으킨 것입니다. RBP 기능에 대 한 유전 연구 외에, 내 인 성 단백질과 RNA의 직접적인 상호 작용을 식별 하는 이러한 생화학 적 방법은 Rbp의 RNA 규제 역할을 정확 하 게 해명 하는 데 필수적입니다. 예를 들어, MOV10L1는 남성의 비 옥 및 Piwi 상호작용 RNA (피 르 나) 생물 발생9에 필요한 고환 특이 rna 헬 리 아 제 이다. 그것의 paralogue MOV10는 rna 생물학의 다 양상에서 역할을 가진 ubiquitously 표현 되 고 다기능 rna 헬 리 아 제로 알려져 있습니다10,11,12,13 , 15 , 16 , 17 , 18. 종래의 클립-서 열을 채용 함으로써, 우리는 MOV10L1이 초기 피 르 나 전 구체를 결합 하 고 조절 하는 것을 발견19,20, 그리고 MOV10 mRNA 3 ' utrs 뿐만 아니라 비 코딩 RNA를 개시 하기 위하여 고환 배아 세포의 종 (데이터가 표시 되지 않음).

그럼에도 불구 하 고, 클립은 원래 힘든, 클립 태그의 현저한 손실로 시퀀싱 라이브러리 준비 뒤에 방사성 절차. 종래의 클립에 있어서, cDNA 라이브러리는 양쪽 RNA 말단에서 결 찰 어댑터를 사용 하 여 제조 된다. 단백질 소화 후, 가교 된 짧은 폴 리 펩타이드는 RNA 단편에 부착 된 상태로 유지 됩니다. 이 가교 마크는 cdna 합성 동안 부분적으로 역방향 역전사 (rtase) 진행을 차단 하 여, cdna 라이브러리21,22의 약 80%를 나타내는 잘린 cdnas를 생성 한다. 따라서, 가교 결합 부위 (read)를 우회 하는 RTase에서 기인 하는 cDNA 단편만이 시퀀싱 된다. 최근에는 파 클립, iCLIP, eCLIP 및 uvCLAP와 같은 다양 한 클립 접근법이 살아있는 세포에서 RBPs의 크로스 링크 사이트를 식별 하는 데 사용 되었습니다. PAR 클립은 365 nm UV 방사선 및 광 활성화 가능한 뉴클레오티드 유사 체의 적용을 포함 하 고, 따라서 배양 살아있는 세포에 배타적 이며, 새로 합성 된 전사체에 뉴 클레 오 유사 체의 혼 입은 편견을 일으키기 쉽다 RNA가 물리적으로 단백질23,24와 상호 작용 하는 곳. ICLIP에서 단일 어댑터만이 가교 된 RNA 단편의 3 ' 말단에 결 찰 됩니다. 역 전사 (RT) 후에, 잘린 및 읽기-스루 cdnas는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭25,26에의 한 인트라 내 순환 화 및 재 선형화에 의해 얻어진 다. 그러나, 분 자체 순환의 효율은 상대적으로 낮다. 구형 클립 프로토콜은 방사성 동위 원소, 자외선 가교 결합 및 친화성 정제 (uvCLAP)와 함께 가교 된 RNA의 라벨링이 필요 하지만, 엄격한 탠덤 친화성 정제 과정을 통해 방사능27에 의존 하지 않는다. 그럼에도 불구 하 고, uvCLAP는 탠덤 친화성 정제를 위해 3x FLAG-HBH 태그를 운반 하는 발현 벡터로 형질 감염 되어야 하는 배양 세포로 제한 된다.

ECLIP에서, 어댑터는 RT의 3 인치 말단에서 먼저, 그리고 분자 간 모드에서 cDNAs의 3 가지 말단에서 다음으로 결 찰 되었습니다. 따라서, eCLIP은 모든 절단 및 판독을 통해 cDNA (28)를 캡처할 수 있다. 또한, 단일 뉴클레오티드 분해능을 유지 하면서도, 방사성 라벨링에 국한 되지 않고, 그 원리에 기초한 세포 주를 사용 하지 않는다.

여기서는 마우스 고환에 적합 한 eCLIP 프로토콜에 대 한 단계별 설명을 제공 합니다. 간단히 말해서,이 eCLIP 프로토콜은 고환 세관의 UV 가교 결합으로 시작 하 여 단백질 특이 적 항 체를 사용 하는 부분적인 RNase 소화 및 면역 침전이 이어집니다. 다음으로, 단백질 결합 RNA는 dephosphorylated이 고, 어댑터는 3 ' 말단으로 결 찰 된다. 단백질 겔 전기 영동 및 겔-막 전달 후, RNA는 예상 된 크기 범위의 멤브레인 영역을 절단 하 여 분리 된다. RT 후, DNA 어댑터는 PCR 증폭에 이어서 cDNA의 3 ' 말단에 결 찰 된다. 높은 처리량 시퀀싱 전에 서브 클론의 스크리닝은 라이브러리 품질 관리로 취합니다. 이 프로토콜은 두 개의 고환 발현 RNA 헬 리 아 제 MOV10L1 및 MOV10에 의해 예시 되는 RBPs의 단백질 결합 RNA의 주요 종을 식별 하는 데 효율적입니다.

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프로토콜

모든 수행 동물 실험은 난징 의료 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다. 수 컷 C57BL/6 마리의 마우스는 조절 된 광 기간 조건 하에서 유지 되었고, 음식과 물과 함께 공급 되었다.

