기능성 자기 나노 입자의 합성, 사이드로포레 페록사민과의 그들의 융합 및 박테리아 검출에 대한 평가

요약

이 작품은 자기 나노 입자의 제조를위한 프로토콜을 설명,_SiO2로코팅, 그 아민 기능화 (3-아미노 프로필) triethoxysilane (APTES) 및 링커로 수치 닐 모니티를 사용하여 deferoxamine와의 그 연상. 모든 중간 나노입자 및 최종 컨쥬게이트에 대한 Y. 장골염을 이용한 깊은 구조적 특성화 설명 및 포획 박테리아 분석법도 상세히 설명한다.

초록

본 작품에서는, 자기 나노입자의 합성, SiO_2로코팅, 그 아민 기능화 (3-aminopropyl)트리에시실레인 (APTES) 및 deferoxamine와의 그 연상, Yersinia 장외 골티카에의해 인식 되는 사이드로포어, succinyl moie를 사용 하 여, atytyer로 설명 된다.

자성 나노입자(Fe_3O4)의자기나노입자(MNP)는 솔보열 방법에 의해 제조되었고, 슈뢰버 공정을 이용하여 SiO_{2(MNP@SiO 2)로}코팅한 후 APTES(MNP@SiO_2@NH2)를이용한 기능화를 하였다. 그런 다음, 페옥사민은 MNP@SiO₂@NH₂@Fa 주는 carbodiimide 커플링에 의해 MNP@SiO 2 @NH_2와 결합되었다.₂ 컨쥬게이트 및 중급자의 형태와 특성은 분말 X선 회절(XRD), 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR), 라만 분광법, X선 광전자 분광법(XPS), 투과 전자 현미경(TEM) 및 에너지 분산X선(EDX) 매핑을 포함한 8가지 방법에 의해 검사되었다. 이 철저한 특성은 컨쥬게이트의 형성을 확인하였다. 마지막으로, 나노입자의 용량과 특이성을 평가하기 위해, 그들은 예시니아 장측균을이용한 포획 박테리아 분석에서 시험되었다.

서문

MNP를 이용한 박테리아 검출 방법은 병원성 박테리아^1에의해 MNP에 공인항체, 애타머, 생체단백질, 탄수화물의 분자 인식에 기초한다. 사이드로포레스가 박테리아의 외부 막에 대한 특정 수용체에 의해 인식된다는 점을 고려하여, 또한 MNP에 연결하여 특이성을 높일 수^{있다 2.} 사이드로포어는 박테리아^3,,4에의한 Fe³⁺ 섭취에 관여하는 작은 유기 분자이다. 박테리아의 포획 및 격리에 대한 평가와 함께 사이드로포어와 MNP 사이의 컨쥬게이트 준비는 아직 보고되지 않았다.

작은 분자를 가진 자기 나노 입자의 접합의 합성에 있는 중요한 단계의 한은 작은 분자가 MNP의 표면에 붙어 있는지 확인하기 위하여 그들 사이 결합 또는 상호 작용의 모형의 선택입니다. 이러한 이유로, 자기 나노 입자와 feroxamine 사이의 공주를 준비하는 절차는 - Yersinia 장측에의해 인식 된 사이드 로포어 -는 카르보디 마이드 화학에 의해 사이드 로포어에 공유 할 수 있도록 MNP의 수정 표면의 생성에 초점을 맞추었기 때문에. 균일한 자석 나노입자(MNP)를 얻고 핵형성 및 크기 조절을 개선하기 위해 벤질 알코올을 가진 솔볼리시스 반응이^5를흔들지 않고 열블록으로 운반되었다. 이어서, 실리카 코팅은 수성 물질^6에서나노입자 현탁액의 보호를 부여하고 안정성을 향상시키는 Stöber 방법에 의해 생성되었다. 페록사민의 구조를 고려하여, 아민 군의 도입은 사이드로포어와 수렴하기 위해 적합한 나노입자(MNP@SiO_2@NH2)를생성할 필요가 있다.₂ 이는 솔리카 변형 나노입자(MNP@SiO_2)의표면에 존재하는 알코올 그룹과 함께 (3-aminopropyl)의 응축(3-aminopropyl)(APTES)에 의해^{달성되었다(7)}

이와 병행하여, 페옥사민 철분(III) 복합체는 수성 용액에서 철 아세틸 아세토네이트를 함유한 시판적으로 이용 가능한 유보사민의 복합화에 의해 제조되었다. NN-succinylferoxamine, 링커 역할을 할 수 지니알 그룹을 베어링, 간결한 anhydride와 feroxamine의 반응에 의해 얻어졌다.

