면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

요약

정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.

초록

최근 수십 년 동안, 피하 이식 환자 유래 이종이식 종양 또는 배양된 인간 세포주들은 기존의 확립된 인간 세포보다 면역결핍 마우스에서 인간 암을 연구하는 대표적인 모델로 점점 더 인식되고 있다. 선 체외에서. 최근, 정형병 이식 환자 유래 종양 이종이식(PDX) 모델이 마우스에서 개발되어 환자 종양의 특징을 더 잘 복제할 수 있게 되었다. 간 직교 이종이식 마우스 모델은 종양 생물학 및 약물 치료에 대한 통찰력을 제공하는 유용한 암 연구 플랫폼이 될 것으로 예상됩니다. 그러나, 간 정형종양 이식은 일반적으로 복잡하다. 여기에서 우리는 환자 유래 간 전이성 편한 흑색종 종양의 정형외 이식을 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다. 우리는 인간 간 전이성 포도막 흑색종 세포주를 면역 결핍 마우스로 배양했습니다. 프로토콜은 환자 유래 포도막 흑색종 종양의 덩어리를 가진 외과 정형 외과 이식 기술 또는 배양된 인간 세포주를 가진 바늘 주입 기술을 사용하여 일관되게 높은 기술적인 성공률 귀착될 수 있습니다. 우리는 또한 내부 간 종양을 검출하기 위하여 CT 스캐닝을 위한 프로토콜을 기술하고 재착식을 달성하기 위하여 냉동 보존한 종양을 사용하여 재이식 기술을 위해 기술합니다. 함께, 이러한 프로토콜은 번역 연구에서 간 전이성 편한 흑색종의 간 정형 종양 마우스 모델에 대한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

서문

경막 흑색종은 서쪽 세계에 있는 성인 중 가장 일반적인 안구 악성 종양입니다. 과거 50 년 도중, uveal 흑색종 (백만 당 5.1 케이스)의 부각은 미국에 있는 안정되어 남아 있습니다^1,2. 경막 흑색종은 홍채, 섬모 체 또는 choroid에 있는 melanocytes에서 생기고, 전이가 발전할 때 극단적으로 치명적인 질병입니다. 경막 흑색종 전이를 가진 환자의 사망률은 전이의 초기 진단 후에 2 년에 1 년에 80%이고 92%이었습니다. 전이와 죽음의 진단 사이 시간은 일반적으로 짧은, 미만 6 개월, 치료에 관하여 없이^3,4. 암은 혈액을 통해 퍼지고 간 (89-93 %)^4,5. 효과적인 마우스 모형은 간 전이성 경추 흑색종의 추가 조사를 위해 긴급하게 필요합니다. 번역 연구를 위해, 간 국소화한 전이성 전이성 흑색종 마우스 모형을 생성하는 명확한 수요가 있습니다.

환자 유래 종양 이종이식(PDX) 마우스 모델은 개별화된 의학 전략을 제공할 것으로 예상된다. 이러한 모델은 임상 결과를 예측하고, 전임상 약물 평가에 유용할 수 있으며, 종양의 생물학적 연구에 사용될 수 있다^6. 대표적인 PDX 모형은 피하 사이트에 종양이 있는 ectopically 종양 이식이 친이종 마우스입니다. 대부분의 연구자들은 특별한 연습없이 피하 이식 에 대한 수술을 할 수 있습니다^7,8. 그(것)들은 또한 피하 종양을 쉽게 감시할 수 있습니다. 피하 PDX 모델은 연구 단계에서 인기를 얻었지만 실용화로 전환하는 데 몇 가지 장애물이 있습니다. 피하 이식은 환자 유래 종양이 종양 기원으로부터 다른 미세 환경으로 이식되도록 강제하여 생착 실패 및 느린 종양 ^{성장9,10,11, 12,13,14}. 직교 생착은 원래 종양^15,16과동일한 장기를 사용하기 때문에 PDX 모델에 대해 보다 이상적이고 합리적인 접근법일 수 있다.