1. 조직 수확 및 UV 가교 결합

  1. 성인 마우스 2 개를 1-2 분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 이산화탄소를 이용 하 여 안락사 시켰다. 다음, 각 마우스에 자 궁 경부 탈 구를 수행.
  2. 각각의 면역 침전 실험에 대 한 적절 한 연령 (본 연구에서 1 성인 고환)의 생쥐 로부터 고환의 약 100 mg을 수확 하 고,이 조직을 빙 냉 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 배치 한다.
  3. 섬세 한 팁을 가진 핀셋을 사용 하 여 튜 니 카 알 부 니 아를 부드럽게 제거 하세요.
  4. 티슈 분쇄기에 3 mL의 얼음 차가운 PBS를 첨가 하 고 느슨한 유리 유 봉 (유리 유 봉)을 사용 하 여 온화한 기계적 힘으로 조직을 삼 출 합니다.
    참고: 이 단계의 목적은 세포를 lyse 하는 것이 아니라 조직을 분리 하는 것입니다. 세포 생존 력과 완전성의 보전이 중요 합니다.
  5. 조직 현 탁 액을 세포 배양 접시에 옮겨 넣고 (지름 10cm), 최대 6ml의 얼음 차가운 PBS를 추가 합니다.
  6. 접시를 빨리 흔들어 액체가 접시 바닥을 고르게 덮으 십시오. 조직이 제대로 지상에 있는 경우에, 균등 하 게 분산 된 수 관 세관은 보일 것입니다, 반면 조직 덩어리의 존재는 조직 분산이 최적이 아님을 나타냅니다.
  7. Ice에서 254 nm에서 400 mJ/cm2 로 현 탁 액을 세 번 교차 연결 합니다. 각 조사 사이에 서 스 펜 션을 섞는다.
    참고: 각각의 새로운 실험에 대해 가교를 최적화 해야 합니다.
  8. 4 ° c에서 5 분 동안 1200 x g 에서 15 mL 원뿔형 튜브 및 펠 릿에서 현 탁 액을 수집 한다. 상층 액을 제거 하 고, 펠 렛을 PBS 1 mL에 소생 시킨 다음, 현 탁 액을 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 4°c 및 1000 x g 에서 2 분간 스핀 하 고 상층 액을 제거 한다.
  9. 이 시점에서, 즉시 프로토콜의 나머지 부분을 진행 하거나, 액체 질소로 펠 렛을 스냅 동결 하 고, 사용 될 때까지-80 ° c에서 저장 한다.

2. 구슬 준비

  1. 125 µ L의 단백질을 시료 당 자기 비드 (펠 렛)에 넣고 신선한 원심 분리기 튜브에 추가 합니다.
    참고: 마우스 항 체를 위한 단백질 G 마그네틱 비드를 사용 합니다.
  2. 용액에서 비드를 분리 하기 위해 자석에 튜브를 놓습니다. 10 초 후 상층 액을 제거 합니다. 구슬 2 개를 얼음-차가운 용 해 완충 액 1Ml 씩 두 번 씻으십시오.
    참고: 후속 단백질의 분리 자성 비드는이 단계를 따른다. 용 해 완충 제 조성 물은 50 mM 트리-HCl, pH 7.5; 100 mM 염화 나트륨; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% 나트륨 deoxycholate; 1/50 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)-프리 프로 테아 제 억제제 칵테일 (신선 하 게 추가).
  3. 10 µ g eCLIP 항 체를 가진 차가운 용 해 완충 액의 100 µ L에 있는 구슬의 소생. 45 분 동안 실 온에서 튜브를 돌립니다.
    참고: 면역 침전에 대 한 최종 항 체 농도는 10 µ 이다. 항 체 농도가 알려지지 않은 경우, 항 체의 양은 최적화 되어야 한다.
  4. 구슬 2 개를 얼음-차가운 용 해 완충 액 1Ml 씩 두 번 씻으십시오.

3. 조직 용 해 및 부분적인 RNA 소화

  1. 차가운 용 해 완충 액 1Ml의 소생 조직 펠 렛 (EDTA) 무 첨가 단백질 억제제 칵테일과 µ의 RNase 억제제의 11 µ L을 용 해 완충 액 1 mL에 추가 한다.
    1. 실험 군 당 2 개의 자외선 가교 펠 렛과 2 개의 비 가교 된 펠 렛을 소생: UV-가교 된 eCLIP 라이브러리 용 펠 렛 (UV-1); UV 가교-eCLIP 라이브러리에 대 한 2 개의 펠 릿 (UV-2); 대조 군으로 서 eCLIP 라이브러리를 위한 비 가교-1 펠 렛 (비 UV); IgG IP에 대 한 비 가교-2 개의 펠 렛은 항 체의 특이성을 입증 한다.
      참고: UV 가교 된 넓은 유형의 고환의 eCLIP 라이브러리에 대 한 이상적인 제어는 동일한 쓰레기의 쥐에서 UV 가교 된 녹아웃 고환의 것입니다.
  2. 단백질 및 RNA의 분해를 방지 하기 위해 15 분 동안 얼음에 샘플을 보관 하십시오.
  3. 디지털 초음파 발생기에서 10%의 진폭에서 30 초/30 초 off로 5 분 동안 초음파 처리 합니다. 샘플을 항상 얼음 위에 놓고 각 시료 사이에 뉴 클레 아 제가 없는 물로 프로브를 청소 하십시오.
  4. 각 튜브에 DNase의 4 µ L을 추가 하 고 잘 섞는다. 37 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  5. 희석 된 RNase I (PBS에 4U/µ L RNase I)의 10 µ L을 추가 하 고 잘 섞는다. 37 ° c에서 5 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  6. 15000 x g 에서 4 ° c에서 20 분간 원심 분리 하 여 파쇄 물을 지웁니다.
  7. 상 등 액을 조심 스럽게 모으십시오. 50 µ L의 용 해물을 남겨 두고 펠 렛을 버리십시오.
  8. 입력 샘플을 Rwb (웨스턴 블랏을 위해 실행) 및 RWB (RNA 격리를 위해 실행)로 저장 합니다. 저장 20 µ (2%) uv-1, uv 2, 비 UV 및 IgG 샘플의 RWB 겔 로딩에 대 한 입력으로. 저장 20 µ (2%) RRI 겔 로딩을 위한 입력으로 서의 UV-1 또는 UV-2 샘플.

