JoVE Logo
저자
연락처

로그인

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

초록

미토콘드리아 역학은 세포기관의 다양한 기능과 세포 반응에 필수적입니다. 혼잡하고 공간적으로 복잡한 미토콘드리아 멤브레인은 규제 요인을 구별하는 어려운 환경입니다. 단백질과 지질 성분의 실험적 제어는 규제의 특정 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이러한 요인의 정량적 조작은 세포 분석에서 어렵습니다. 미토콘드리아 내막 융합의 분자 메커니즘을 조사하기 위해 미토콘드리아 내막의 지질 환경을 모방한 체외 재구성 플랫폼을 도입했습니다. 여기에서 우리는 지질 이중층을 준비하고 미토콘드리아 막 단백질을 재구성하기 위한 상세한 단계를 설명합니다. 이 플랫폼은 미토콘드리아 내막 융합및 개별 전이를 위한 운동학의 중간체분석을 정량적 방식으로 분석할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 비대칭 지질 조성을 가진 이중층의 제조를 설명하고 완충된 양층으로 막음 단백질을 재구성하기위한 일반적인 고려 사항을 설명합니다. 이 방법은 다른 멤브레인 시스템을 연구하기 위해 적용될 수 있다.

서문

막 구획화는 진핵 세포 1(도 1A)의특징입니다.1 생물학적 멤브레인은 2차원 용매 이상으로 점점 더 인식되고 있으며, 단백질 기능 및 거시 분자 복합 조립2,,3을조절하는 데 중요한 역할을 하는 환경으로 간주됩니다. 네이티브 지질은 막 단백질 활성3,,4를조절하는 리간드입니다. 멤브레인 공간 조직과 다양한 모양으로 조각되는 멤브레인의 능력은 새로운 함수3,,5를선택하는 데 중요한 물리적 특성입니다.

모델 멤브레인 플랫폼은 세포막 구조, 역학 및,기능6,7,78을이해하는 데 도움이 되는 생체 모방 시스템입니다. 모델 멤브레인은 전형적으로 정의된 생체 물리학적 특성(강성, 두께 및 탄력)을 가진 잘 정의된 조성물의 지질 혼합물을 포함한다. 형광 이미징에 결합된 모델 멤브레인 플랫폼은 멤브레인 구조 및 기능9,,10,,11의정량적 분석을 허용합니다. 지질 이중층 재구성 전략은 SNARE 매개 막 융합9,,10,DNA 매개 막 융합12,바이러스 융합11,,13을연구하기 위해 사용되어 왔다. 이러한 방법의 장점은 관찰 가능한 반응이벤트(14)에앞서 중간 단계에 대한 운동 정보를 얻을 수 있는 가능성이있다.

플라즈마 멤브레인은 모델 멤브레인을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다. 지질상 분리를 갖는 쌍층은 세포 신호11,,15,,16에서중요한 지질 뗏목 구조를 연구하기 위해 개발되었다. 마이크로패턴 지질 평면 이중층17,,18세포 수용체의 조직을 조사하는 데 사용되어 왔다. 중합체 또는 겔 지원 멤브레인은 막 세포골격 조직을 연구하기 위해 생체 모방 시스템으로 사용되어 왔으며, 세포 신호 화 시 막 단백질 분할, 세포-세포접촉(19)에서의이주로 사용되었다.

인공 멤브레인 시스템은 또한 세포 외 세포 세포기관을 연구하기 위해 적용되고있다(20). 소기관은 고유한 하위 환경을 만드는 특징적인 형태를 특징으로 합니다. 내풍술 망막(ER) 네트워크는 한 가지 예입니다. 리포솜으로 망상을 재구성하면 세포 ER과 유사한 특성을 가진 관 막 구조가형성된다 21. ER 융합 단백질인 아틀라스틴을 첨가하면 리포솜으로부터 지질 튜블러를 유도하여네트워크(20)를형성할 수 있다. 이것은 proteoliposomes가 세포구 형태학 및 역학에 대한 기능적 통찰력을 제공하는 방법에 대한 한 가지 예입니다.

