E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

요약

여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.

초록

1 차적인 신경 문화는 신경 과학의 필드에 있는 필수적인 기술입니다. 두뇌에 더 깊은 기계론적 통찰력을 얻으려면, 각종 신경생물학 연구 결과를 위해 이용될 수 있는 강력한 시험관내 모형이 필수적입니다. 비록 기본 신경 문화 (즉, 장기 해 마 문화) 모델 과학자를 제공 했습니다., 그것은 아직 완전히 뇌 네트워크의 복잡성을 대표 하지 않습니다. 이러한 한계의 여파로, 새로운 모델은 신경 구를 사용하여 등장했다, 이는 뇌 조직에 가까운 유사성을 곰. 본 프로토콜은 배아일 14-16 스프라그 다울리 래트의 배아로부터 분리된 혼합 된 피질 및 해마 뉴런의 높고 낮은 밀도의 도금을 기술한다. 이것은 추가 연구를 수행하기 위하여 2개의 독립적인 적인 단자로 신경구 및 장기 1 차적인 신경 문화의 생성을 허용합니다. 이 과정은 매우 간단 하 고 비용 효율적인, 그것은 여러 단계를 최소화 하 고 시약 이전에 신경 문화에 대 한 필수적인 것으로 간주. 이것은 달성 가능한 결과로 수행 될 수 있고 신경 과학과 관련된 다양한 연구에 더 많이 사용될 수있는 최소한의 요구 사항을 가진 강력한 프로토콜입니다.

서문

뇌는 신경 세포와 비 신경 세포의 복잡 한 회로. 수년 동안 과학자들은 이 복잡한 기계에 대한 통찰력을 얻기 위해 노력해 왔습니다. 이렇게 하기 위하여는, 신경 과학자는 처음에 조사를 위한 각종 변형된 신경 기지를 둔 세포주에 의지했습니다. 그러나, 이러한 클론 세포주무능력은 강한 시냅스 연결과 적절한 축산 또는 모수석을 형성하는 데 1차뉴런 배양에 대한 과학적 관심을 1,^2로이동시켰다. 1 차적인 신경 문화의 가장 흥미로운 양상은 살아있는 신경세포를 관찰하고 조작할 수 있는 기회를 만든다는 것입니다^3. 또한, 그것은 신경 조직에 비해 덜 복잡 한, 기능 및 다양 한 신경 단백질의 전송을 공부 하기 위한 이상적인 후보. 최근, 현미경 검사법, 유전체학 및 프로테오믹스 분야의 여러 발전은 신경 과학자들이 신경 문화를 악용할 수 있는 새로운 기회를 창출했습니다^4.

1 차적인 문화는 신경 발달의 뒤에 분자 기계장치를 탐구하고, 각종 신경 신호 통로를 분석하고, 시냅스의 더 일관된 이해를 개발하는 신경과학자를 허용했습니다. 여러 가지 방법이 1차 뉴런으로부터의 배양을 보고했지만(대부분 해마^기원5,^6,7),뉴런의 장기 배양을 가능하게 하는 화학적으로 정의된 배지를 가진 통합 프로토콜은 여전히 필요합니다. 그러나, 저밀도에서 도금된 뉴런은 인접 한 뉴런 및 신경교 세포에 의해 제공되는 영양 지지부 8의 부족으로 인해 장기적으로 생존하지 못하는 가장 자주 관찰된다. 일부 방법은 심지어 신경교 세포를 가진 1 차적인 신경세포의 공동 배양제안했습니다, 여기서 신경교세포는 피더 층 9로 이용됩니다. 그러나, 신경교 세포는 때때로 신경 성장^10을재정의하는 그들의 자라난 때문에 많은 문제를 제기합니다. 따라서, 위의 문제를 고려, 간단 하 고 더 비용 효율적인 기본 신경 문화 프로토콜 필요, 조사에 대 한 신경 생물학자와 신경 화학자 모두에 의해 사용할 수 있는.

1 차적인 신경 문화는 본질적으로 2D 문화의 한 형태이고 두뇌의 가소성, 공간 무결성, 또는 이질성을 나타내지 않습니다. 이것은 신경구^11,12에게불린 더 믿을 수 있는 3D 모형을 위한 필요를 초래했습니다. 신경구는 신경 과학자에게 새로운 플랫폼을 제시, 실제에 가까운 유사, 생체 내 뇌^13. 신경구는 신경 줄기 세포 (NSC), 신경 전구 세포 (NPC), 뉴런 및 성상 세포가 풍부한 세포의 비 부착 3D 클러스터입니다. 그들은 신경 줄기 세포와 신경 전구 세포의 격리에 대 한 훌륭한 소스, 다양 한 신경 및 비 신경 계보로 분화를 공부 하는 데 사용할 수 있는. 다시, 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 생성된 신경구 배양 내의 가변성은 통합된신경구 배양 프로토콜(14)의 제형에 장벽을 제시한다.

