폐내 면역 세포와 혈관 내 면역 세포 집단의 구별: 경정맥 내 접근법

요약

현재 연구의 목적은 폐 염증 연구에서 혈관 내 면역 세포와 실질 내 면역 세포를 구별하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 우리는 폐 적출 전에 형광 태그가 붙은 항체를 경정맥 내 주사합니다. 또한, 우리는 인플레이션에 기반한 폐 소화 과정을 사용하여 폐에서 백혈구의 수율을 개선합니다.

초록

일주기 리듬은 24시간 주기로 발생하는 다양한 생물학적 과정의 진동을 나타냅니다. 분자 수준에서 이러한 리듬은 핵심 시계 유전자의 TTFL(transcriptional-translational feedback loops)의 웹으로 구성됩니다. 면역계를 포함한 개별 조직과 장기 시스템에는 자체 시계가 있습니다. 전신 순환에서 CD45⁺ 개체군의 다양한 구성원은 하루 종일 진동합니다. 그러나 이러한 리듬의 대부분은 조직에 상주하는 CD45⁺ 백혈구 집단에서 동일하지 않거나 유사하지 않습니다. 폐 염증의 일주기 조절의 역할을 연구할 때 폐 내 CD45⁺ 를 조사해야 할 수 있습니다. 그러나 최적화된 관류 방법에도 불구하고 순환에서 갇힌 백혈구는 폐에 남아 있습니다. 이 프로토콜을 설계하는 목적은 혈관 내 백혈구와 실질 내 백혈구를 구별하는 것이었습니다. 이를 위해 쥐는 폐 채취 직전에 형광 태그가 지정된 CD45 항체를 주정맥 주사합니다. 그 후, 폐는 맞춤형 폐 소화 기술을 사용하여 소화되어 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 샘플은 실질내 면역 세포(다른 CD45 항체 포함)에 대한 일반 항체 패널에 대해 염색됩니다. 유세포 분석은 개체군에 대한 명확한 설명을 보여줍니다. 따라서 폐내 CD45⁺ 세포를 라벨링하고 정의하는 방법은 폐내 및 순환 면역 세포의 거동이 수치적으로나 기능적으로 구별되는 경우 특히 중요합니다.

서문

여기에서는 혈관 내 백혈구와 폐 백혈구를 구별하는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 최고의 관류 기술을 사용하더라도 연구에 따르면 혈액 순환으로 인한 잔류 CD45⁺ 가 폐에 남아 있는 것으로 나타났습니다. 이것은 순환계와 폐의 리듬을 구별하는 능력을 손상시킵니다. 이 효과는 폐 염증의 경우 더욱 증폭됩니다. 이것은 특히 염증의 일주기 조절에 대한 연구와 관련이 있습니다.

일주기 리듬은 24시간 동안 발생하는 다양한 생물학적 과정의 일주일 진동을 나타냅니다. 일주기 시스템은 감염 위협과 같은 환경 변화에 직면할 때 숙주를 보호하는 진화적으로 보존된 예측 메커니즘입니다. 세포 수준에서 시계는 핵심 시계 유전자¹을 구성하는 자체 유지 전사-번역 피드백 루프로 구성됩니다. 면역 체계는 병원체와 염증성 모욕에 대한 반응에 영향을 미치는 자체 시계를 가지고 있습니다 ^2,3. 환경에 지속적으로 노출되는 기관으로서 일주기 리듬은 폐에서 특히 중요합니다⁴. 폐의 다양한 면역 과정은 시계의 통제를 받습니다 ^5,6,7. 그러나 폐의 다양한 생물학적 과정과 전신 순환의 단계는 동일하지 않으며,⁸ 이는 더 나아가 폐에서 백혈구의 진동과 순환이 동일하지 않을 수 있음을 시사합니다. 따라서 폐 백혈구와 혈관 내 백혈구를 효율적으로 구별할 수 있는 방법을 갖는 것은 일주기 맥락에서 매우 중요합니다.

이 연구의 목적은 혈관내 백혈구와 실질내 백혈구를 안정적으로 구별할 수 있는 방법을 고안하는 것이었습니다. 이를 위해 혈관 내 백혈구 라벨링과 폐 소화 방법을 사용했습니다. 혈관 내 백혈구 표지를 위해 우리는 큰 혈관을 표적으로 하고 모든 균주와 크기의 마우스에서 재현 가능하게 사용할 수 있는 경정맥 내 주사를 사용합니다. 다른 많은 방법들은 꼬리 정맥 주사 ^9,10을 사용했는데, 이는 Bl6 마우스에서 수행하기 어려운 것으로 악명이 높습니다¹¹. 경정맥내 주사는 마취를 필요로 하며 해부 현미경 또는 확대경을 사용한 직접 시각화 하에서 가장 잘 수행됩니다. 따라서, 경정맥 내 주사의 용이성과 신뢰성은 마취 및 특수 장비의 필요성과 비교되어야 합니다. 그러나 대부분의 연구실에서 이러한 장비를 즉시 사용할 수 있다는 점을 감안할 때 이것이 제한 요인으로 간주되지 않습니다. 그러나 사례별로 고려하는 것이 현명해 보입니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 펜실베니아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드의 규정을 충족했습니다.