미토콘드리아 막 융합 및 핵분열은 미토콘드리아 인구22,,23,,24,,25의건강에 필수적이다. 다이너마이가족 GTPases세트는 미토콘드리아 막 융합을 촉매합니다. Mfn 1/2는 외부 막 융합을 촉매합니다. Opa1은 내부 막융합(26)을 중재한다(도1B). Opa1은 두 가지 형태를 가지고 있습니다: 긴 형태 (l-Opa1), 미토콘드리아 내막에 고정된 막 막, 및 막 간 공간에 존재하는 '용해성' 짧은 형태 (s-Opa1)가 있습니다. 두 Opa1 형태의 비율은 두 프로테아제, Oma1 및 Yme1L27,,28,,29,,30의활성에 의해 조절된다. Opa1 규정의 중요한 질문은 다음과 같습니다 : Opa1의 두 가지 형태, (짧고 긴) 중도 막 융합 및 규제 상호 작용28,,29,,31,,32,,33.

여기서 우리는 성공적으로 내부 막 융합에서 l-와 s-Opa1의 역할을 명확히 미토콘드리아 내부 막 융합을 조사하기 위해 적용 된 재구성 전략을 설명합니다. 우리는 폴리머 테더지질 바이레이어와 200 nm unilamellar 소포를 사용하여 미토콘드리아 내막을 모방하는 플랫폼을 개발했습니다. 지질 이중층 아래에 있는 폴리머 밧줄의 이점은 다음을 포함한다. 첫째, 재구성된 막 단백질을 보존하며, 이는 유리슬라이드(34)에근접하여 중단될 수 있다. 둘째, 지질 이중층과 유리 기판 사이의 두꺼운 물층을 제공하며, 이는 공공 개방9의연구를 용이하게 하며, 제3페 폴리머의 점탄성 특성으로 막 곡률변화(35)를허용한다. 우리는 멤브레인 융합(도 1C-F)의단계를 특성화하기 위해 3 색 형광 이미징을 사용했습니다.

figure-introduction-3577
그림 1: 미토콘드리아 막 융합 모니터링.
(A)세포기관은 세포막 구획이다. (B)미토콘드리아 막 융합의 순차적 단계. 미토콘드리아의 외부 막의 융합은 Mfn1 및/또는 Mfn2에 의해 촉매화되고, 내막 융합은 Opa1에 의해 중재된다. (C-F) 미토콘드리아 막 융합을 연구하기 위해 체외 재구성 플랫폼의 회로도. 이 플랫폼에는 프로테오올리포솜과 폴리머 테더드 지질 이중레이어, 재구성된 l-Opa1의 두 가지 부분이 포함되어 있습니다. 두 개의 다른 형광막 염료와 함량 마커를 포함한 형광 라벨은 멤브레인 융합 중 단계를 구별하는 데 도움이됩니다. 두 개의 멤브레인 마커 (Cy5-PE (빨간색) 및 텍사스레드 PE (주황색)는 가까운 멤브레인 도킹에 대해보고 할 수있는 FRET 쌍을 만듭니다. proteoliposome 라벨 텍사스Red-PE의 확산은 지질 디믹싱의 지표입니다 (혈류). 콘텐츠 릴리스는 칼신 신호의 해수를 통해 모니터링됩니다(녹색으로 표시됨). 바이오렌더를 사용하여 만든 패널 A와 B. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

