케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성

요약

이 작품은 C. elegans에있는 endocannabinoid 2-아라키도노이드 글리세롤 (2-AG)를 검출하고 정량화하는 강력하고 간단한 방법을 기술합니다. 분석 적 증명 기준은 동위원소 희석 및 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의한 2-AG의 정량화에 제조및 사용되었습니다.

초록

이 작품은 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS/MS)에 의해 2-아라키도노일 글리세롤(2-AG)을 질적 및 정량적으로 분석하기 위한 분석 표준을 준비하는 방법을 제시한다. 엔도 칸 나비 노이드는 다양한 유기체에서 여러 생물학적 과정을 조절하는 보존 지질 중재자입니다. C. elegans에서,2-AG는 다이어 형성과 콜레스테롤 대사의 변조를 포함하여 다른 역할을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 보고서는 2-AG 정량화에 필요한 중형 표준의 비용 및 안정성과 관련된 어려움을 극복하는 방법을 설명합니다. 표준의 합성 절차는 간단하며 유기 합성 전문 지식이나 특수 장비없이 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 또한, C. elegans 배양으로부터 증명된 표준을 추출하는 Folch의 방법의 변형이 설명된다. 마지막으로, 안정된 동위원소 표지된 아날로그 1-AG-d_5를 사용하여 2-AG를 검출하는 정량적 및 분석적 방법이 설명되어, 이는 빠른 크로마토그래피 실행에서 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다. 절차는 또한 다른 유기체에 있는 대사 산물의 그밖 연구 결과에 적용되는 동안 C. elegans에 있는 2-AG의 다중 역할을 공부하기 를 위해 유용합니다.

서문

엔도 칸 나비 노이드는 다양한 유기체에서 여러 생물학적 과정을 조절하고 지질 중재자^1. 첫 번째로 발견되고 가장 잘 특징지어지는 엔도칸나비노이드는 아난다미드(아라키도노일레탄올라미드, AEA) 및 2-아라키도노일 글리세롤(2-AG)입니다. 엔도 칸 나비 노이드는 많은 중요한 역할을, 뇌 보상 시스템뿐만 아니라 약물 중독에 관련된 사람들을 포함, 메모리, 기분, 및 대사 과정². AEA 및 2-AG는 필요할 때만 합성되고 수명이 짧으며 운반 단백질 재섭취 및 가수 분해^3을통해 분해됩니다.

예쁜꼬마선충(C.elegans)과같은 동물 모델의 사용은 세포사멸, 세포 신호, 세포 주기, 세포 극성, 유전자 조절, 대사, 노화, 및 섹스 결정^4,5. 또한, C. 예쁜꼬마선충은 고도 불포화 지방산 (PUFAs)의 생리적 역할을 연구하기위한 훌륭한 모델입니다. AEA는 C. 예쁜꼬마선충에서 확인되었으며 식이^제한6에 따라 감소됩니다. 이 결핍은 엔도 칸 나비 노이드와 보충에 의해 억제 될 수있는 식이 제한 메커니즘을 통해 선충의 수명을 연장. 최근에는 2-AG와 AEA가 C. elegans^7에서콜레스테롤 인신 매매의 조절에 근본적인 역할을한다는 것이 밝혀졌습니다. 더 중요 한 것은, 외 인 2-AG와 보충 다 이어 체포를 구출할 수 있습니다 결정 했다, 니만-픽 유형 C1 C. elegans 돌연변이에서 장애인된 콜레스테롤 인신 매매에 의해 발생 하는.

선충에서 콜레스테롤 인신 매매 및 기타 생물학적 과정 (즉, monoaminergic 신호, 항혈및 운동)과 2-AG의 관계를 더 잘 이해하려면이 내인성 대사 산물과 방법을 연구하는 것이 중요합니다. 특정 환경 및 식이 조건^하에서영향을 받는^{8,9,10,11,12,13}. 따라서, 다른 분야의 과학자, 특히 이와 관련하여 선충의 행동을 연구하는 사람들에게 사용하기 가 간단한 C. elegans에서 내인성 2-AG를 감지하고 정량화하는 방법을 설계하고 최적화하는 것이 필수적입니다. 엔도 칸 나비 노이드.

2008년, 레톤과 동료들은 LC-MS 분석 방법^14를사용하여 C. elegans에서 2-AG 및 AEA를 식별하는 데 성공했습니다. 2011 년, 그들은 다른 엔도 칸 나비 노이드^15이기술을 확장 할 수 있었다. 최근 연구는 질량 분석및 GC-MS 16,^{17, 18,}및^18을포함하여 C. elegans에있는 endocannabinoids를 검출하고 정량화하는 성공한 그밖 분석 방법을 보여주었습니다 또한 유사한 분석 방법이 다른^{모델(19)으로}확장될 수 있다고 보고되었다.