4. 면역 침전

  1. 상기 파쇄 물 (3.7 단계부터)을 비드에 1 mL 첨가 하 여 2 시간 또는 하룻밤 동안 4°c에서 샘플을 회전 시켰다.
  2. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 900 µ l의 고 염 완충 액 (50 mM 트리 스-HCl을 사용 하 여 구슬 두 번 세척 ph 7.5; 1%의 염화 나트륨; 1% NP-40; 0.1% deoxycholate 나트륨)을 사용 하 여 구슬 2 개를 세척 완충 액의 µ l로 세척 하 고 0.5, 10mmmgcl 2; 900% 트윈-20).
    참고: IgG 샘플의 경우 여기에서 절차를 일시 중지 하 고 얼음 위에 세척 완충 액에 보관 하십시오.
  3. 500 µ L의 1 배의 탈 인 산화 완충 액 (10mm 트리 스-HCl, pH 7.5, 5Mmmgcl2; 100 mm KCl; 0.02% 트리톤 X-100).

5. RNA 3 ' 말단의 탈 인 산화

  1. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 미세한 파이 펫 팁을 사용 하 여 잔류 액체를 제거 합니다. 추가 100 µ L의 탈 인 산화 마스터 믹스 (10 µ L의 탈 인 산화 완충 액 [100 mM 트리 스-HCl, pH 8.0; 50. 1 mg의 보 소 혈 청 알 부 민; 1 밀리 그램/m l. 뉴 클레 아 제 무 첨가 물; µ의 µ l의 rnase ase 억제제; 2 µ 78의 l 0.2 칼 린 인산 가수분해 효소)를 각각의 샘플에, 37 ° c에서 15 분 동안 배양 하 고, 1200 rpm에서 흔들어 준다.
  2. 추가 300 µ L 폴 리 뉴클레오티드 키나 제 (PNK) 마스터 믹스 (60 µ L의 PNK pH 6.5 완충 액 [350 mM 트리 스-HCl, pH 6.5; 50);; 223 µ l의 뉴 클레 아 제 불포함 물; 5 µ l rnase 억제제; pnk 효소의 7 µ l; 각 시료에 대해 3 µ l의 0.1 M 디 티 오 스 톨) 1200 rpm에서 37 ° c에서 20 분 동안 배양 합니다.
  3. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 500 µ L의 차가운 워시 버퍼를 사용 하 여 구슬을 한 번 씻으십시오. 그런 다음 차가운 고 염 완충 액의 500 µ L로 한 번 구슬을 씻으십시오. 이 순서 대로 한 번 더이 세척을 반복 합니다.
  4. 차가운 세척 완충 액의 500 µ l을 한 번 세척 하 고, 300 µ의 차가운 1 배 결 찰 7.5 50 완충 액으로 2 번 씻는 다. 10 mm mgcl 2).

6. rna 어댑터는 RNA 3 ' 끝에 결 찰

  1. 상층 액을 버리고 미세한 파이 펫 팁으로 잔류 액체를 제거 하십시오. 각 샘플에 3 ' 결 찰 마스터 믹스 25 µ L을 추가 합니다. 파이 펫 팅으로 조심 스럽게 섞으 세요. 이 단계는 기포를 생성 하는 경향이 있다.
    참고: 결 찰 마스터 믹스는 10 배 결 찰 완충 액의 3 µ L를 포함 합니다 [500 mM 트리 스-HCl, pH 7.5; 100 mM MgCl2]; 9 µ L 뉴 클레 아 제 무-물; RNase 억제제의 0.4 µ L; 0.3 µ L 0.1 M ATP; 디 메 틸 설 폭 사이드의 0.8 µ L; 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 8000의 9 µ L; 2.5 µ l의 RNA 리가 제 [30u/µ l].
  2. 추가 2.5 µ L의 RNA 어댑터 X1A (표 1) 및 2.5 µ l의 RNA 어댑터 X1B (표 1) 각 샘플에. 피 펫 팅 또는 25 ° c에서 75 분 동안 배양 하 여 신중 하 게 혼합 하 고 10 분 마다 섞어 쓸으 십시오.
  3. 500 µ L의 콜드 워시 완충 액으로 한 번 비드를 씻으 세요 (여기에서 IgG 샘플을 재개 하십시오).
  4. 500 µ L의 차가운 고 염 완충 액으로 한 번 비드를 씻고 500 µ L 콜드 워시 버퍼를 사용 하십시오. 이 세척을 한 번 더 반복 하십시오.
  5. 비드를 자기적으로 분리 하 고 미세한 파이 펫 팁으로 잔류 액체를 제거 합니다.
  6. 콜드 워시 완충 액의 100 µ L에 구슬을 소생 (여기에 IgG 샘플을 일시 중지 하 고 세척 버퍼에 얼음에 저장). RWB 샘플로 20 µ L을 새 튜브로 옮깁니다. 나머지 80 µ L을 RRI 샘플로 자기적으로 분리 합니다. RRI 샘플의 상층 액을 제거 하 고 세척 완충 액의 20 µ L에서 비드를 소생 시킵니다.
  7. 37.5 µ L의 4 배 리튬도 데 실 황산 염 (LDS) 샘플 완충 액 및 15 µ L의 10 배 시료 감소 제를 IgG 시료에 추가 합니다. 7.5 µ L의 LDS 샘플 버퍼 4 개를 추가 하 고 (나머지) 샘플에 3 µ L의 10 배 샘플을 줄입니다. (파이 펫 팅으로 혼합 하지 마십시오). 70 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다. 얼음을 1 분간 식힌 후 4°c에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리 합니다.