참고: 전체 과정은 1) CD45 정맥 내 라벨링, 2) 수확, 3) 분해, 4) 염색 및 유세포 분석으로 나눌 수 있습니다. 이러한 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다.

1. 용액/시약 준비

1. 500mL의 DMEM에 2mM L-글루타민 5mL, 소 태아 혈청(FBS) 20mL, 2-메르캅토에탄올 1mL, 펜/스트렙 10mL를 첨가하여 해리 배지를 준비합니다.
   참고: 해리 매체는 2-4°C에서 보관할 때 최대 2개월 동안 안정적입니다.
2. 마그네슘이나 칼슘이 없는 PBS 500mL에 FBS 10mL와 아지드화나트륨 500mg을 첨가하여 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 완충액을 준비합니다.
   참고 : 아지드 나트륨을 첨가하면 FACS 버퍼를 2-4 °C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
3. 시료 채취 당일에 DNase 및 Liberase 용액을 1:100 희석으로 Dissociation Media에 추가합니다(즉, Dissociation Media 1mL당 10μL의 DNase 및 Liverase 추가).
   참고: 각 마우스에 대해 전체 폐를 소화하려면 10mL/마우스가 필요하고 폐의 절반을 소화하려면 5mL가 필요합니다.

2. CD45 정맥 주사 라벨링

1. 이 실험에는 8-12주 된 성체 C57Bl6 마우스를 사용합니다.
2. 선택한 약제로 마우스를 마취합니다. 이러한 목적으로 자일라진과 케타민의 조합이 사용되었지만, 다른 제제도 사용할 수 있습니다. 목표는 약 5-10분 동안 지속되는 중간 수준에서 깊은 수준의 마취를 받는 것입니다.
   참고: 자일라진과 케타민 마취 혼합물은 복강내로 투여됩니다. 자일라진 10-15mg/kg과 케타민 120-150mg/kg을 사용하십시오.
3. 페달 반사가 음수가 되면 동물을 등에 눕히고 팔다리를 부드럽게 테이프로 감아 머리가 가능한 한 중앙에 있도록 합니다.
4. 집게로 피부를 들어 올리고 날카로운 수술 용 가위로 잘라 경정맥과 가슴 근육을 노출시킵니다.
5. 28G 바늘을 사용하여 200μL의 항-CD45 항체(유세포 분석 등급 항체, PBS에서 1:300으로 희석)를 경정맥에 주입합니다. 항체가 혈관 구조 전체를 순환할 수 있도록 2-4분 정도 기다립니다.
   참고: 얕은 각도에서 가슴 근육을 통해 경정맥으로 들어가면 상당한 출혈이 발생하는 것을 방지할 수 있습니다.
6. 그 후 10분 동안 CO₂ 에 노출되어 동물을 안락사시킵니다. 폐 관류를 진행하고 폐 및 기타 조직을 채취합니다.
   참고: 동물 안락사에 대한 AVMA 지침을 준수하는 다른 인도적 안락사 방법도 허용됩니다.

3. 해부/수확(그림 1)

1. 동물을 평평한 보드에 등을 대고 놓고 머리를 중앙에 유지하면서 발을 아래로 고정합니다.
2. 몸에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게와 가위로 흉강을 열어 폐, 심장, 기관을 노출시킵니다.
3. 심장의 좌심실을 작게 절개하고 우심실을 통해 10mL의 차가운 PBS를 주입하여 폐를 관류합니다.
4. 기관의 구멍을 잘라내고 정맥 캐뉼라를 삽입합니다. 캐뉼라가 들어가면 기관 아래에 약 6-8cm 길이의 봉합사 줄을 통과시키고 캐뉼라에 두 번 묶습니다.
5. 수술용 끈을 캐뉼라에 밀어 넣고 그림 1B와 같이 해리 매체(폐 절반의 경우 5mL 또는 폐 전체의 경우 10mL)가 들어 있는 주사기를 부착합니다.
6. 몸의 나머지 부분에서 폐를 부드럽게 잘라내고 폐가 부착된 주사기를 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.