생물학적 샘플에서 2-AG를 정량화하는 데 사용되는 이전에 보고된 분석 방법은 일반적으로 상업적으로 획득되고 구매^20,21에대한 가용성을 요구하는 중증 분석 표준의 사용을 포함한다. 엔도 칸 나비 노이드의 LC-MS / MS 정량화에 대한 많은 분석 표준은 다른 공급자에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 비싸고 민감하며, 여러 이중 결합의 존재로 인해 시간이 지남에 따라 산화됩니다. 이들 표준의 가장 일반적인 버전은 옥타-분해 아라키돈산을 기반으로 하며 동위원소 희석 LC-MS/MS^14,22에의한 정량화에 적합하다. 또한, 이러한 표준의 대부분은 글리세롤의 위치 2에서 대체, 그들은 아실 마이그레이션하는 경향이 있기 때문에 대부분의 조건에서 불안정하게^19,23.

이러한 deuterated 표준의 비용 및 안정성과 관련된 어려움을 극복하기 위해, 편리하고 간단한 방법은 글리세롤-d_5에기초하여 분석 표준을 준비하는 제시된다. 펜타-제형 표준을 준비하는 서열은 안정적이고 아실 이동을 거치지 않는 표준 1-AG-d_5를초래하는 3단계 절차가 필요하다(2-모노아실글리세롤을 합성하는 것을 목표로 할 때의 주요 문제).

여기서 주요 목적은 분석 제명 표준의 합성, 선충 시료의 준비 및 추출, LC-MS/MS에 의한 분석(그림 1)을 포함하여 C.elegans에서2-AG를 연구하는 간단하고 재현 가능한 방법을 보여주는 것입니다. ). 이 합성 절차는 정교한 유기 합성 지식 이나 특수 장비 없이 달성 할 수, 엔도 칸 나비 노이드 영향아래 C. 예쁜 꼬마 행동을 공부하는 다른 분야의 과학자에 적합하게. 이 방법은 다른 연구 모델로도 확장할 수 있으므로 다른 대상에 유용합니다. 여기에 보고된 바와 같이, 이 표준은 재현 가능한 방식으로 2-AG를 효과적으로 검출하고 정량화할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 크로마토그래피 방법을 성공적으로 개발하기 위해 적용되었습니다.

프로토콜

1. 1-AG-d₅ 준비

참고: 정량화 분석에 대한 중형 내부 표준으로 1-AG-d_5를 획득하는 경우 아래에 설명된 프로토콜을 따르십시오.