1. 지질 혼합물의 준비

  1. 1,2-디오레오틸-센-글리페로-3포스포콜린(DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-센-글리케로-3-인포에탄올라민(교황), L-α-포스파디글리노이톨(간 PI), 카디오리핀, 카디오리핀, 카디오이티리노이톨(간 PI) 용액을 풀어 지질 스톡 용액을 준비 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoeolamine-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (18:1 PEG2000 PE) 클로로폼으로 25 mg/mL의 농도. 형광염염수-공주지질(텍사스레드 DHPE 및 Cy5 DOPE) 클로로폼을 1 mg/mL 농도로 용해한다. 엽록소 내성 라이너가 있는 호박색 바이알에 지질 용액을 보관하고 폴리테트라플루오로틸렌 테이프로 밀봉합니다. 용액은 최대 6 개월 동안 -20 °C에서 보관 할 수 있습니다.
  2. 솔루션 A와 B를 만듭니다.
    1. DOPC(52.8mol%), 교황(20mol%), 간PI(7mol%)를 함유한 솔루션 A(최종 농도 1 mg/mL)를 준비하려면 지질을 혼합합니다. 및 심폐소심(20mol%) 및 0.2 mol% 불소.
    2. DOPC(47.8mol%), 교황(20mol%), 간PI(7mol%), 카디오리핀(20mol%) 함유 솔루션 B(최종 농도 1 mg/mL)를 만듭니다. 도페-페그2000(5mol%) 및 0.2 mol% 불소호레.
    3. 유리 주사기를 사용하여 호박색 바이알에 저장 용액의 계산된 볼륨을 추가하여 지질 혼합물을 생성합니다. 바이알에 클로로폼을 추가하여 최종 볼륨을 일치시합니다.
      참고: FCS의 경우(형광 상관 분광법)의 경우 염료 공액 지질의 비율을 0.002 mol%로 줄이고 나머지는 DOPC에 의해 대체합니다.