이 원고는 혼합 된 피질 및 해마 배양으로부터 세포 도금 밀도를 번갈아 가며 2D 및 3D 플랫폼을 모두 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 그것은 이내 7 일 자유 부동 신경구는 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 고밀도 도금 뉴런에서 얻어진다는 것을 관찰됩니다, 이는 추가 문화에 따라, 방사형 신경교와 같은 확장을 통해 다리와 상호 연결을 형성합니다. 유사하게, 저밀도 도금 뉴런에서, 최대 30일 동안 유지될 수 있는 1차 뉴런 배양은 일주일에 두 번 유지 배지를 변경함으로써 수득된다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 실험 절차는 CSIR-인도 화학 생물학 연구소의 기관 동물 윤리위원회 (IICB / AEC / 회의 / 4 월 / 2018 / 1)에 의해 승인되었습니다.

1. 시약 및 미디어 준비

1. 폴리-D-리신(PDL) 용액: 탈이온수에서 0.1 mg/mL의 농도로 PDL 용액을 준비하고 사용할 때까지 4°C에 보관하십시오.
2. 해리 매체: 멸균, 여과 된 탈이온수 1 L에 염화 나트륨 (8 mg / mL), 염화 칼륨 (0.4 mg / mL), 칼륨 인산 염 모노 베이직 (0.06 mg / mL), D-글루코스 (1 mg / mL), 나트륨 인산염 디베이직 (0.479 mg / mL), 및 1 M HEPES [4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에설포닉 산; 10 mM]. 모든 성분을 소용돌이로 적절히 혼합하고 사용할 때까지 4°C에 보관한다.
   참고: 해리 시에는 얼음-차가운 형태로 해리 배지를 사용하지만 실온(RT)에서는 세척 및 기타 용도로 사용하십시오.
3. 도금 매체: 도금 매체는 다음과 같은 것으로 구성됩니다: 최소 필수 배지 (MEM) 이글의 얼의 균형 잡힌 소금 용액 (BSS; 88.4%), D-포도당 (0.6%), 말 혈청 (10%), 페니실린/연쇄상 구균 (1%). 구성 요소를 각각의 비율로 결합하고 멸균 조건하에서 후드 내부의 절차를 수행합니다.
   참고: 모든 성분의 열화를 방지하기 위해 항상 신선하게 준비된 도금 매체를 사용하십시오.
4. 유지 매체: 신경기재(97%), 0.5 mM 상업적으로 얻은 글루타민 샘플, B27 혈청 프리 보충제(2%), 페니실린/스트렙토마이신(1%)의 각각 비율로 다음을 결합하여 유지 매체를 준비한다. 구성 요소를 각각의 비율로 결합하고 멸균 조건하에서 후드 내부의 절차를 수행합니다. 모든 구성 요소가 새로 준비되었는지 확인하십시오.

2. 커버립준비

1. 직경 12mm의 둥근 유리 커버슬립을 가지고 4시간 동안 1M 염산(HCl)에 담가 둡니다.
2. 한 쌍의 집게를 사용하여 증류수에 덮개를 옮기고 산을 완전히 제거하기 위해 부드럽게 돌십시오.
3. 100% 에탄올이 함유된 비커에서 세척된 커버슬립을 추가로 세척합니다.
4. 커버립을 사용하기 전에 티슈 페이퍼에 보관하여 층상 후드에서 잘 건조시십시오.

3. 뉴런 배양용 폴리-D-리신 코팅 플레이트 준비

1. 24 개의 웰 플레이트를 가져 가라 : 고밀도 도금용과 저밀도 도금용 다른 플레이트. 멸균 패킷은 층상 후드 내부에서만 엽니다.
2. 24 웰 플레이트에 12mm의 멸균 유리 커버립을 옮김을 옮김.
3. 300 μL의 PDL 용액(탈이온수에서 0.1 mg/mL)을 각 우물에 부어 커버슬립의 표면을 완전히 덮습니다.
4. 건조를 방지하고 CO2 인큐베이터에 밤새 보관하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 감싸십시오.
5. 다음날(도금 전) PDL 용액을 흡인하고 300 μL의 멸균 탈이온수로 2~3회 제대로 세척한다.
6. 갓 제조된 도금 매체 200 μL을 추가하고 도금될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 되돌려 보냅니다.

4. 태아의 제거 및 참수

참고: 알루미늄 호일에 포장된 모든 수술 기구를 121°C(15psi)의 오토클레이브에서 30분 동안 소독하십시오. 여기에는 한 쌍의 무딘 말단 가위, 집게, 미세 집게, 2 개의 미세 가위 및 전체 절차에 대한 하나의 동맥 집게가 포함됩니다.

