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요약

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

초록

종양 유래 paracrine 신호는 국부적인 면역 억제의 간과된 분대이고 지속적인 암 성장 및 전이를 위한 관대한 환경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라크린 신호는 T 세포의 표면에 PD-1과 직접 상호 작용하는 종양의 표면에 발현된 PD-L1과 같은 상이한 세포 유형 간의 세포 접촉, 또는 면역 세포에 영향을 미치는 종양 세포에 의한 리간드의 분비를 포함할 수 있다. 여기서 우리는 면역 세포(대식세포) 활성화에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 심문하는 공동 배양 방법을 설명한다. 이 간단한 절차는 시판된 0.4 μm 폴리 카보네이트 멤브레인 투과성 지지대 및 표준 조직 배양 판을 이용합니다. 기재된 과정에서, 대식세포는 하부 챔버 내의 상부 챔버 및 종양 세포에서 배양된다. 0.4 μm 장벽의 존재는 두 세포 유형이 파라크린 리간드에 동일한 배지 및 노출을 공유하기 때문에 물리적 접촉의 혼란스러운 변수없이 세포 간 신호의 연구를 허용합니다. 이 접근법은 대식세포(예를 들어, 유전적 녹아웃 마우스로부터의 분리) 또는 종양(예를 들어, CRISPR 매개 변경)의 유전적 변경과 같은 다른 사람들과 결합되어 특정 분비 된 인자 및 수용체의 역할을 연구할 수 있다. 이 접근법은 또한 두 세포 집단을 분리하기 위한 유동 선별없이 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 표준 분자 생물학적 분석에 적합합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)은 유사하게 분비 된 리간드를 측정하여 다중 세포 유형 컨텍스트에서 세포 신호의 동적 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있다. 동시 조절 된 사건의 연구를 위해 공동 배양 기간은 또한 다양 할 수 있습니다. 이 공동 배양 방법은 면역 문맥에서 종양 분비 된 신호의 연구를 용이하게하는 강력한 도구입니다.

서문

최근 연구는 면역 세포에 의한 검출을 피하고, 국소 면역 활성화를 억제하거나, 종양 미세 환경에서 내성 종양 허용 밀리를 생산하는 암세포의 능력에 초점을 맞추고 있다. 종양과 면역 세포 상호 작용의 2개의 넓은 종류는 이 효력을 촉진하는 기술되었습니다: 접촉 중재한 상호 작용 또는 종양 분비 한 리간드. 종양에 의해 이용되는 접촉 매개 면역 억제의 가장 잘 연구되고 임상적으로 견인가능한 메커니즘 중 하나는 그들의 활성화 및 기능을 억제하기 위해 T 세포에 PD-1과 상호 작용하는 PD-L1의 발현이다1,2. 다수의 활성화된 면역 세포에 의해 발현되는 인터페론 감마(IFNγ)에 반응하여, 종양 세포는 PD-L1의 발현을 증가시켜 활성 T 세포를 발현하여, 이를 효과적으로 종양 세포를 근절하지 못하게 한다3. PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 차단하는 항체의 사용은 현재 인간4에서여러 암 유형을 치료하는 데 사용된다. 이러한 임상적 성공 및 기타에 비추어, 종양 유래 면역억제 메커니즘의 식별 및 표적화는 점점 더 주목을 받고 있다.

적응 면역의 억제를 넘어, 종양은 또한 선천적인 면역 세포의 프로 염증 반응을 억제 하는 요인을 분 비 하는 것으로 알려져 있습니다. IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 및 콜로니 자극 인자(CSF-1)를 포함하는 종양 유래 또는 종양 유도 분비물, 종양 미세환경5,6,7에서자연살인자(NK) 세포, 과립구 및 수지상 세포의 항종양 반응을 억제하는 것으로 나타났다. 종양 세포는 또한 종양 미세환경에서 골수성 유래 세포의 모집 및 분화를 왜곡하는 인자를 분비하여 T 세포활성화의억제를 촉진할 수 있다8,9.