MNP@SiO 2 @NH_2와2 N-succinylferoxamine 사이의 컨쥬게이션은 MNP@SiO N₂@NH_@Fa를 주고 자구시약 벤조트리아졸-1 일 옥시 트리스-(디메스)로 카르보디미드 화학을 통해 수행되었다. N-succinylferoxamine^8에서말단산 군을 활성화하기 위해 부드러운 기본 매체에서 인포늄 헥사플루오로포산염(BOP) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt). N

일단 의원이 특징이 되면, 우리는 야생 형 (WC-A)과 feroxamine 수용체 FoxA (FoxA WC-A 12-8)가 부족한 Y. 장내 콜리티카의 돌연변이를 포착하기 위해 맨손 및 기능화 된 자기 나노 입자의 기능을 평가했습니다. 일반 의원, 기능성 MP 및 @NH_2@NH@NH 컨쥬게이트 MNP@SiO는 각 Y. 장측균 균주와 상호 작용할 수 있었습니다. 박테리아-컨쥬게이트 골재는 자기장의 적용에 의해 박테리아 현탁액으로부터 분리되었다. 분리된 골재는 인산염 완충식식염수(PBS)로 두 번 헹구고, PBS에서 재중단되어 직렬 희석을 준비한 다음, 식민지 계수를 위해 도금되었다. 본 프로토콜은 MNP@SiO₂@NH@Fa 합성의 각 단계를 보여 주며, 모든 중급체 및 컨쥬게이트의 구조적 특성화, 그리고 중간체와 관련하여 공주물의 특이성을 평가하기 쉬운 방법으로 박테리아 포획 분석법. ⁹

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프로토콜

참고: 불활성 대기 조건하에서 수행된 반응의 경우, 모든 유리 제품은 이전에 65°C의 오븐에서 건조되어 고무 중격으로 밀봉되어 아르곤으로 세 번 제거되었습니다.