2. 지질 이중층의 제조

  1. 30 분 동안 520 °C에서 현미경 커버 유리 슬라이드를 굽습니다. 베이킹 후 커버 슬라이드를 실온으로 식힙니다.
  2. 수산화 나트륨의 약 10 g의 무게와 교반하는 동안 메탄올의 500 mL에 추가합니다. 2시간 동안 저어주고, 침전이 나타나기 시작할 때까지 용액에 수산화 나트륨을 계속 추가하십시오. 전체 공정 중에 적절한 PPE를 착용해야 합니다.
  3. 10% 나트륨 도데실 황산염 용액에 유리 슬라이드를 청소; 수산화 나트륨으로 포화 된 메탄올; 및 50mM 염산, 순차적으로(각 조건하에서 30분 동안 목욕 초음파 처리). 각 조건 사이에 10 분 동안 초순수 물로 유리 슬라이드를 청소하십시오.
    참고: 유리 슬라이드 준비에 신선한 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다만 각 솔루션은 최대 5배 또는 1개월 이내에 재사용할 수 있습니다. 각 사용하기 전에 솔루션을 교반해야 합니다.
  4. 깨끗한 커버 글래스를 HCl 솔루션에 밀봉하여 최대 2주 동안 보관하여 양층 품질을 보장합니다. 초순수에 보관하면 1주일 이내에 슬라이드를 사용하십시오.
  5. 클로로폼과 초순수를 사용하여 랑뮤어-블로젯 디핑 시스템의 폴리테트라플루오로틸렌 트로프를 청소하여 쓰루에 젖지 않을 때까지 청소하십시오. 쓰루 표면에 클로로폼을 스프레이하고 셀룰로오스 와이프 3배로 철저히 닦으십시오. 초순수물로 헹구고 흡입을 통해 물을 제거합니다. 3배 반복합니다.
  6. 깨끗한 초순수물로 쓰루 표면을 덮습니다.
  7. 세정 용액 또는 초순수물에서 표면 처리 커버 유리 2개를 가져 와서 유리 슬라이드를 약 30 초순수물로 헹구십시오.
  8. 커버 글래스를 백투백 방식으로 배치합니다. 기판 클램프를 사용하여 유리 슬라이드를 잡습니다. Langmuir 제어 소프트웨어에서 수동으로 "디퍼 다운"을 클릭하여 수면 아래 유리 슬라이드를 침지하십시오.
  9. 필름 밸런스를 제로, 조심스럽게 확산 솔루션 B 는 공기 물 인터페이스(그림 2A)에서드롭에 의해 드롭. 폴리테트라플루오로틸렌 표면의 바닥으로 가라앉는 클로로폼과 지질 방울이 없는 공기물 인터페이스에서만 지질이 확산되고 있는지 확인하십시오.  이를 보장하지 못하면 지질 "채널"이 생성되고 단층 형성을 방지할 수 있습니다.
  10. ~ 15-20 mN/m 주위의 필름 밸런스 판독까지 지질 을 추가 중지하고 ~ 10-15 분 기다립니다. 37 mN/m까지 필름 밸런스 판독까지 "실험 시작"을 클릭하여 표면적을 변경하는 배리어 컨트롤러를 시작합니다. ~20~30분(그림2B)에대한 압력을 유지합니다.
  11. 37 mN/m의 표면 장력을 유지하면서 22mm/min의 속도로 커버 글래스를 올립니다. 폴리머 테더링을 갖춘 지질 단층은 Blodgett 디핑공정(도 2C)을통해 커버 글래스 표면으로 공기-물 인터페이스에서 전송됩니다. 이것은 지질 이중 층의 하단 전단지를 형성한다.
  12. 흡입에 의해 공기 물 인터페이스를 청소하고, 초순수물로 트로프를 헹구는 다.
  13. 사용하기 전에 클로로폼, 에탄올 및 초순수물을 사용하여 한 웰드 글라스 슬라이드(예: 쉐퍼 슬라이드)를 청소하십시오. 물 층 아래에 초순수물로 트로프에 깨끗한 유리 슬라이드를 설정합니다. 우물이 공기 물 인터페이스를 향하고 있는지 확인하고 유리 슬라이드가 완전히 덮일 때까지 신선한 초순수물을 부어 줍니다. 2.8 단계를 반복합니다.
  14. 실리콘 흡입 컵을 사용하여 2.4 단계에서 지질 단층으로 커버 글래스를 잡고 (단층 측이 흡입 컵에서 떨어져 있는지 확인), 부드럽게 공기 물 인터페이스에 지질 단층을 밀어, 인터페이스에서 ~ 2-3 s에 대한 커버 유리를 잡고, 슬라이드에 대한 커버 유리를 밀어(도 2D). 커버 슬라이드로 슬라이드를 꺼내십시오.
    참고: 지질 이중층은 두슬라이드(그림 2E)사이의 끼어있는 영역을 향한 커버 글래스의 표면에서 개최됩니다.
  15. 이중 층으로 커버 유리를 피의 불피 현미경으로 가져 가라. 지질 이중 층을 이미지합니다. 지질염의 균일한 분포가 관찰되면, 30초 동안 바이레이어의 작은 면적을 광표백하고, ~30 s-1분 동안 광원을 끄고, 다시 영상을 사용하여 회복을 관찰한다. 지질 이중층은 형광 회복을 보여줍니다.
    참고: 결함이 있거나 형광 회복이 나쁜 멤브레인은 추가 실험에 사용해서는 안 됩니다.

figure-protocol-3382
그림 2: 폴리머 테더지질 이중층을 만드는 단계.
랭뮤어-블로젯디핑(A-C)및 랭뮤어-쉐퍼 트랜스퍼(D) 기술을D사용하여 지질 이중층을 만드는 단계. (E)지질 이중층을 포함하는 최종 "샌드위치". 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 폴리머 테더지질 이중층으로 단백질 재구성