종양 진행에 깊은 영향을 미치는 선천적인 면역 세포의 한 종류는 대식 세포입니다. 수년 동안, 종양 관련 대식세포(TAM)의 존재는 환자생존도 10의음성 예후로서 사용되어 왔다. 면역 억제 TAM이 종양의 면역 세포 매개 클리어런스를 약화시키는 개념은 40 년 전에11년 이상 소개되었습니다. 보다 최근에는, 대식세포 프로-염증 반응이 종양 미세환경에서 유도될 수 있는 동안 프로-종양 표현형이 하향 조절될 수 있음을 보여주었다. 이러한 면역억제 대식세포는 내성 반응에 기여할 수 있고, 종양 진행 및 화학요법및면역요법에대한 내성을 유도한다. 대식세포가 종종 종양과 함께 가장 풍부한 백혈구 중 하나라는 점을 감안할 때, 그들의 종양 특이적 면역 활성의 회복은 항암치료제(13)에대한 잠재적인 표적을 나타낸다.

종양 세포와 대식세포 사이의 접촉 매개 상호 작용은 직접 적인 공동 배양을 통해 모델링될 수 있는 동안, 투과성 막 지지체의 사용은 종양 분비 요인이 종양 면역 세포 세포 접촉의 잠재적으로 혼란스러운 영향 없이 면역 조절인 것을 해명할 수 있습니다. 다소 유사한 방법을 사용하여, 그 외는 중피 세포와 종양 세포뿐만 아니라 microglia/neuronal 상호 작용14에서 분비 된 인자를 식별할 수있는 잠재력을 입증했다15. 우리는 또한 LPS 및 인터페론 감마16을이용한 복막 대식세포의 자극 후 염증성 유전자 발현의 억제자로서 종양 분비 단백질, Pros1의 역할을 특성화하기 위해 이 공동 배양 기술을 성공적으로 사용하였다. 여기에서 우리는 종양 분비 요인이 대식세포 활성화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 심문하기 위하여 이용될 수 있는 간단한 방법론을 기술합니다.

프로토콜

유린 복막 대식세포의 수확 및 사용과 관련된 모든 절차는 채플 힐 (UNC)의 노스 캐롤라이나 대학에서 실시되었으며 UNC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 대식세포 문화

참고: 이 절차는 1 차적인 맥기 대식세포 (아래에 자세히 설명함), 골수 유래 대식세포, 또는 J774 (ATCC) 또는 RAW264 (ATCC)와 같은 대식세포 세포주를 이용할 수 있습니다.

  1. 앞서 설명한 바와 같이 배차 후막대식세포(16,17 및 플레이트는 0.4 μm 폴리에스테르 막 삽입의 상부 챔버(들)로 직접 플레이트-배양 6웰 플레이트(도1A).
    참고 : 각 격리에서 대식세포의 대략적인 수율은 총 1 x 106 셀이므로 웰 당 평균 세포 수는 6 개의 웰 플레이트에서 ~ 1.5 - 1.6 x 105 셀입니다.
  2. 37°C에서 3일간 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)/F12, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)에서 수확한대식세포배양.
    참고: 상부 챔버는 배양 배지 1 mL을 포함하고 하부 챔버는 1.5 mL로 채워집니다. 매개체를 각 챔버에 추가해야 합니다.

2. 대식세포가 있는 종양 세포의 공동 배양

  1. 사용하기 전에, ATCC 권장 조직 배양 방법에 따라 그들의 각각 배지에서 시판가능한 종양 세포를 배양한다.
  2. 인산완충식염수(PBS)로 종양 세포를 한 번 세척하고, 0.05% 트립신 + 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 37°C에서 배양한다. 배지를 포함하는 FBS에 있는 세포를 다시 중단하고, 혈세포 계측기 또는 세포 카운터를 사용하여 세포의 총 수를 정량화하고, 그 다음 펠릿에 220 x g에서 5 분 동안 원심분리기.
  3. 원심분리 동안, 대식세포 함유 투과막 지지판의 상부 및 하부 챔버로부터 배지를 흡인하고 신선한 배지로 대체한다.
    1. 종양 세포가 도금될 더 낮은 챔버의 경우, 세포 첨가를 위한 충분한 부피를 허용하기 위해 1.5 mL 대신 배지 1 mL로 채웁니다.
  4. 펠릿 된 종양 세포에서 배지를 흡인하고 DMEM / F12에서 10 % FBS, 1 x 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 3 x 105 세포 / mL의 농도로 20 ng / mL M-CSF로 세포를 재중단시냅니다.
  5. 원하는 웰의 하부 챔버에 3 x 105 세포 / mL 종양 세포의 0.5 mL을 추가하십시오(그림 1B).
    참고 : 세포는 즉시 치료 할 수 있습니다.