1. 발효민으로 컨쥬커드된 자기 나노 입자의 합성

1. Fe₃O₄ 자기 나노 입자의 합성 (MVP)
   1. 20mL 유리 바이알에 Fe(acac)₃ g를 넣고 10mL의 벤질 알코올과 섞습니다.
   2. 이 혼합물을 2 분 동안 초음파 처리 한 다음 가열 블록으로 옮기고 72 h의 180 °C에서 가열합니다.
   3. 반응이 완료된 후, 바이알이 냉각되도록 허용하고, 나노입자를 96% 에탄올과 원심분리기로 30분 동안 4000 x g로 헹구십시오.
   4. 네오디뮴(NdFeB) 자석을 이용하여 자기 어트랙션에 의해 나노입자를 상체로부터 분리하고 잔류 용매를 폐기한다.
   5. 96%의 에탄올 반복 단계 1.1.4로 헹구세요. 용매가 명확해 보일 때까지 40kHz에서 1 분 동안 욕조에서 초음파 처리로 번갈아 버리는 슈퍼 네티얼을 폐기하십시오.
2. 자기 나노 입자 SiO₂ 코팅 (MNP@SiO₂₎
   1. 이소프로판올 80mL에서 MNP 2g의 서스펜션을 준비한 다음 암모니아 21%, 증류수 7.5mL, 테트라에틸 오도실리케이트(TEOS) 0.56mL(이 순서)의 4mL를 마그네틱 스터드 바가 있는 라운드 하단 플라스크에 넣습니다.
   2. 혼합물을 40°C에서 연속 교반으로 2시간 동안 가열한 다음 1시간 동안 초음파 처리합니다.
   3. MNP를 자석으로 분리하고, 상체를 버리고, 이소프로판올30mL로 분산한다.
   4. 1.2.1 단계를 반복합니다. 및 1.2.2.
   5. 모든 재료를 복구하기 위해 96 % 에탄올로 마그네틱 스터드 바를 제거하고 씻으시면됩니다.
   6. 자석을 사용하여 자기 어트랙션에 의해 상부에서 나노 입자를 분리합니다.
   7. Discard the supernatant and rinse the nanoparticles with 96% ethanol three times alternating with sonication.
   8. 12 시간 동안 실온에서 진공 상태에서 나노 입자를 건조시킵니다.
3. MNP@SiO_2와 (3-아미노프로필) 트리에톡시실레인(APTES)의 기능화
   1. 린스 500 mg의 MNP@SiO_2는 N, N-디메틸포르마미드(DMF)를 불활성 대기하에서 이전 단계에서 얻은 다음 40kHz에서 1분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 상체를 버리고이 과정을 세 번 반복하십시오.
   2. 마그네틱 스터드 바로 교반하는 아래 둥근 바닥 플라스크에서 입자를 다시 중단하고 9mL의 APTES를 추가합니다.
   3. 혼합물을 60°C에서 12시간 동안 저어줍니다.
   4. Discard the supernatant and rinse the nanoparticles with 96% ethanol three times alternating with sonication.
4. 페록사민합성
   1. 100 mg (0.15 mmol)의 deferoxamine 메실레이트 소금과 53.0 mg (0.15 mmol)의 Fe (acac)_3에서 증류수 5 mL를 녹여 실온에서 밤새 혼합물을 저어줍니다.
   2. 분리 깔때기에 EtOAc20mL로 생성물을 3회 세척한 다음, 회전 증발기를 사용하여 진공 상태에서 유기 용매를 제거합니다.
   3. 붉은 고체로 페록사민을 감당하기 위해 수성 위를 동결건조.
5. N-수치닐페로사민 합성 N
   1. 350 mg (3.50 mmol)의 수치 안수화물을 100 mg (0.17 mmol)의 용액에 추가하여 5mL 의 피리딘 5 mL에서 불활성 분위기에서 피리딘의 5 mL에 용액을 넣습니다.
   2. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 저어줍니다. 그 후, 어두운 빨간색 고체를 제공하기 위해 회전 증발기에서 감소 압력에서 피리딘의 과잉을 제거합니다.
   3. 메탄올의 3mL에 반응 조수를 녹입니다.
   4. 메탄올릭 용액을 세바덱스 컬럼(직경 20mm 컬럼에서 세바덱스 20cm)으로 옮기고 0.5mL/min의 엘루트로 옮킨다.
   5. 적색 분획을 수집하고 회전 증발기로 진공 상태에서 메탄올을 제거합니다.
6. 2_@NH@FaMNP@SiO 공자의 합성
   1. 건조 MNP@SiO 30 mg의 건조 MNP@SiO 2 @NH₂@NH_DMF로 두 번 헹구고 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 나노 입자를 30 분 동안 불활성 분위기에서 초음파 처리합니다.
   2. N-succinylferoxamine의 용액을 준비 (200 mg, 0.30 mmol), 벤조트리아졸-1-yl 옥시 트리스-(디메틸아미노)-인포늄 헥사플루오로포산염(BOP), 173 mg, 0.45 mmol), 1 하이드록시 벤조트리아졸 (HOBt, 46 mg, 0.39 mmol) 및 N N,N- 이소 프로필틸레틸레틸라민 (DIPEA, 128.8 mg, 1.21 mmol) DMF (믹스 A) 50 mL 에서 50 mL 의 바닥.
   3. 아르곤 가스 대기(Mix B)를 이용하여 산소가 없는 조건에서 건조한 환경에서 소닉하에서 DMF의 3mL에서₂ 이전에 헹구는 MNP@SiO_2@NH2를 일시 중단한다.
   4. 믹스 A를 추가하여 B 를 드롭와이즈로 섞습니다.
   5. 밤새 실온에서 궤도 셰이커를 사용하여 최종 혼합물을 흔들어.
   6. 생성된 컨쥬게이트(MNP@SiO_2@NH@Fa)를자석을 사용하여 현탁액과 분리합니다.
   7. 생성된 고체를 헹구고 10mL의 에탄올로 5번 초음파 처리합니다.
   8. 24 시간 동안 진공 상태에서 고체를 건조.