최근에는 환자 유래 간 전이성 흑색종 종양 및 바늘 주사 기법을 NOD에서 배양된 인간 간 전이성 흑색종 세포주로 외과 정형외과 이식 기법을 개발했습니다. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스^17,18. 이 프로토콜은 지속적으로 높은 기술적 성공률을 초래합니다. 우리는 또한 내부 간 종양을 검출하는 데 유용한 CT 스캐닝 기술을 확립하고 PDX 플랫폼에서 냉동 보존 종양의 재이식을 개발했습니다. 우리는 경막 흑색종 종양 이종이식 모형이 그들의 조직 병리학및 분자 특징을 포함하여 본래 환자 간 종양의 특성을 유지한다는 것을 것을을 발견했습니다. 함께, 이 기술은 번역 연구에서 경막 흑색종을 위한 간 정형종양 모형을 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

연구 결과에 등록된 환자는 기관 검토 위원회 승인한 프로토콜에 따라 연구 목적 및 유전 연구를 위해 버려진 외과 견본의 사용을 허용하는 서면 동의를 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 국립 보건원의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 신선한 환자 파생 종양 조직의 집합

1. 병원 수술실에서 수술 또는 바늘 생검에서 환자 유래 종양 조직을 가져옵니다.
2. 종양 조직을 행크스의 균형 잡힌 염액(HBSS) 용액을 함유한 100 mL 용기에 얼음 위에 넣습니다.
3. 실험실에서 멸균 후드 (생체 안전 수준 2)로 조직을 옮김.
4. 가능한 한 빨리 2 단계로 진행하십시오.
   참고: 안전상의 이유로 알려진 HIV 또는 B형 간염 또는 C 감염 환자를 제외하십시오.

2. 신선한 환자 유래 종양 조직의 처리

1. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 함유 한 50 mL 튜브에 얼음에 조직을 넣습니다. 티슈세척을 위해 튜브에 PBS를 넣고 튜브에서 PBS를 두 번 버립니다.
2. 얼음에 PBS를 포함하는 페트리 접시에 조직을 전송합니다.
3. 멸균 집게와 가위를 사용하여 조직의 괴사 부분을 제거하십시오. 2.3~2.5단계 동안 조직을 촉촉하고 차갑게 유지하십시오. 바늘 생검 견본을 위해, 단계 2.3 및 2.5를 건너뛰고, 견본을 절단하지 않습니다.
   참고: 괴사 조직은 종종 만질 때 쉽게 분해됩니다.
4. 수술 간 이식을 위해 조직을 1mm³ 큐브로 자릅니다.
5. 나머지 티슈를 페트리 접시에 2mm 큐브로 자른다.
6. 조직학적 분석을 위해 4% 포르말린을 가진 1.7 mm 마이크로튜브로 옮기고 게놈 및 프로테오믹 분석을 위한 다른 튜브로 옮김을 옮김.
7. 액체 질소가있는 액체 질소 항아리에 마이크로 튜브를 넣습니다. 영구 보관을 위해 튜브를 -80°C 냉동고로 옮김.
   참고: 환자와 조직 처리에서 샘플 제거 사이의 시간은 30 분 초과해서는 안됩니다.