7. SDS 페이지 및 멤브레인 전송

  1. 젤을 로드 합니다.
    1. RRI 젤 (4-12% 비스 트리 스 프로 틴 젤, 10 웰, 1.5 mm) 용 출 액에서 튜브를 자석에 놓고 분리 된 단백질을 구슬에서 넣습니다. 웰 당 샘플 30 µ L을 로드 합니다. 샘플은 미리 염색 된 단백질 크기 마커로 이격 되어 있습니다.
    2. RWB 젤 (4-12% Bis-트리 스 프로 틴 젤, 10well 1.5 mm)에 튜브를 자석에 놓고 분리 된 단백질을 구슬에서 용 출 액. 웰 당 샘플 15 µ L을 로드 합니다. 나머지 샘플을-20°c에서 백업으로 저장 합니다.
  2. 500 µ L의 항 산화 제를 500 mL의 1x SDS 실행 버퍼에 추가 하십시오. 50 분 동안 또는 염료 전면이 하단에 있을 때까지 1x SDS 실행 버퍼에서 200 V에서 실행 하십시오.
    참고: 산화 방지 제에는 N, Dimethylformamide, 아 황산 수소 나트륨이 포함 되어 있으며,이는 감소 된 단백질로 마이그레이션하여 메티오닌 및 트립토판과 같은 민감한 아미노산의 재 산화를 예방 합니다.
  3. 겔에서 니트로 멤브레인으로 10% 메탄올에서 70 분의 단백질 RNA 복합체를 10v/min의 1xtransfer 버퍼로 전달 합니다. RRI 멤브레인을 차가운 PBS에 헹 구 고 플라스틱 랩으로 싸서-80 ° c로 보관 하십시오.
  4. RWB 멤브레인을 1 시간 동안 실 온에서 TBST의 5% 우유로 차단 하십시오. TBST에서 멤브레인을 헹 구 십시오. 4 ° c 하룻밤 동안 TBST에서 일차 항 체와 함께 배양 합니다. Tbst로 5 분간 2 회 세척 하 고, 상 온에서 1 시간 동안 2 차 항 체 (1:5000 HRP 염소 반 토끼 IgG)를 사용 하 여 5 분간 TBST로 3 회 세척 합니다.
  5. 동일한 부피의 전기 발광 (ECL) 버퍼 A와 버퍼 B를 혼합 하 여 멤브레인에 추가 하 고 1 분간 배양 합니다. 플라스틱 랩으로 멤브레인을 덮고 2-3 분 동안 실 온에서 X 선 필름에 노출 시킵니다. 그런 다음 필름을 개발 합니다.
    참고: 과다 노출을 가진 필름은 막이 RWB 막에 다시 정렬 될 수 있는 멤브레인의 가장자리의 모양을 명확 하 게 보여줍니다. 그런 다음 내부 마커의 위치를 기준으로 RWB 및 RWB 멤브레인을 정렬 합니다. 바닥에서 상부로 순차적으로 층은 필름, RWB 멤브레인 및 RWB 멤브레인을 순차적으로 계층화 한다.

8. RNA 분리

  1. 단백질 밴드에서 75 kDa (RNA의 약 220 nt)의 영역을 가이드로 서 RWB 멤브레인과 필름을 사용 하 여 절단 한다.
    참고: 단백질 보호 RNA 분자는 225 염기의 최대 길이를 가질 수 있는 것으로 서, 염기 당 약 340 Da와 함께, 모든 단백질 RNA 복합체를 회수 하기 위해 RBP 밴드 이상의 75 kDa에 대 한 영역을 절단 하는 것이 합리적 이다.
  2. 멤브레인을 적 출하 여 몇 개의 작은 조각으로 자른 후 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 추가 200 µ l의 프로 테이 나 제 K (pk) 완충 액 (100 mm 트리 스-HCl pH 7.5, 50 mm 염화 나트륨 10mmedta 40)을 첨가 하 여 멤브레인 조각에 µ. 37 ° c에서 20 분 동안 혼합 하 고 배양 하 여 1200 rpm에서 흔들어 줍니다.
  3. 각 시료에 200 µ l의 PK 우 50 7.4 레 아 완충 액 (100 mm)을 추가 합니다. 37 ° c에서 20 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  4. 400 µ L의 페 놀/클로로 포 름/isoamyl 알콜 (25:24:1)을 첨가 하 고 37 ° c에서 5 분 동안 잘 섞어 1200 rpm에서 흔들어 줍니다.
  5. 원심 분리기에 2 mL 상 락 젤 (PLG)을 넣고 25 초 동안 15000 x g 에서 회전 시킵니다.
  6. 멤브레인 슬라이스를 제외한 모든 내용물을 PLG 무거운 튜브로 전송 합니다. 37 ° c에서 5 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  7. 실 온에서 스핀을 하 고 15 분 동안 15000 x g 의 새 15 mL 원추형 튜브로 수성 층을 전달 합니다.
  8. Rna 정제 및 농축 컬럼을 사용 하 여 RNA를 추출 합니다.
    1. 각 샘플 (8.7 단계에서)에 RNA 결합 버퍼의 2 개의 볼륨 (800 µ L)을 추가 하 고 섞는다. 100% 에탄올과 혼합의 동등한 부피 (1200 µ L)를 추가 합니다.
    2. 750 µ L 샘플 (단계 8.8.1에서)을 수집 튜브에 있는 RNA 정제 및 농축 칼럼에 전달 하 고 30 초 동안 15000 x g 에서 원심 분리기를 통과 시켰다.
    3. 모든 샘플이 열을 통과할 때까지 8.8.2 단계를 반복 합니다. 추가 400 µ L에 RNA 준비 버퍼를 열 및 원심 분리기에서 30 초 동안 15000 x g . 플로우 스루를 버리고, rna 세척 완충 액의 700 µ l를 바르고 30 초 동안 15000 x g 에서 컬럼을 원심 분리 하십시오. 흐름을 취소 합니다.
    4. 400 µ L을 추가 하 고 2 분 동안 원심 분리기를 15000 x g 에서 열을 세척 합니다. 열을 조심 스럽게 새 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 열 매트릭스에 뉴 클레 아 제 없는 물 10 µ L을 추가 하 고 2 분간 방치 한 후 30 초 동안 15000 x g 에서 원심 분리기를 사용 하십시오. RT (단계 11.1)까지-80 ° c에서 eclip 샘플을 저장 하십시오.