1. 차동 보호
   1. 1차 알코올만 을 보호하기 위해 먼저 38 mg의 글리세롤-d_8을 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 mL 반응 튜브에 넣고 마그네틱 교반기를 추가합니다.
   2. 5 mL 해밀턴 주사기를 사용하여 무수 디클로로메탄 (DCM) 5 mL를 추가하고 튜브를 마른 N_2로 채우고 불활성 분위기를 생성합니다.
   3. 증류된 에틸 아세테이트로 채워진 얕은 Dewar 플라스크를 사용하여 목욕을 준비합니다.
   4. 욕조 내부에 밀폐 반응 튜브를 맞추고 용매가 동결 될 때까지 에틸 아세테이트에 액체 N_2를 천천히 추가하여 냉각시.
      주의: 액체는 실온(RT)에서 격렬하게 끓으며 눈과 피부에 닿을 때 심한 화상을 입을 수 있습니다.
   5. 해밀턴 주사기를 사용하여 무수 콜린 54 mg을 추가합니다.
      주의: 콜라이더는 휘발성이며 매우 강하고 불쾌한 향기를 가지고 있습니다.
   6. 70 mg의 테르트 부틸디메틸틸실염을 넣고 자기 교반기에서 -78°C에서 3시간 동안 전체 용액을 저어줍니다.
   7. 3 시간 후, RT에서 따뜻하게 반응을 두고 추가 12 시간 동안 교반을 유지합니다.
   8. 반응을 담금질하기 위해 소금물 2 mL을 추가하십시오.
   9. 분리 된 깔때기를 사용하여 증류된 디클로로메탄 2 mL로 용액을 3x 추출하여 매번 유기 추출물을 저장합니다.
   10. 세 가지 유기농 추출물을 결합하여 황산 나트륨 위에 건조시면 됩니다.
   11. 진공 회전 증발기에서 감소된 압력하에서 디클로로메탄을 신중하게 증발하여 용매 돌기를 방지합니다.
   12. 고상으로 실리카 젤을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 혼합물을 정제하고 100% 헥산에서 시작하여 100% 에틸 아세테이트로 마무리하는 헥산/에틸 아세테이트 그라데이션을 10% 증가시다.
   13. 제품 함유 분획을 결합하고 진공 회전 증발기에서 감소된 압력하에서 용매를 제거하여 순수한 1-O,3-O-Bis-(TBDMS) 글리세롤-d_5를 무색 액체로 얻었다.
2. 에스테르화
   1. 1-O,3-O-bis(TBDMS)-글리세롤-d_5(이전에 합성)의 10 mg을 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 mL 반응 튜브에 넣고 마그네틱 교반기를 추가합니다.
   2. 5 mL 해밀턴 주사기를 사용하여 무수 디클로로메탄 2 mL를 추가하고 튜브를 마른 N_2로 채우고 불활성 분위기를 생성합니다.
   3. 얼음 욕조를 사용하여 용액을 0 °C로 냉각시.
   4. 다중 부피 조절 가능한 마이크로파이펫을 사용하여 36 mg의 아라키돈산을 넣고 저어줍니다.
   5. 15 mg의 디메틸아미노피리딘을 넣고 저어줍니다.
   6. 다중 부피 조절 식 마이크로 파이펫을 사용하여 N,N'-diisopropylcarbodiimide 15 mg을 추가하고 저어줍니다.
   7. 혼합물을 0°C에서 3시간 동안 반응시키십시오.
   8. 3 시간 후, RT에서 따뜻하게 반응을 두고 추가 12 시간 동안 교반을 유지합니다.
   9. 2 mL의 물을 추가하여 반응을 담금질하십시오.
   10. 분리 깔때기를 사용하여 2 mL의 증류수 디클로로메탄 (DCM)으로 유기 용액을 3x 추출합니다.
   11. 세 가지 유기농 추출물을 같은 튜브에 놓고 황산 나트륨 위에 건조시면 됩니다.
   12. 진공 회전 증발기에서 감소된 압력하에서 디클로로메탄을 신중하게 증발하여 용매 돌기를 방지합니다.
   13. 고상으로 실리카 젤을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 혼합물을 정제하고 100% 헥산/에틸 아세테이트 그라데이션을 100% 헥산에서 시작하여 50% 헥산/50% 에틸 아세테이트로 마무리합니다.
   14. 제품 함유 분획을 결합하고 진공 회전 증발기에서 감소된 압력하에서 용매를 제거하여 순수한 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d_5를 황변액체로 수득한다.
3. 보호 해제
   1. 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d_5(이전에 합성)의 15 mg을 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 mL 반응 튜브에 넣고 마그네틱 교반기를 추가합니다.
   2. 5 mL 해밀턴 주사기를 사용하여 무수 THF 2 mL를 추가하고 튜브를 마른 N_2로 채우고 불활성 분위기를 조성합니다.
   3. 얼음 욕조를 사용하여 용액을 0 °C로 냉각시.
   4. 해밀턴 주사기를 사용하여 THF에 1M 테트라부틸람모늄 불소 용액의 150 μL 드롭와이즈를 추가합니다.
   5. RT에 반응을 따뜻하게하고 1 시간 동안 저어.
   6. 1 시간 후, 반응을 담금질하기 위해 2 mL의 물을 추가하십시오.
   7. 분리 깔때기를 사용하여 증류수 디클로로메탄 2mL로 용액을 3x 추출합니다.
   8. 세 가지 유기농 추출물을 결합하여 황산 나트륨 위에 건조시면 됩니다.
   9. 진공 회전 증발기에서 감압하에서 디클로로메탄을 증발하여 순수한 1-AG-d_5를 황색 액체로 수득한다.
4. 실리카 겔 60 F₂₅₄ 사전 코팅 알루미늄 시트에서 수행된 얇은 층 크로마토그래피에 의한 모든 반응을 모니터링합니다. 4-아니살데히드의 에탄올릭 용액으로 염색한 후 254 nm UV 램프 하에서 밴드를 시각화합니다.