3. 환자 유래 종양 조직을 가진 외과 간 이식

1. 70 % 에틸 알코올로 수술을 위해 후드에 들어오는 모든 물체를 스프레이하십시오.
   참고: 여기에는 수술 기구, 난방 패드 및 마취 기계가 포함됩니다.
2. 면봉과 패브릭 시트의 무게를 측정합니다.
3. 유도 챔버에 배치하여 3-5 % 이소플루란 기화기로 마우스를 마취.
4. 마우스가 완전히 마취되면 가열 패드에 척추 위치에 놓습니다. 이소플루란 콘을 마우스 주전자에 놓고 마취 유지를 위해 1.5-3% 이소플루란을 흡입합니다.
   참고: 마우스는 전체 절차 동안 가열 패드에 있어야합니다. 가열부족은 저체온증을 유발할 수 있습니다.
5. 마우스의 발이 초미세 집게로 찔려 있을 때 반응없이 적절한 마취를 확인하십시오.
6. buprenorphine주입 (0.6 mg/kg) 수술 전에 마이크로 주사기에 27 G 바늘을 사용하여 측면에 피하.
7. 복부에 70 % 에틸 알코올을 바르고 모피를 위쪽과 아래쪽으로 퍼뜨리게하십시오. 모피를 퍼낸 후 왼쪽 아래 의 피부의 쉽게 시각화를 확인하여 쉽게 잘라냅니다. 복부에서 털을 면도하지 마십시오.
   참고: 모피는 수술 후 절개 부위를 숨기고 절개 후 수술부위를 긁는 것을 방지합니다. 그러나, 당신은 기관 기준에 따라 절개 부위의 감염을 방지하기 위해 모피를 면도 할 수 있습니다.
8. 요오드를 바르고 피부에 흡수시키세요.
9. 마우스에 2cm 구멍이 있는 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다.
10. 구부러진 초미세 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 곡면 가위로 1cm 가로 왼쪽 하부 피부 절개를 합니다.
11. 절개 피부 아래에 구부러진 가위 끝을 삽입하고 약간 열어 피부에서 각피를 분리합니다. 절개에서 가위를 닫은 블레이드로 철회하십시오.
    참고: 마우스 내부의 가위를 열고 닫으면 손상과 출혈이 발생할 수 있습니다.
12. 각막 아래에 간을 찾습니다. 회막을 통해 진한 붉은 색을 확인합니다.
13. 구부러진 가위를 사용하면 각막에서 1cm 가로 절개를합니다. 후막 동맥이 절삭날에서 출혈하면 즉시 소작으로 출혈을 멈추십시오.
14. 한 손으로 구부러진 초미세 집게를 사용하여 지방 조직을 잡고 왼쪽 간 엽 아래에 면봉의 가장자리를 삽입하고 다른 손으로 면봉을 아래쪽으로 굴려 간을 꺼내십시오.
    참고: 지방 조직을 잡는 것은 면봉에 붙어지방 조직을 유지하는 것이 중요합니다.
15. 면봉에 간을 외부화하고 부직포 흡수 성 직물 시트에 간을 놓습니다.
    참고: 패브릭 시트는 간을 안정시키고 출혈을 흡수하는 데 두 가지 중요한 역할을합니다.
16. 멸균 No. 11 메스 블레이드를 사용하여 폭5mm를 절개하고 면봉으로 절개 부위를 부드럽게 누르면서 실감에 포켓을 형성합니다.
    1. 간 표면과 병렬로 블레이드를 삽입하고 수평으로 잘라.
    2. 면봉으로 절개 부위를 눌러 출혈을 막습니다.
       참고: 그렇지 않으면 당신은 간을 통해 휴식과 간 중간에 큰 혈관을 손상됩니다, 수직 블레이드를 유지하지 마십시오.
17. 면봉을 위쪽으로 굴려 절개 부위를 열고 1mm³ 큐브의 종양 조직을 구부러진 초미세 집게로 주머니에 이식합니다. 면봉을 역회전으로 롤링하고 아래로 누를 때 집게를 철회합니다.
    참고: 집게를 철회하는 동안 면봉으로 절개 부위를 누르면 주머니 내부의 종양 변위를 방지하는 데 도움이됩니다.
18. 이식 후 면봉을 절개 부위에서 부드럽게 제거하십시오. 가능한 한 빨리 3.19 단계로 진행하십시오.
19. 절개 부위에 흡수성 지혈을 넣습니다.
20. 지혈을 확인합니다. 출혈이 계속되면 절개 부위에 더 많은 지혈을 추가하십시오.
21. 패브릭 시트에서 간을 집게 (바람직하게는 무딘 끝)로 껍질을 벗기고 간을 복강으로 다시 넣습니다.
22. 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 이중 합자를 가진 봉합사 복막.
23. 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 삼중 합자를 가진 봉합사 피부.
    참고: 삼중 합자는 외과 절개 dehiscence를 방지하는 것을 돕습니다.
24. 완전히 깨어날 때까지 마우스를 관찰하고 케이지에 다시 넣습니다.
25. 수술 중 출혈 량에 대한 혈액으로 면봉과 직물 시트의 무게를 측정합니다. 수술 전에 원래의 무게와 비교. 수술 중 출혈을 마우스에서 순환 혈액 량의 10% 미만으로 줄입니다.