4. 단일 세포 현탁액에 대한 소화

1. 37°C에서 30-40분 동안 폐를 배양하고 5분마다 1mL(폐의 절반) 또는 2mL(폐 전체)의 해리 매체를 주입합니다.
2. 모든 배지가 주입되면 주사기와 캐뉼라를 제거하고 50mL 원뿔형 튜브를 180rpm의 진탕 수조에 넣어 나머지 배양 기간 동안 더 나은 수율을 얻습니다.
   참고: 또는 5분마다 튜브를 수동으로 흔들 수 있습니다.
3. PBS 10mL를 넣고 1분 동안 세게 흔들어 반응을 멈춥니다.
4. 용액을 셀 스트레이너(70μm)를 통해 새로운 50mL 코니컬 튜브에 넣습니다. 5mL 주사기 고무 마개를 사용하여 조직 덩어리를 여과기로 통과시킵니다. 최종 부피가 30mL가 되도록 PBS를 추가합니다.
5. 1,200 x g 및 4 °C에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오. 남아 있는 용액을 피펫으로 빼냅니다.
6. 적혈구(RBC) 용해 완충액 1mL를 추가하고 피펫팅으로 세포 펠릿과 혼합합니다.
7. 실온에서 60-90초 동안 배양합니다. 반응을 중지하기 위해 최종 부피가 30mL가 되도록 PBS를 추가합니다.
   알림: 배양 시간은 세포 펠릿에 있는 혈액의 양에 따라 다릅니다. 세포 펠릿이 붉을수록 배양 시간이 길어집니다.
8. 1,200 x g 및 4 °C에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오. 남아 있는 용액을 피펫으로 빼냅니다.
9. 세포 펠렛에 1mL의 FAC 완충액을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

5. 유세포 분석을 위한 염색 세포

1. 세포 계수기를 사용하여 세포 현탁액의 총 세포 수를 확인합니다.
2. 세포 현탁액을 라벨링된 각 FACS 튜브로 옮겨 샘플당 총 3 x 10⁶ 개의 세포가 있도록 합니다.
3. Fc 블록(1:100 희석)을 넣고 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
4. 튜브를 1,200 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오.
5. 지정된 항체 혼합물로 샘플을 염색하고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다(즉, 알루미늄 호일로 덮어). 배양 중간에 튜브 홀더에 튜브를 랙에 올려 혼합합니다.
6. FACS 완충액 1mL를 추가하여 세척하고 피펫팅으로 혼합합니다.
7. 35μm 스트레이너를 통해 현탁액을 천천히 피펫팅하여 세포 현탁액을 다른 FACS 튜브로 옮깁니다.
8. 튜브를 1,200 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오.
9. 150μL의 FACS 완충액을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
10. 샘플을 실행하기 직전에 각 튜브에 10μL의 DAPI(1:100)를 추가합니다.
    참고: 이제 샘플을 유세포 분석기에서 실행할 준비가 되었습니다.

결과

이 기술을 사용하여 나이브 해리된 폐의 총 세포 수(대표 데이터에는 왼쪽 엽만 사용됨)는 27.3 x 10⁶ 에서 71.1 x 10⁶ cells/mL 사이였습니다. 크기에 대한 게이팅과 이중선과 사세포를 게이팅한 후( 그림 2의 게이팅 방식) 백혈구 수는 6.9 x 10⁶ 에서 13.5 x 10⁶ cells/mL 사이였습니다. 폐를 청소하기 위해 관류한 후에도 갇혀 있는 ?...

토론

폐 염증 및 폐 면역 반응에 대한 신중한 연구는 많은 질병 상태를 이해하는 데 매우 중요합니다. 유세포 분석은 폐 백혈구에 대한 기능적 관련성을 열거하고 부여하는 데 일상적으로 사용됩니다. 백혈구의 기능은 적어도 부분적으로는 백혈구가 발견되는 위치에 달려 있습니다. 완벽한 관류 프로토콜 후에도 많은 혈관 내 백혈구가 폐에 잔존한다는 것을 뒷받침하는 축적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boekel Scientific Medium Water Bath	Boekel Grant Scientific	290200
10 mL BD Syringes with BD Luer-Lok Tip	BD Biosciences	309604
5 mL BD Syringes with BD Luer-Lok Tip	BD Biosciences	309646
Anti-CD45- Pac Blue	Biolegend	103114
Anti-CD45- Pe/Cy7	Biolegend	103114
Cell strainer 70 µm Nylon	Fisher	352350
Corning Conical-Bottom Centrifuge Tube 50 mL	Avantor	21008-714
Corning Falcon Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	EMSCO	10004637
Dissection Microscope	Olympus	SZX-SDO2
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965084
Dnase	Roche	10104159001
DPBS without Ca++ & Mg++		14190136
Fc Block	Biolegend	101320
HyClone Fetal Bovine Serum	GE Healthcare	SH30071.03
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030-081
Liberase Research Grade	Sigma	5401127001
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122
Precision Shaking Water Bath	Thermo Fisher	TSSWB15
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma	R7757
Suture Silk 4-0	Roboz	SUT-15-2