2. 표준 재고 및 측정 솔루션 준비

1. 내부 표준 1-AG-d_5를 ACN 1mL에 1mg을 용해하고 1분 동안 초음파 처리하여 1,000 ppm 표준 스톡 솔루션을 얻습니다.
2. 웜의 정량화에 사용되는 1,000 ppb 용액을 준비하려면 먼저 10 ppm 용액을 준비하십시오: 해밀턴 주사기를 사용하여 스톡 용액의 10 μL을 취하고 ACN 의 990 μL을 추가하여 최종 부피 1mL로 희석하십시오.
3. 해밀턴 주사기를 사용하여 2.2단계에서 제조된 용액으로부터 100 μL을 취하고, 정량화에 사용되는 1,000 ppb 용액을 얻기 위해 ACN의 900 μL을 첨가하여 최종 부피 1 mL로 희석한다.
4. 완벽한 용해도를 보장하기 위해 각 단계 사이에 1 분 동안 초음파 처리. 표준의 농도와 무결성을 유지하기 위해 용액을 -78°C에 보관하십시오. 표준 용액을 사용한 후, 산화를 방지하기 위해 바이알을 닫기 전에 약간의 질소를 흐르게하십시오.

3. C. 예쁜꼬마선충의 성장과 유지

참고 : 대장균 OP50와 선충 성장 매체 (NGM) 한천 접시를 종자이 접시에 벌레를 전파.

1. NaCl 3 g과 한천 17 g을 섞으세요.
2. 펩톤 2.5 g을 추가한 다음 H₂O 975 mL를 추가합니다.
3. 50 분 동안 오토 클레이브를 한 다음 플라스크를 55 °C로 식힙니다.
4. 다음을 혼합: 1 M CaCl의 1 mL_2,1 M MgSO의 1 mL_4,25 mL의 1 M KH₂PO₄ 버퍼 (모두 이전에 오토 클레이브 되었습니다), 그리고 1 mL의 5 에탄올에 mL.
5. 멸균 환경을 유지하면서 NGM 용액을 60mm 페트리 플레이트에 분배하여 플레이트를 부피의 3분의 2로 채웁니다. 플레이트를 4°C에 보관합니다.
6. 대장균 균배양을 -80°C 글리세롤 스톡으로부터 LB 한천 플레이트 에 줄무늬. 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트에서 자랍니다.
7. 교반과 함께 37°C에서 하룻밤 동안 액체 LB 100 mL을 접종하기 위해 단일 콜로니를 집어 들기.
   참고: 이 변형이 이 시간 동안 고정 단계에 도달할 수 있기 때문에 O.D.를 확인할 필요가 없습니다.
8. 저장된 NGM 플레이트를 제거하고 층류 후드의 뚜껑을 제거하고 플레이트에서 과도한 수분이 증발할 수 있도록 열어 둡니다.
9. 플레이트가 건조되면 파스퇴르 피펫을 사용하여 확산되지 않고 플레이트 중앙에 OP50 대장균 100 μL을 추가합니다.
10. OP50 대장균 잔디를 RT에서 하룻밤 또는 37 °C에서 8 시간 동안 성장하도록 둡니다.
11. 하이포아염소산염 처리 또는 "표백"(섹션 4)에 의해 얻어진 원하는 수의 웜 배아를 추가한다.
    참고 : 웜을 추가하기 전에 RT로 접시를 식힙니다.

4. C 예쁜 꼬마 문화를 동기화하기위한 표백 기술

1. 종자 및 덩어리 벌레를 6cm NGM 접시에.
2. 접시에 계란과 gravid 성인의 충분한 수를 얻기 위해 2-3 일 동안 성장하는 벌레를 둡니다.
3. 계란/성인이 충분하면 M9 5 mL을 접시에 붓습니다.
4. 유리 파이펫을 사용하여 웜을 15 mL 원심 분리관으로 옮김을 옮김.
5. 2,000 x g에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리하고 웜을 펠렛합니다.
6. 웜 펠릿의 교란을 피하고, M9의 대부분을 흡입.
7. 표백 용액 3 mL (NaOH : NaOCl : H₂O의 2 : 1 : 1 비율)을 추가하십시오.
8. 5 분 동안 또는 그대로 성인 웜의 수가 감소 할 때까지 용액을 혼합하기 위해 부드럽게 반전.
   주의: 5분 이상 표백하지 마십시오.
9. 2,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리하고 웜 펠릿을 방해하지 않고 표백 용액의 대부분을 흡입합니다.
10. M9 15 mL을 넣고 잘 섞어보입니다.
11. 원심분리기는 2000 x g에서 1 분 동안 다시.
12. 웜 펠릿을 방해하지 않고 M9의 대부분을 흡입.
13. 4.10-4.12 단계를 한 두 번 더 반복합니다.
14. 신선한 M9 5 mL를 넣고 교반합니다.
15. 달걀이 부드러운 흔들림으로 하룻밤 부화시키십시오.