  1. 초순수가 함유된 결정화 접시를 준비한다. 깨끗한 현미경 이미지 링을 준비하고 접시 아래에 놓습니다.
  2. 쉐퍼 슬라이드의 "샌드위치"를 침지하고 물 아래에 지질 이중 층을 포함하는 커버 유리를 담그고 쉐퍼 슬라이드와 커버 유리를 부드럽게 분리하고, 하단에서 커버 유리 슬라이드를 잡고, 이중 레이어 측면에서 멀리, 이미지 링으로 커버 유리를 전송합니다.
    참고: 지질 이중층이 있는 커버 글래스가 항상 물에 있고 링이 잘 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
  3. 이미지 링의 초순수수를 비스-트리스 NaCl 버퍼로 교체하고 지질 이중층이 기포에 노출되지 않았는지 확인합니다. 지질 이중층에 1.1 x 10-9 M n-옥틸-β-D-글루카피라노사이드를 넣습니다. 즉시 DDM의 1.2 x 10-9 M과 1.3 x 10-12 mol 정제 l-Opa136의 혼합물을 이미지 링에 추가합니다. 2 시간(그림 3)에대한 저속으로 벤치 탑 셰이커에 샘플을 배양한다.
    참고: 세제는 재구성할 단백질에 따라 달라질 수 있습니다.
  4. SM-2 수지 구슬 30 mg을 비스 트리스 버퍼와 쉐이크3mL로 나누어 적용하기 전에 흔들어 줍니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 SM-2 수지 구슬의 5~10 μL을 이미지 링에 추가하고 10분 동안 배양하고 헹구어 수지 구슬을 제거합니다. 이미지 링의 버퍼의 마지막 볼륨은 1.5mL입니다.

figure-protocol-4695
그림 3: l-Opa1을 폴리머 테더지질 이중층으로 재구성하는 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 프로테올리포좀 준비

  1. 클로로폼 용액으로 지질 혼합물 A 1 mg을 준비합니다. 질소 흐름 하에서 20분 동안 엽록소포형을 증발시키고 밤새 진공 상태에서 유지하여 지질 필름을 형성합니다.
  2. 15.56g의 칼세인을 1.5mL로 용해시켜 1.5mL의 1.5몰 NaOH 용액을 녹여서 50mMM의 칼세인을 준비하고, 칼신이 완전히 용해될 때까지 실온에서 저어주며, 12.5mM 비스-트리스와 초순수수를 500mL의 최종 부피에 첨가한다. pH를 7.5로 조정합니다.
  3. 충완을 포함하는 칼세인에서 지질 필름을 중단하고, 65°C에서 20분 동안 서스펜션을 가열하여 지질을 완전히 수화한다. 200nm 리포솜은 폴리카보네이트 멤브레인을 사용하여 압출을 통해 형성된다.
  4. l-Opa1 2 μg를 0.5 μM DDM에 0.2 mg 리포솜에 넣고 4°C에서 1.5h의 인큐베이션을 넣습니다. 25m 비스트리스의 250ml, 150mM MM NaCl 및 50mM 칼세인 버퍼를 4°C에서 2°C로 3.5kDa 투석 카세트를 사용하여 투석에 의한 계면활성제를 제거하여 버퍼를 2회 변경한다.
  5. PD-10 탈염 열을 사용하여 여분의 칼세인을 제거합니다.