9. 입력 RNA 3 ' 말단의 탈 인 산화

  1. 추가 15 µ L의 탈 인 산화 마스터 믹스 (2.5 µ L의 10 배 인 산화 버퍼 [100 mM 트리 스-HCl, pH 8.0; 50 mM MgCl2; 1m KCl; 0.2% 트리톤 X-100; 9.5 µ l-뉴 클레 아 제 무 함유 물; RNase 억제제의 0.5 µ l) 내지 10 µ l의 입력 샘플 (단계 8.8.4에서). 37 ° c에서 15 분 동안 1200 rpm으로 흔들어 배양 합니다.
  2. Pnk 마스터 믹스 75 µ l 추가 (20 µ l/5 pnk PH 6.5 버퍼 [350 mM 트리 스-HCl, PH 6.5; 50); 44 µ l의 뉴 클레 아 제 불포함 물; 1 µ l의 rnase 억제제; pnk 효소의 2 µ l;의 7µ l을 샘플에. 0.1 37 ° c에서 20 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  3. 입력 RNA의 정리
    1. 인공 thenucleic 산을 추출 하는 인공 바이 알 (소용돌이 30 초 이상). 새로운 튜브에 각 샘플에 대 한 핵 산 추출 자기 비드의 20 µ L을 추가 합니다. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다.
    2. 1 mL의 RNA 정제 용 해 완충 액 (RLT 완충 액)을 한 번에 비드를 씻으십시오. 30 초 동안 자석에 튜브를 놓고 상층 액을 버립니다.
      참고: 이후 핵 산 추출 자성 비드의 분리는이 단계를 따랐습니다.
    3. 300 µ L의 RLT 버퍼를 사용 하 여 구슬을 소생 하 고 샘플에 추가 합니다. Μ의 5m 염화 나트륨 및 615 µ L의 100% 에틸 알콜을 추가 하 고 피 펫 팅 하 여 혼합 합니다. 실 온에서 15 분간 회전 시켜 서 비드를 자기적으로 분리 하 고 상층 액을 제거 합니다.
    4. 75%에 토에의 한 1 mL의 구슬을 소생 하 고 새로운 튜브로 이송 한다. 30 초 후, 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 비드를 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 에 토 h 75%로 두 번 세척 하 고, 구슬을 자기 분리 하 고, 잔류 액체를 미세한 파이 펫 팁으로 버리십시오. 5 분 동안 공기 건조 (과도 한 건조를 피하십시오).
    5. 뉴 클레 아 제 없는 물 10 µ L로 비드를 소생 하 고 5 분간 자기 분리 된 비드를 배양 하 고, 상층 액의 5 µ L을 새로운 튜브 (아래 3 ' 어댑터 결 찰)로 이동 한다. 나머지 RNA는-80 ° c에서 백업으로 저장 될 수 있다.

10. rna 어댑터는 입력 RNA 3 ' 끝에 결 찰

  1. RiL19 어댑터의 DMSO 및 0.5 µ L의 1.5 µ L을 추가하 고 (단계 9.3.5에서) 입력 RNA의 5 µ l을 65 ° c에서 2 분 동안 배양 하 고 얼음 위에 1 분 이상 둡니다. 각 샘플에 3 ' 결 찰 마스터 믹스의 13.5 µ l 추가 , 피 펫 팅으로 혼합 하 고, 25 ° c에서 75 분 동안 배양 하 고, 15 분 마다 섞으 세요.
    참고: 결 찰 마스터 믹스에는 10 배 결 찰 완충 액의 2 µ L이 포함 되어 있습니다 [500 mM의 트리 스-HCl, pH 7.5; 100 Mm mgcl; 1.5 µ L 뉴 클레 아 제 무-물; RNase 억제제의 0.2 µ L; 0.2 µ L 0.1 M ATP; DMSO 0.3 µ L; 8 µ L의 50% PEG8000; 1.3 µ l의 RNA 리가 제 [30u/µ l].
  2. 결 찰 된 입력 RNA의 정리
    1. 각각의 시료에 대해 자기 비드의 핵 산 추출 20 µ L을 자기적으로 분리 하 고 상층 액을 제거 한다. 1 mL RLT 완충 액으로 한 번 비드를 씻으십시오.
    2. 61.6 µ L의 RLT 완충 액 및 각 시료에 대 한 전사 서 스 펜 션의 소생 비드. 추가 61.6 µ L 100%에 토. 피 펫을 사용 하 여 5 분 마다 15 분 동안 섞어 줍니다. 자기 분리 된 구슬 및 상층 액을 제거 합니다.
    3. 9.3.4 단계를 반복 합니다.
    4. 뉴 클레 아 제 없는 물 10 µ를 갖는 비드를 소생 하 고 5 분간 그대로 둡니다. 상기 비드를 자기적으로 분리 하 고 상층 액의 10 µ L을 새로운 튜브에 전달 한다.
      참고: 이것은 가능한 정지 지점 (입력 샘플은 다음 날까지-80 ° c에서 저장 될 수 있다).