1. 뉴런과 신경구를 생성하기 위해, 시간 적 임신 한 Sprague Dawley 쥐를 사용하고 질 플러그 검출을 E0로 하루를 표시하십시오.
   참고: E14-E16 간에 문화권이 수행되어야 합니다.
2. 문화의 날에멸균 유리 페트리 플레이트를 얼음 위에 놓고 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 채웁니다.
3. E14-E16 임신 한 쥐를 복강 내 (즉)의 체외 (즉)로 마취시키고 체중 90 mg의 케타민 / kg과 10 mg의 자일라진 / kg을 주입 한 다음 자궁 경부 탈구를 수행하여 희생하십시오.
   참고: 쥐는 또한 자일라진 또는 다이아제팜과 함께 펜토바르비탈또는 케타민과 과다 복용하여 안락사시킬 수 있습니다.
4. 70% 에탄올을 분사하여 댐의 복부를 살균하고 멸균 집게와 무딘 끝 가위를 사용하여 복부 부위에 V 자른자를 만듭니다.
5. 차가운 HBSS 용액으로 페트리 플레이트에 조심스럽게 배아 주머니를 가져 가라.
   참고 : 내부 장기를 오염시킬 수 있기 때문에 피부에 방금 사용 된 것과 동일한 집게와 가위를 사용하지 마십시오. 내부 장기에 다른 가위/집게 세트를 사용합니다.
6. 신선하고 차가운 HBSS에서 배아 주머니에서 배아를 꺼내십시오.
7. 멸균 가위로 머리를 참수하십시오.

5. 해마와 피질의 뇌와 해부제거

1. 시작하기 전에 차갑고 멸균된 HBSS로 90mm 멸균 페트리 접시를 채우소서.
2. 멸균, 무딘 종료 드레싱 집게를 사용하여 멸균 접시에 머리를 전송합니다.
3. 스테레오 현미경 에서, 멸균, 톱니 모양의 집게와 주전자 영역에서 머리를 잡고 피부와 두개골을 열어 절단하여 뇌를 제거합니다.
4. HBSS 용액에서 동일한 방식으로 모든 배아 뇌를 수집합니다.
5. 뇌간을 잡고 반구와 중뇌에서 모든 수막을 제거합니다.
6. 조심스럽게 해마와 피질을 포함하는 버섯 모자를 닮은 그대로 반구를 제거합니다.
7. 10 mL의 해리 배지를 포함하는 15 mL 원엽 관에서 피질 및 손상되지 않은 해마를 포함하는 반구를 수집합니다.