5. 이미징 및 데이터 분석

  1. 100x 오일 침지 목표(N.A 1.4)를 사용하여 TIRF 이미지를 획득합니다. 사용 543 nm 레이저와 488 nm 레이저 텍사스레드-PE 라벨 리포솜과 칼세인캡슐화 의 분석을 위한 nm 레이저. 평면 지질 이중층에 내장된 Cy5-PE 분석을 위해 633 nm 레이저를 사용하십시오.
  2. 지질 이중층을 사용하여 TIRF 각도를 정렬하여 최대 방출을 얻습니다. 25°C에서 100x 오일 목표를 사용하여 재구성 후 지질 이중층의 품질이 관찰된다. 인지질 및 재구성된 이중레이어의 확산 계수는 다른37을설명하는 프로토콜을 가진 FCS를 사용하여 결정된다.
  3. 이미지 링에 2 mg/mL 프로테올리포좀의 10 μL을 추가하고 이미지 전에 10분 동안 설정합니다. GTP, GMPPCP, 또는 GDP는 뉴클레오티드의 1 mM MgCl2 및 1 mMM와 반응 링에 추가됩니다.
  4. 멤브레인 융합에서 s-Opa1의 영향을 결정하기 위해 s-Opa1을 l-Opa1을 포함하는 프로테오올리푸좀/지원 된 바이레이어 샘플로 적시하고 융합 이벤트를 기록합니다.
  5. 텍사스레드-DHPE 및 칼신의 동시 이미징은 빔 분할 시스템을 통해 달성됩니다. 488 nm와 543 nm 레이저는 모두 동시에 밀가루 발광 소스로 샘플에 적용됩니다. 그런 다음 방출 광은 560 nm 빔 스플리터를 사용하여 분할됩니다. 분할 방출 광은 42 nm의 대역폭과 40 nm의 대역폭이있는 510 nm 필터와 40 nm의 대역폭을 가진 609 nm 필터로 필터링됩니다. 여과된 빔은 카메라 칩의 두 개의 인접 영역으로 투사됩니다.
  6. 형광 방출은 40 nm의 대역폭을 가진 609 배출 필터와 70 nm의 대역폭을 가진 698 방출 필터를 통해 동시에 기록됩니다. 현미경 시스템에는 -10 °C에서 유지되는 CMOS 카메라가 장착되어 있습니다.
  7. 리포솜의 입자 식별은 가우시안 기반 입자 인식 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 입자 분포와 강도는 채널별 분석됩니다. 지질 이중층 신호는 입자를 분리하는 마스크로 사용됩니다.

결과

재구성된 막 단백질은 자유롭게 확산되고 멤브레인에 균질하게 분포됩니다.

지질 이중층및 그 지질 유동성의 예는 피겨에피언경화 현미경 검사법에 의해 검증된다 4. 사진 표백 전후의 이중층에서지질 분포가 도 4A, B에표시됩니다. 지질 이중층의 균질성은 재구성 전후의 상피현미경을 사용하여 시각화하였다(도Figure 44D, E). 지질 이중층에서 재구성된 l-Opa1은 형광 상관 분광법(FCS)에 의해 검증되었다. 우리는 염료 공액 지질을 사용하여 양층의 지질 확산도를 평가합니다. 재구성된 Opa1은 형광 태그된 항-Opa1 C-말단 항체를 사용하여 표지되었다. 이중층 지질 확산은 1.46 ±0.12 μm22/s로 측정되었으며, 이중층 재구성l-Opa1의 확산 계수는 0.88 ± 0.10 μm 2/s였다.2 FCS 곡선의 강도 판독값은 l-Opa1의 75%가 지질 이중층(그림4G, H)으로재구성된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 l-Opa1이 고분자 테더지질 이중층에서 자유롭게 확산되어 기능성 복합체로 자가 조립할 수 있음을 시사합니다.