11. 역 전사, DNA 어댑터 cDNA 3 ' 끝에 결 찰

  1. 0.5 µ L의 RT 프라이 머 (표 1) 내지 10µ의 입력 rna (단계 10.2.4에서) 및 10µ l의 클립 rna (스텝 8.8.4에서)를 각각 2 분 동안 65 ° c에서 예비가 열 된 PCR 블록으로 배양 하 여 1 분 이상 얼음 위에 놓습니다.
  2. Rt 마스터 믹스 10 µ L 추가 (2 µ L의 RT 버퍼 [500 mM 트리 스-HCl, pH 8.3; 750 mM KCl; 4 µ의 뉴클레 아 제 불포함 물;의 RNase 억제제의 0.3 µ l; 0.2 µ l의 0.1 m datp; 0.2 µ l of 0.1 µ의 0.1 lltp; 0.1 M dGTP; 0.2 µ L의 0.1 M dTTP; 0.9 µ L의 역방향 역전사)을 각 시료에 혼합 하 고, 55 ° c에서 미리가 열 된 PCR 블록에 45 분 동안 배양 한다.
  3. 3.5 µ L의 PCR 산물 정화 시 약을 사용 하 여 RT 반응 생성 물의 20 µ L을 섞어 줍니다. 37 ° c에서 15 분 동안 배양 합니다.
  4. 0.5 M EDTA의 1 µ L을 추가 하 고 파이 펫 팅으로 섞어 줍니다. PCR 블록에서 70 ° c에서 3 µ 리터의 NaOH를 첨가 하 고, 피 펫 팅 하 고 12 분 동안 배양 하 여 상기 템플릿 RNA를 가수분해 한다.
  5. 1m HCl의 3 µ L을 추가 하 고 피 펫-믹스를 통해 완충 액을 중화 시킵니다.
  6. CDNA의 정화
    1. 자기적으로 분리 된 10 µ L의 핵 산 추출 마그네틱 비드는 각 시료에 대해, 상층 액을 제거 한다. RLT 완충 액 500 µ L로 한 번 씻으십시오.
    2. RLT 완충 액의 93 µ L 및 샘플로의 이동 현 탁 액에서의 소생 비드. 111.6 µ L의 100%에 토를 추가 하 고 5 분간 배양 한 후 2 분 마다 파이 펫을 혼합 합니다. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 비드를 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 80%의에 토를 1 mL의 구슬을 소생 하 고 새로운 튜브로 이동 합니다.
    3. 30 초 후, 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 비드를 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 에 토에 80%로 두 번 씻으십시오. 자석으로 분리 하 고 미세한 팁으로 잔류 액체를 버리십시오. 5 분 동안 공기 건조 (과도 한 건조를 피하십시오). 5 µ의 5 mM 트리 스-HCl에서 비드를 소생 하 고 5 분간 배양 하였다.
  7. 0.8 µ L의 DNA 어댑터 (표 1) 및 DMSO 1 µ을 비드에 넣고 75 ° c에서 2 분 동안 배양 한다. 1 분 이상 얼음 위에 놓습니다.
  8. 준비 12.8 µ l 결 찰 마스터 믹스 (2 µ l의 10 배 결 찰 완충 액 [500 mM 트리 스-HCl; 100); 1.1 µ의 뉴 클레 아 제-무료 물; 0.2 µ l의 0.1의 µ; 50 µ l의 RNA 리가 제 [30u/µ l]) (PEG8000 , 가볍게 섞어, 원심 분리기에서 짧게 회전 하 고, 각 샘플에 추가 하 고, 파이 펫 팁으로 샘플을 천천히 저 어 줍니다.
  9. 각 샘플에 RNA 리가 제 [30u/µ l]의 또 다른 1 µ l을 추가 하 고 섞어 주세요. 25 ° c에서 30 초 동안 1200 rpm으로 흔들어 배양 합니다. 밤새 25°c에서 배양 합니다. 1 시간에 한 번씩 5 ~ 6 회 가볍게 섞어 줍니다.
  10. 결 찰 cDNA의 클린업
    1. 자기적으로 분리 된 5 µ L의 핵 산을 각 시료에 대해 자성 비드를 추출 하 고 상층 액을 제거 한다.
    2. 500 µ L RLT 버퍼로 한 번 씻으십시오.
    3. RLT 완충 액에 60 µ L의 구슬 및 각 시료에 현 탁 액을 전달 합니다. 100%에 토에 60 µ L을 추가 하 고, 5 분 동안이를 배양 하 고 2 분 간격으로 파이 펫을 혼합 합니다. 자석으로 분리 하 여 상층 액을 버리십시오.
    4. 9.3.4 단계를 반복 합니다.
    5. 트리 스-HCl의 27µ L의 소생 비드를 5 분간 배양 하 여 25 µ 리터의 시료를 새로운 튜브로 이동 시킵니다. 새로운 튜브에 뉴 클레 아 제 없는 물 9 µ L와 함께 결 찰 cDNA의 1 µ L을 희석 한다. 13.1 단계까지-20°c에서 나머지 샘플을 저장 한다.