3. 공동 배양 세포의 치료

  1. 대식 세포 프로 염증 성 유전자 발현을 유도 하기 위해, 100 ng/mL IFNγ 및 50 ng/mL LPS를 추가 하 여 단일 또는 공동 배양 된 대 식 세포 치료.
    1. 필요에 따라 문화에서 치료 시간의 기간을 변경합니다. 대식세포 활성화는 2시간 이내에 발생하고 일부 종양 매개 억제는 8h. 24h에 대한 공동 배양에 의해 발생하며 견고하고 일관된 종양 유래 억제를 산출한다.
      참고: 대안적으로, 대식세포는 인터류핀-10(IL10)과 같은 인자의 첨가를 통해 프로-상처 치유 표현형을 채택하도록 유도될 수 있고, 종양 분비 리간드의 효과 평가.
  2. 부정적인 통제로, 문화 대식세포는 개별적으로 처리되지 않은 둡니다. 긍정적인 대조군으로, 100 ng/mL IFNγ 및 50 ng/mL LPS로 싱어장배양된 대식세포를 치료하십시오.

4. 공동 배양 세포의 다운스트림 분석

  1. 원하는 배양 시간이 경과한 후, 검사 필요에 따라 세포 가해 또는 컨디셔닝된 배양 배지를 원하는 대로 분리합니다.
  2. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 세포 용해액을 분리하기 위해, 웰의 두 챔버에서 매질을 흡인하고 PBS의 2 mL로 한 번 세척한다. 대식세포가 함유된 상부 챔버에 RNA 라해스 완충장치를 적용한다. 세포를 용해시키기 위해 멤브레인을 부드럽게 긁어 내고 RNA 절연 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 처리를 위해 수집 튜브로 옮김을 전달합니다.

결과

대식세포 편광에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 확인하기 위해, 기재된 절차를 활용하였습니다. 종양 세포의 부재에서 배양된 맥막 대식세포는 음성(치료되지 않은 = 멀리 왼쪽) 및 양성(IFNγ 및 LPS 자극 = 왼쪽으로부터2nd) 대조군(도2A)으로사용하였다. 대안적으로, 맥막 대식세포는 B16F10 흑색종 종양 세포(ATCC)와 공동 배양하였다(도1A). 도금 직...

토론

여기에서 제시된 공동 문화 분석법은 면역 세포 활성화에 종양 분비 요인의 연구를 허용하는 이전에 확립된 분석법의 수정입니다. 세포-세포 접촉은 면역 활동에 있는 변경을 유도하기 위하여 알려지는 동안, 면역 성 활성화를 조절하는 종양 분비 리간드의 기능은 잘 이해되지 않습니다. 우리는 직접적인 공동 배양과는 달리, 종양 유래 분비 요인이 접촉 매개 신호의 혼란스러운 특성 없이 면역 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

에릭 우빌은 부분적으로 미국 암 학회 박사 후 펠로우십 (128770-PF-15-216-01-LIB)에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 NIH(R01-CA205398)의 보조금과 유방암 연구 재단 상(BCRF-18-041)에서 HSE에 수여되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
B16-F10ATCCATCC CRL-6475
cDNA synthesis kitPromegaA3500
DMEM/F12 mediaThermoFisher Scientific- Gibco11320033
Fetal Bovine SerumMilliporeTMS-013-B
J774A.1ATCCATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL5293-2ML
Murine M-CSFProspecCYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific- Gibco15140122
Pros1 ELISAMyBioSourceMBS2886720
RAW264.7ATCCATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγBioLegend575302
Sensimix SYBR Low-ROX kitBiolineQT625-05
Transwell permeable supportsFisher Scientific07-200-170
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific- Gibco25200056

참고문헌

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  18. Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).

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