6. 피질 과 해마 조직을 단일 뉴런으로 해리

1. 수집 된 조직이 정착하고 해리 매체를 흡인하게하여 배지의 5 %-10 %를 남깁니다.
2. 조직에 신선한 해리 배지 10 mL를 추가하고 6.1 단계를 두 번 반복합니다.
3. 해리 배지 4.5 mL과 0.25% (1x) 트립신 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세테이트) 용액을 추가하십시오.
4. 소화가 진행될 수 있도록 조직을 인큐베이터에 37°C에서 20분 동안 유지한다.
5. 배지를 흡인하고 소화된 조직에 연속적으로 해리 및 도금 배지10 mL를 첨가한다.
6. 소화 된 조직이 정착하고 해리 배지를 흡인할 수 있도록하십시오. 도금 매체 2.5 mL를 추가하고 90mm 멸균 접시의 베이스에 부어.
7. 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 접시의 코너 베이스에 있는 소화된 조직을 최소한의 부피를 차지하도록 삼중화한다.
8. 얻어진 세포 현탁액을 조직의 덩어리를 제외한 70 μm 세포 스트레이너를 통과한다.
9. trypan 청색 염료 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 밀도를 결정하고 자동화된 세포 카운터에서 셀 수를 계산합니다.
   1. 트라이판 블루 염료 배제 방법의 경우, 셀 현탁액의 10 μL 및 0.4% 트라이판 블루 얼룩의 10 μL을 취하고, 철저하게 혼합하고, 일회용 챔버 슬라이드의 두 개의 동봉된 챔버 중 하나에 혼합물의 10 μL을 첨가한다.
   2. 혼합물을 포함하는 슬라이드를 셀 카운터에 삽입하고 판독값을 얻습니다.
      참고 : 트라이판 블루 염료 배제 방법은 살아있는 세포 (그대로 막으로 인해)가 trypan 파란색 염료를 배제하고 따라서 쉽게 트립팬 블루를 차지하고 파란색으로 나타나는 실행 불가능한 세포에 비해 명확한 세포질이 표시된다는 원리를 기반으로합니다. 색상¹⁵.
10. 도금 배지각각 30 mL를 함유하는 두 개의 분리된 튜브에서 저밀도를 위해 플레이트 1.5 x 10⁵ 셀/mL및 저밀도20,000 셀/mL에 얻어진 셀수를 희석한다.
11. 이전에 첨가된 도금 배지를 각각의 웰 및 플레이트 500 μL의 도금 배지에 분산하여 각 웰에 도금 배지에 분산하였다.
12. 그 후 플레이트를 37°C및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이터로 되돌린후.
13. 도금 후 현미경 4시간 하에서 순응도를 검사합니다.
14. 두 플레이트에 세포의 적절한 순응도가 있는 경우, 각 우물의 배지를 500 μL의 신선한 유지 보수 배지로 교체하고 37°C에서 배양한다.
15. 이러한 뉴런을 30일 동안 저밀도로 성장시켜 유지 매체를 주당 2회 변경하여 배양하였다.
16. 동일한 유지 보수 배지에서 고밀도 도금 뉴런으로부터 얻어진 신경구를 초저 부착 판으로 이송하여 배양한다.
17. 뉴런과 신경구를 중요한 마커로 면역으로 염색하여 특성화합니다. 면역 세포 화학의 경우, 먼저 플레이트 자체에서 30 분 동안 4 % 포름 알데히드를 사용하여 세포 / 신경 구를 수정 한 다음 0.1 % 비 이온 성 세제로 세포를 10 분 동안 투과시하십시오.
18. 인산완충식염수(PBS)에서 뉴런(anti-Tuj1, GFAP, O4, 타우) 및 신경구(anti-Nestin, GFAP, Tuj1)에 대한 1차 항체를 1:300 농도에서 첨가하고 4°C^16에서밤새 배양한다.
    참고: Tuj1(클래스 III β-tubulin) 및 타우는 1차 뉴런에 대한 양성 마커이며, GFAP(신경교섬유 산성 단백질) 및 O4(올리고엔드로시테 마커)는 1차 뉴런에 대한 음성 마커(17,18)이다. 신경구의 경우, Tuj1, GFAP 및 네스테틴은 모두19,²⁰의 양성 마커역할을 한다.
19. 다음날, PBS로 세포를 한두 번 세척하고 2 시간 동안 RT에서 1:600 농도에서 PBS에 적절한 이차 항체를 추가하십시오.
    참고: 항마우스 또는 항-토끼 이차 항체는 첨가된 1차 항체의 숙주 종에 따라 선택된다. 이차 항체는 형광 현미경 검사법 목적에 적합한 형광 유도체에 공액되어야한다는 것을 명심해야합니다.
20. 한 두 번 PBS로 세포를 다시 씻으십시오.
    1. Hoechst 33258 (탈이온수에서 1 mg / mL 스톡 솔루션)으로 세포의 핵 염색을 수행하십시오. 스톡 솔루션에서 PBS에서 0.1% Hoechst 솔루션을 준비하고 셀에 추가합니다.
    2. 세포를 0.1 % Hoechst 용액으로 30 분 동안 배양 한 다음 PBS로 다시 씻으십시오.
21. 슬라이드에 20 μL PBS(또는 장착 매체)를 추가하고 염색된 셀이 포함된 커버슬립을 PBS를 포함하는 슬라이드 영역에 천천히 장착합니다. 디부틸프탈레이트 폴리스티렌 자일렌(DPX)으로 커버슬립의 여백을 밀봉합니다.
22. 10x 및 40x 배율로 현미경으로 고정 된 세포의 이미징을 수행합니다.

결과

이 프로토콜에서는, 2개의 다른 신경 검열 단자에서 가변 세포 도금 밀도가 얻어지는 간단한 전략이 해명되었습니다. 도 1A,B는 각각 고밀도 및 저밀도 도금 세포에서 뉴런을 도금한 후 4시간 후에 세포의 순응도를 나타낸다. 도1에 도시된 바와 같이 뉴런의 적절한 순응도를 관찰함에 따라, 도금 배지는 각각의 웰에?...

토론

이 프로토콜은 1차 뉴런의 세포 도금 밀도를 변경함으로써, 2개의 가변 뉴런 플랫폼이 수득되는 방법을 설명한다. 이것은 간단한 방법이지만 원하는 결과를 얻으려면 각 단계를 세심하게 수행해야합니다. 다른 이전 방법 중 장기 기본 신경 문화 또는 신경 구 배양 보고. 대부분의 기본 신경 문화 프로토콜에 대 한 해 마 뉴런의 배양을 포함 했다 3-5 주, 하지만 대부분 실패, 뉴런 죽고 연결의 손실로...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072