12. 실시간 정량 PCR에의 한 cDNA의 정량화 (qPCR)

  1. 9 µ L의 qPCR 마스터 믹스 (5 µ L)를 추가 하십시오; 3.6 µ L 뉴 클레 아 제 무 첨가 물; 프라이 머 믹스의 0.4 µ L은 96 웰 qPCR 플레이트에 [10µ M PCR-D50X 및 10µ M PCR-D70X]). 11.10.5 단계에서 µ의 희석 된 1:10의 1리터를 첨가 하 여 밀봉 하 고 섞어 줍니다.
  2. 써 모 사이 더에서 qPCR 프로그램 실행: 50 ° c에서 2 분; 95 ° c에서 2 분; 95 ° c에서 3 초 후 40 사이클 동안 68 ° c에서 30 초; 95 ° c에서 15 초 후 68 ° c에서 60 초 후 1 사이클 동안 95 ° c에서 15 초. Ct (주기 임계값) 값을 기록해 둡니다.

13. cDNA의 PCR 증폭

  1. 35 µ의 PCR 마스터 믹스의 분배 (25 µ L; 5 µ의 뉴 클레 아 제 불포함 물; 프라이 머 믹스 5µ L [20 µ M PCR-D50X 및 20µ M PCR-D70X]) 8 웰 스트립에. 클립 그룹의 경우 12.5 µ L의 클립 샘플 + 2.5 µ L을 추가 합니다. 입력 그룹의 경우 입력 10 µ L + 5 µ L을 잘 섞어 원심분리기에서 짧게 회전 시킵니다.
  2. PCR 프로그램 실행: 98 ° c에서 30 초; 98 ° c에서 15 초 후 68 ° c에서 30 초 후에 72 ° c에서 6 사이클 동안 40 s; 98 ° c에서 15 초 뒤에 60의 N 싸이 클에 대해 72 ° c에서 = (qPCR Ct 값-3); 60의 72 ° c; 4°c 홀드.
    참고: 첫 번째 클립 몇 개에 대해 1 ~ 2 개의 추가 PCR 주기를 수행 하는 것이 좋습니다.

14. 젤 정제

  1. 3% 고 분해능 아가 로스 젤에 샘플을 적재 합니다. 샘플 사이에 1 개의 빈을 잘 남겨두고 젤 양쪽에 사다리를 사용 합니다. 스 트리-붕 산 염-EDTA (TBE) 완충 액에서 75 분 동안 100 V에서 실행 하십시오.
  2. 청색 광 조명에서 각 시료에 대해 신선한 면도날을 사용 하 여 젤 슬라이스 175-350 bp를 잘라 냅니다. 15 mL의 원뿔형 튜브에 넣습니다.
    1. 젤 슬라이스를 계량 하 고 겔 추출 키트를 사용 하 여 젤을 용 출 합니다.
    2. 겔 용 해 완충 액의 6 배 부피를 추가 하 여 겔을 녹여 냅니다 (100 겔 = 600 µ 젤 용 해 완충 액). 실 온에서 젤을 녹 이세요. (젤 조각이 완전히 녹을 때까지 15 분 마다 섞어 흔들어 주세요). 1 젤 부피 100%의이 소 프로 판 올을 넣고 잘 섞어 줍니다.
    3. 750 µ L 샘플 (스텝 14.2.2에서)을 수집 튜브의 칼럼에 17900 x g 에서 1 분간 원심 분리 하 여 통과 시킵니다.
    4. 모든 샘플이 컬럼을 통과 할 때까지 14.2.3 단계를 반복 하 고 젤 용 해 완충 액을 500 µ L로 한 번 씻으십시오.
    5. 750 µ L의 세척 완충 액 (젤 추출 키트에서)을 칼럼에 추가 하 고 17900 x g 에서 1 분간 원심 분리기를 제거 합니다. 플로우 스루를 버리고 2 분 동안 17900 x g 에서 스핀 하십시오. 열을 새 1.5 mL 튜브에 놓습니다.
    6. 열의 플라스틱 보라색 테두리에서 남아 있는 세척 버퍼를 모두 제거 합니다. 공기 건조 2 분 동안 멤브레인의 중앙에 뉴 클레 아 제 없는 물 12.5 µ L을 추가 합니다. 칼럼을 실 온에서 2 분 동안 방치 하 고 1 분 동안 17900 x g 에서 회전 시킨다 (향상 된 수율을 위해, 용 출 단계를 반복 한다).

15. PCR 산물의 토 포 클론

  1. 상기 14.2.6 단계 로부터 PCR 산물 1 µ l을 생성 하는 토 포 클로닝 반응 믹스 1 µ L. 멸 균 수 3 µ L). 20-37 ° c에서 5 분간 부드럽게 섞은 후 배양 하십시오. 얼음 위에서 식혀 보세요.
  2. 얼음에 화학적으로 유능한 대장균 박테리아를 해 동. 추가 5 µ L에 토 포 클로닝 제품의 유능한 박테리아의 100 µ L29. 부드럽게 잘 섞어 주세요. 30 분간 얼음을 배양 합니다.
  3. 42 ° c에서 60의 열 충격. 그런 다음 얼음을 2 분간 식힙니다. 900 µ L을 추가 하 고, 37 ° c에서 1 시간 동안 배양 하 여 225 rpm으로 흔들어 준다. 1000 x g 에서 1 분간 스핀 한 다음 상층 액의 900 µ l을 제거 합니다. 나머지 솔루션을 소생 합니다.
  4. 형질 전환 된 세균을 앰 피 실린 (100 µ)를 함유 하는 1.5% LB 아가 플레이트 상에 플레이트 하 고, 37 ° c에서 밤새 배양 한다.
  5. 각 구성에 대해 적어도 20 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 준비 하십시오. 100 µ g/mL 암 피 실린을 함유한 500 µ L의 LB 배지로 1 세트를 채웁니다. 멸 균 피 펫 팁을 사용 하 여 1 개의 세균 식민지를 무작위로 긁어 내 고 LB µ의 500에 따라 (파이 펫 팅으로) 혼합 하십시오. 37 ° c에서 5 시간 동안, 225 rpm으로 흔들어 배양 한다.
  6. M13 역 프라이 머를 이용 하 여 인서트 단편을 서 열 하 고, 생거 염기 서 열 분석 법으로30.