2. 나노 입자와 병원성 박테리아의 캡처를 정량화하는 Y. 장측균 균주를 가진 세균 분석

1. 멸균 2 mL 튜브에서 1 mg/mL에서 PBS의 모든 중간 나노 입자 및 최종 컨쥬게이트의 현탁액을 준비합니다.
2. 37°C에서 하룻밤 동안 배양하는 루리아 베르타니(LB) 국물 5mL에서 Y. 엔테로콜리티카의 배양을 준비한다.
3. 10mM MM 2,2′-bipyridyl의 50 μL을 추가하여 5mL의 철 결핍 트립틱 대두 국물(TSB)을 준비하십시오.
4. 5mL의 철 결핍 TSB를 Y. 엔테로콜리티카의 하룻밤 배양의 50 μL로 접종한 다음, OD₆₀₀ = 0.5\u20120.8까지 교반으로 37°C에서 배양한다.
5. 단계 2.4에서 얻은 배양의 100 μL을 취하고 PBS의 900 μL을 포함하는 2.0 mL 튜브에서 희석하여 첫 1/10 희석을 얻습니다. 이어서, 동일한 절차를 이용하여 제1 희석으로부터 1/100 희석을 제조하여 약 1 x 10⁶ 콜로니 성형 유닛(CFU)/mL에서 세균 세포의 농도를 얻을 수 있다.
6. 2.0mL 튜브에 세균 현탁액의 1/100 희석의 1 mg/mL에 1 mg/mL에 100 μL을 추가하고, 소용돌이로 균질화한다.
7. 1 h에 대한 20 °C에서 배양 배양.
8. 자석을 사용하여 MNP/박테리아 응집체를 분리하고 상체를 조심스럽게 폐기하십시오.
9. 분과를 사용하여 분리된 나노 입자를 1mL PBS로 두 번 헹구는다.
10. CFU/mL에서 세균 포획량을 계산하기 위해 PBS의 1mL에서 나노 입자를 중단합니다.
11. 1 x 10^-4 희석에 도달 할 때까지 이전 서스펜션에서 4 연속 1/10 희석을 준비합니다.
12. 각 희석의 10 μL을 TS 한천 판에 플레이트하고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다.
13. 에피 화이트 모드에서 젤 디지털라이저로 접시를 촬영합니다. 개별 콜로니 수를 계산하기 위해 자리를 증폭하기 위해 적절한 소프트웨어로 이미지를 처리합니다.
    참고: 각 MNP 중급은 합성의 진행 상황을 후속하는 것이 특징이었다. 첫째, 맨손 의원은 결정 구조를 확인하기 위해 XRD에 의해 연구되었다. 이어서, 각 중간체의 FT-IR 스펙트럼은 해당 반응에서 발생한 변화를 확인하기 위해 실행되었다. 각 중간체의 라만 분광분석은 FT-IR 스펙트럼에서 추론된 결론을 확인하기 위해 수행되었다. TGA 분석을 통해 유기물질을 베어링하는 중급자의 손실 중량을 추정할 수 있었습니다. 각 중간체의 형태와 크기는 TEM에 의해 연구되었다. 마지막으로, XPS 분석은 각 MNP 중간 표면에서 원자 산화 상태를 결정하고 공주 MNP@SiO₂@NH@Fa 공유 결합 형성을 확인하는 데 중요했다.

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결과

각 중간 및 최종 컨쥬게이트의 형태와 특성을 결정하기 위해 철저한 구조적 특성화가 수행됩니다. 이를 위해 XRD, FT-IR, 라만 분광법, TGA, TEM, EDX 매핑 및 XPS 기술이 컨쥬게이트의 형성을 입증하기 위해 사용된다. X선 광전자 분광법(XPS)에 의해 획득한 나노입자 표면의 원자의 산화 상태는 나노입자와 사이드로포어 사이의 공유 결합의 형성을 확인하는 가장 관련성이 높은 데이터이다. 이러한 결과와 ...

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토론

이 프로토콜은 자기 나노 입자와 공유 결합에 의한 사이드로포레 페록사민 사이의 공주체의 합성을 설명합니다. 자성의 합성은 피나 외^5에 의해 보고된 프로토콜을 이용하여 수행되었고, 실리카 코팅을 거쳐 수성 시스템에서 부식의 자기 코어를 보호하고, 응집을 최소화하고^{기능화6에}적합한 표면을 제공한다. 실리카 코팅 공정이 수정되었습니다. Li et

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578