4. 배양된 인간 간 전이성 흑색종 세포주 수집 및 처리

1. 배양 된 세포를 준비합니다.
2. 셀 카운터를 사용하여 셀을 수집하고 셀 번호를 계산합니다.
3. 15 mL 튜브에서 10.0 x 10⁶ 세포에 대해 적절한 양의 세포 현탁액을 준비합니다.
4. 실온에서 원심분리기에서 튜브를 300 x g에서 5분 간 돌이십시오.
5. 15 mL 튜브에서 상류를 제거합니다. 튜브의 바닥에 세포 펠릿을 둡니다.
6. 1.7 mL 튜브에 RPMI 1640 배지 50 μL을 추가합니다.
7. 팁 개구부를 확대하기 위해 가위로 200 μL 팁의 끝을 잘라냅니다.
8. RPMI가 있는 1.7 mL 튜브에 절단 팁이 있는 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스 60 μL을 추가합니다.
9. 1.7 mL 튜브에 RPMI와 매트릭스를 혼합합니다. 소용돌이.
10. 혼합물의 110 μL을 15 mL 튜브의 세포 펠릿에 넣습니다. 셀 현탁액을 새로운 1.7 mL 튜브로 옮김을 옮김.
11. 바늘 주입 전에 얼음에 튜브를 유지합니다.

5. 간으로 배양 인간 간 전이성 편한 흑색종 세포라인의 외과 바늘 이식

1. 3.1단계부터 3.15단계까지 위의 프로토콜을 따르십시오.
2. 27G 바늘로 마이크로 시링제로 세포 현탁액을 수집합니다.
3. 간 표면을 따라 바늘을 삽입하고 바늘의 끝을 5mm 더 깊게 진행합니다.
4. 간으로 세포 현탁액의 20 μL를 주입하십시오.
5. 주사된 세포가 새는 것을 방지하기 위해 간 삽입 지점을 소작합니다. 지혈을 확인합니다.
6. 3.21단계부터 3.24단계까지 위의 프로토콜을 따르십시오.

6. CT 스캔

1. 깨어 있는 상태에서 절제에 마우스를 놓습니다.
2. 소독 및 혈관 확장을 위해 멸균 알코올 패드로 꼬리를 닦으하십시오.
3. 1 mL 주사기에 27 G 바늘로 꼬리 정맥을 통해 CT 조영제의 100 μL을 주입합니다.
4. CT 스캔을 복용하기 전에 주입 후 4 시간 동안 기다립니다.
   참고: 그것은 걸립니다 4 에이전트간 Kupffer 세포에 의해 채택 될 때까지 시간.
5. 주사 후 4 시간 후, 유도 챔버에 배치하여 3-5 % 기화 이소플루란으로 종양 베어링 마우스를 마취.
6. 마우스가 완전히 마취되면, CT에 경향이 위치에 배치. 마취의 유지 보수를 위해 1.5-3 % 이소플루란을 흡입마우스의 주전자에 이소플루란 콘을 배치합니다.
7. 마우스의 발이 초미세 집게로 찔려 있을 때 반응없이 적절한 마취를 확인하십시오.
8. CT 스캔을 15분 동안 복용하십시오.
9. CT 스캔 후 완전히 깨어날 때까지 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.
10. 종양의 존재를 평가하고 CT 이미지상에서 종양 크기를 측정한다.
    참고: 조영제는 정상 간 실치질을 강화하여 강화되지 않은 종양을 쉽게 인식할 수 있도록 합니다. 담낭과 위를 종양으로 잘못 해석하지 마십시오.