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결과

상기 eclip 절차 및 결과는도 1,도 2,도 3에 도시 되어 있다. 마우스는 외과 용가 위를 이용 하 여 하복 부에 제조 하였으며 작은 절 개를 이산화탄소로 안락사 시켰다 (도 2a,B

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토론

생물학적 및 병리학 적 맥락에서 rbps의 보편적 역할에 대 한 이해가 증가 함에 따라, 클립 방법은 rbps20,32,33의 분자 기능을 공개 하는 데 널리 활용 되 고 있습니다. 34,35. 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스 고환에 대 한 eCLIP 방법의 적응 된 응용 프로그램을 나타냅니다.

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

우리는 원래 프로토콜에 도움이 되는 지침에 대 한 에릭 L 밴 Nostrand과 유전자 W 감사 합니다. K.Z.는 중국의 국가 키 R & D 프로그램 (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) 및 중국의 국가 자연 과학 재단 (31771653)에 의해 지원 되었다. L.Y.는 중국의 국립 자연과학 재단 (81471502, 31871503)과 강 소 지방의 혁신적이 고 기업가 프로그램에 의해 지원 되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibodyProteintech, China10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibodyZheng et al.20109polyclonal antisera UP2175provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG ABclonalAS014
Rabbit IgGBeyotime, ChinaA7016
Equipment
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany5242R
Digital sonifierBRANSON,USABBV12081048A450 Watts; 50/60 Hz
DynaMag-2 MagnetInvitrogen,USA12321D
Mini Blot ModuleInvitrogen,USAB1000
Mini Gel TankInvitrogen,USAA25977
Shaking incubatorEppendorf, Hamburg, GermanyThermomixer comfort 
Tissue Grinder, DouncePYREX, USA1234F35only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 GradientBiometra, Germanyserial no.: 2604323
Tube Revolver Crystal, USAserial no.: 3406051
UV-light cross-linkerUVP, USACL-1000
Materials
TC-treated Culture DishCorning, USA430167100 mm 
TubesCorning, USA43079115 mL
Microtubes tubesAXYGEN , USAMCT-150-C1.5 mL 
Reagents 
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol Solarbio, ChinaP101125:24:01
AffinityScript EnzymeAgilent, USA600107
AntioxidantInvitrogen,USANP0005
DH5α competent bacteriaThermo Scientific, USA18265017these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSOSigma-Aldrich, USAD8418
DNA LadderInvitrogen, USA10416014
dNTPSigma-Aldrich, USADNTP100-1KT
Dynabeads Protein A Invitrogen, USA10002D
ECL reagentVazyme, ChinaE411-04
EDTAInvitrogen, USAAM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktailRoche, USA04693132001add fresh
Exo-SAP-ITAffymetrix, USA78201PCR Product Cleanup Reagent 
FastAP enzymeThermo Scientific, USAEF0652
LDS Sample BufferThermo Scientific, USANP0007
MetaPhor Agarose lonza, Switzerland50180
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G
MiniElute gel ExtractionQIAGEN, Germany28604column store at 4 ?; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beadsThermo Scientific, USA37002Dnucleic acids extraction magnetic beads
NaClInvitrogen,USAAM9759
 
NP-40Amresco, USAM158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein GelsInvitrogen, USANP0336BOX4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit Invitrogen, USANP0050
PBSGibco, USA10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube  TIANGEN, ChinaWM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems, USAA25742
Proteinase KNEB, New England P8107S
Q5 PCR master mix NEB, New England M0492L
RLT bufferQIAGEN, Germany79216RNA purification lysis buffer 
RNA Clean & Concentrator-5 columns ZYMO RESEARCH, USAR1016RNA purification and concentration columns
RNase I Invitrogen, USAAM2295
RNase InhibitorPromega, USAN251B
RQ1 DNasePromega,USAM610A
Sample Reducing AgentInvitrogen,USANP0009
SDS SolutionInvitrogen, USA1555302710%
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich, USA30970protect from light
T4 PNK enzymeNEB, New England M0201L
T4 RNA ligase 1 high concNEB, New England M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning MixVazyme, ChinaC601-01
TBEInvitrogen,USAAM9863
Tris-HCI BufferInvitrogen, USA15567027
Triton X-100Sangon Biotech, ChinaA600198 
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560
UreaSigma-Aldrich, USAU5378
X-ray FilmsCaresteam, Canada6535876

참고문헌

  1. Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
  2. Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
  3. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  4. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  5. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
  6. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
  7. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
  8. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
  9. Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
  10. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
  11. Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
  12. Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
  13. Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).
  14. Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
  15. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
  16. Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
  17. Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).
  18. Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54(2017).
  19. Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).
  20. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  21. Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
  22. Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  23. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  24. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  25. Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  26. Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  27. Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).
  28. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  29. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24(2011).
  30. Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
  31. Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
  32. Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
  33. Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
  34. Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
  35. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  36. Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).

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