5. 웜 샘플 준비

1. 표백 절차에 의해 얻어진 N2 배아를 20°C에서 M9 완충체(15 mL 원심분리관에서 5 mL)에서 하룻밤 동안 해치하게 한다.
2. 2,000 x g에서2 분 동안 튜브를 원심 분리하여 동기화 된 L1을 수확하십시오.
3. M9 버퍼 1x로 웜을 세척한 다음 라이브 L1 웜 수를 정량화합니다.
4. OP50 대장균 (이전에 건조)의 1 mL와 NGM 플레이트 (직경 10cm)에 약 10,000 웜을 씨앗.
5. 벌레가 L4 단계에 도달할 때까지 20 °C에서 48 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
6. 15 mL 원심 분리튜브에서 차가운 M9 버퍼를 사용하여 웜을 수확한 다음 1x로 세척한 다음 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다.
7. 2,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리하여 벌레를 펠렛하고, 상류물의 대부분을 제거하고, 액체 질소에 튜브를 담그고, -80 °C에서 저장하십시오.

6. 지질 추출

1. 얼음에 N2에 속하는 냉동 웜 펠릿의 약 100 μL을 해동, 메탄올의 1.3 mL를 추가하고, 4 분 동안 샘플을 초음파 처리.
2. 2.6 mL의 클로로포름과 0.5 M KCl/0.08 M H₃PO_4의 최종 비율을 1:2:1, 1,000 ppb의 내부 표준 1-AG-d_5,및 부틸화된 하이드록시톨루엔을 50 μg/mL의 최종 농도에서 항산화제로서 추가한다.
3. 1 분 동안 샘플을 소용돌이시키고 얼음에 15 분 동안 초음파 수조에서 초음파 처리합니다.
4. 소용돌이 시료를 2x 1분 동안, 원심분리기는 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 상 분리를 유도한다.
5. 하상을 수집하고 깨끗한 튜브에 수집하고 질소 하에서 건조시키고 ACN의 100 μL에서 고체 잔류물을 다시 중단시냅니다.

7. HPLC-MS /MS에 의한 엔도 칸 나비 노이드 분석

1. ESI 삼중 사중극자 질량 분석기와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 선충 샘플에서 2-AG를 검출하고 정량화합니다.
2. 역단계 HPLC에 대해 다음 비율을 사용하십시오: 0.0-0.5분 H₂O:ACN (40:60), 0.5-6.5분 H₂O:ACN (40:60) ~ 6 .5-7.5 분 H₂O:ACN (25:75), 7.5-8.0 분 H₂O:ACN (25:75) ~ (40:60), 8.0-12.0 분 H₂O: ACN (40:60).
3. 40 °C에서 열 온도를 유지하고 자동 샘플러 트레이 온도를 10 °C로 설정합니다.
4. 다음 이온화 조건을 설정합니다: 양이온 모드; 건조 가스_(N2)온도 = 300 °C; 건조 가스 유량 = 10 L / 분; 분무기 압력 = 10 UA; 및 캡. 전압 = 4 kV.
5. 2-AG의 경우 379.2m/z ~ 289.2m/z의 MRM을 사용하십시오. 및 384.2 m/z ~ 289.2 m/z 에 대 한 1-AG-d_5.

8. 벌레의 엔도 칸 나비 노이드 정량화

1. 증식된 내부 표준 1-AG-d_5를 사용하고 분석물의 피크 면적 비를 내부 표준에 계산합니다.
2. 다음 전환을 사용: 384.2 m/z 에 287.2 m/z 2-AG에 대 한; 및 379.2 m/z ~ 287.2 m/z 에 대 한 1-AG-d_5.
3. 내인성 2-AG의 농도를 표준의 농도 값을 사용하여 성태표준의 피크 면적비와 비교하여 계산한다.

결과

동위원소 표지된 아날로그는 3단계 합성 방법을 사용하여 시판되는_{d8-글리세롤}및 아라키돈산으로부터 성공적으로 합성되었다(도2,도 3). 이러한 단계는 간단하며 정교한 장비, 특별히 제어된 조건 또는 값비싼 시약이 필요하지 않습니다. 따라서, 이 방법은 견고하고 다른 지방산을 함유하는 모노아실글리세라이드를 합?...

토론

엔도 칸 나비 노이드는 C. elegans^7에서dauer 형성의 조절에 연루 된 지질의 클래스입니다. 보다 구체적으로, 고도 불포화 지방산의 합성 (PUFAs) 콜레스테롤 인신 매매와 벌레의 생식 발달에 대 한 중요 한. 엔도칸나비노이드를 함유한 아라키돈산인 2-AG가 콜레스테롤 대사를 방해한 벌레의 정상 주기로 다이어 애벌레를 회복시키는 책임이 있는 것으로 밝혀졌습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)