7. 수확 및 가공 조직

1. _CO2를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 검지 손가락과 엄지손가락을 두개골 뒤에 놓고 꼬리의 기저부로 몸을 당겨 자궁 경부 탈구를 하였다. 가능한 한 빨리 7.2 단계로 진행하십시오.
2. 마우스를 척추 위치에 놓고 70 % 에틸 알코올로 복부를 스프레이하십시오.
3. 멸균 집게와 멸균 가위를 사용하여 xiphoid 공정 아래 3cm 가로 절개를 만들어 복부 장기를 노출시십시오.
4. 종양 조직을 소비하고 2.1 ~ 2.2 단계를 수행합니다.
5. 페트리 접시에 종양의 나머지 부분을 2mm 큐브로 잘라.
6. 냉동 보존 후 재이식을 위해 저온 매체가있는 극저온 튜브로 옮김.
7. 이소프로판올로 채워진 극저온 냉동 용기에 튜브를 넣습니다.
8. 임시 보관을 위해 용기를 -80°C 냉동고로 옮김. 저온 중간체가있는 저온 튜브를 액체 질소 탱크에 직접 넣지 마십시오. 종양 조직을 보존하기 위해 -1 °C / min의 냉각 속도로 천천히 얼립니다.
9. 다음 날, 영구 저장을 위해 액체 질소 탱크에 튜브를 전송합니다.

8. 재이식

1. 튜브를 액체 질소 항아리에 액체 질소로 냉동 보관하여 조직을 이식할 준비가 될 때까지 보관하십시오. 실온에 대한 조직의 노출을 최소화하여 생존력을 유지하고 생착 가능성을 높입니다.
2. 37°C 수조에서 냉동 보존 튜브를 해동합니다.
3. 2.2-2.4 단계를 수행합니다.
4. 단계 3.1-3.24에 기재된 바와 같이 해동된 종양을 마우스내로 이식한다.

결과

간 포켓 방법을 이용한 외과정형이식은 인간 간 전이성 흑색종 종양을 마우스 간으로 이식하여 6개월 이내에 80%의 높은 성공률을 기록할 수 있다. 이종이식 종양은 딸 작은혹이없는 독방 종양으로서 간에서 생착합니다(그림 1 및 그림 3A). 마이크로니들을 이용하여 간으로 의한 외과적 정형외과 주사 기법은 모든 경우에 간에서 ...

토론

현재 의 직교 이종이식 모델은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 만드는 데 비용이 많이 듭니다. 간암을 위한 정형외 종양 이종이식 마우스 모델은^19,20,21년 이상 전에 2 년 이상 확립되었다. 그러나 이 기술은 복잡하며 마이크로 니들 홀더 및 6-0 에서 8-0과 같은 특수 장비를 사용해야 합니다. 현미경으로 미세 봉합사. 종양...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent)	Miltenyl Biotec	130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium	Corning	21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver			All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane	Purdue Products	67618-150-17
Isopropanol	Fisher scientific	A416-1	Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC	BD	354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Lab	5557	4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium	Corning	21-031-CM
RPMI 1640	Corning	10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Nice-Pak products	B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	Wako	163-20145
70% Ethyl alcohol solution	Fisher Scientific	04-355-122
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Absorbable hemostat	Johnson and Johnson	63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery	Bovie Medical	MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container	NALGENE	5100-0001
Cryotube	SARSTEDT	72.379
Curved scissors	World Precision Instruments	503247
Curved ultrafine forceps	World Precision Instruments	501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister	Harvard Apparatus	600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer	Artisan Scientific	66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar	Thermo Fisher Scientific	2123
Micro-CT scan	Siemens
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood			Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel	AD Surgical	A300-11-0
Straight forceps	World Precision Instruments	14226
Surgical drape
Tail vein restrainer	Braintree Scientific	TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle	BD	309623
1.7 mL tube	Bioexpress	C-3260-1
5-0 PDO Suture	AD Surgical	S-D518R13
15 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9152N
27 G needle	BD	780301
27 G needle	Hamilton	7803-01
50 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9502N
50 µL micro syringe	BD	80630
50 µL micro syringe	Hamilton	7655-01
100 mL container	Fisher Scientific	12594997
200μL tip