figure-results-853
그림 4: 모델 멤브레인에서 지질 및 재구성된 단백질의 분포.
(A-C) 지질 이중층과 그 지질 유동성의 예 이미지는 과민성 현미경 검사법에 의해 검증됩니다. (A)광표백 전에 이중층에서 균일한 지질 분포. (B)포토블리싱 직후 스냅샷. (C)형광 회복 후 이미지화된 이중층은 재구성 에 따른 멤브레인의 양호한 지질 유동성을 나타낸다. (D,E) 지질 분포의 대표적인 이미지는(D)및 그 후(E)l-Opa1 재구성은 재구성 과정이 이중층에서 결함을 생성하지 않았음을 나타낸다. 알렉사 488 공조항체(F)로표기된 l-Opa1의 대표적인 TIRF 이미지는 재구성시 Opa1의 균질분포를 보여준다. G. 형광 상관 분광학에 의한 l-Opa1 신호의 대표적인 원시 광자 수. 대조군에서는 l-Opa1이 이중층에서 재구성되지 않았으며 항체가 첨가되고 헹구었다. l-Opa1의 확산은 막에 있는 지질 보다는 현저하게 느립니다, transmembrane l-Opa1의 성공적인 재구성과 일치합니다(H). 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광 단계 표백은 l-Opa1의 평균 2-3 사본이 주어진 리포솜(그림 5Figure 5A, B)으로재구성되었다는 것을 나타냈다. Opa1 재구성 된 프로테오폴좀의 크기 분포는 DLS(도 5C)를사용하여 재구성 한 후 테스트되었습니다. 프로테오올리푸좀에서 Opa1의 재구성은 FCS를 사용하여 검증되었습니다. 자유 항체의 확산 계수는 164 ± 222μm 2/s; 지질염으로 표시된 리포솜용 확산 계수는 2.22 ± 0.33 μm22/s였으며, 텍사스레드 표지된 항체는 2.12±0.36 μm2/s로텍사스레드 라벨에 묶여 있는 l-Opa1 프로테오리포좀에 대한 확산 계수였다.

figure-results-2271
그림 5: 프로테오폴좀의 제조 및 특성화.
(A)캡슐화, 담금질 칼세인 프로테올리포솜을 제조하는 단계. (B)형광 단계 표백의 대표적인 데이터는 리포솜에 내장된 l-Opa1의 평균 2-3사본을 보여준다. (C)GTP 인큐베이션(green) 후 뉴클레오티드 1h 없이 프로테오올리포좀(red)의 대표적인 크기 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광 현미경 검사법에 의한 막 테더링, 지질 분해/혈전 및 모공 개구부를 검출합니다.

멤브레인 테더링은 TIRF현미경(도 6A)을사용하여 지질 이중층의 표면에 TexasRed의 신호를 관찰하여 모니터링된다. 막 지질 디믹스 (hemifusion) 행동은 지질 이중 층으로 지질에서 염료 확산으로 텍사스레드를 통해 모니터링되었다. 칼세인 디커닝은 전체 퓨전 모공 형성을 지질 디믹스와 구별하는 데 도움이 됩니다. 이를 통해 입자가 혈중(도 6B)에서 정지되는 조건과 전체융합(도 6C)으로진행되는 입자 간의 비교를 가능하게 한다.

멤브레인 테더링은 지질성으로부터 의 안정적인 지질 신호로 표시됩니다. 거리는 두멤브레인(36)의라벨 사이의 FRET 신호를 기반으로 평가될 수 있다. 헤미퓨전 신호는 칼세인신호(도 6B,하부 행)에 해금되지 않지만, 텍사스레드 신호의 급격한 붕괴는 지질 이중층(도6B 상부 행)으로 염료의 확산을 나타낸다. 전체 융합(모공 개구부)은 지질 부패와 내용 물자발매(도 6C)를모두 특징으로 합니다. 텍사스레드 강도 및 칼신 강도는 멤브레인융합(36)의운동에 대한 정량적 세부 사항을 제공하기 위해 시간에 따라 추적될 수 있다.

figure-results-3676
그림 6: 입자 테더링(A, 스케일 바 10 μm), 헴퓨전(B, 스케일 바 0.5 μm), 융합(C, 스케일 바 0.5 μm)을 나타내는 대표적인 결과.
(A)프로테올리포솜은 GTP 첨가 전에 Opa1 재구성지질 이중층에 묶여 있다. (B)혈중의 예. B의 상부 행은 지질 디믹스(TexasRed 신호, 빨간색) B의 하부 행은 이러한 조건 하에서 콘텐츠 방출(calcein signal, green)을 나타내지 않는다. (C)지질 이중층과 융합된 프로테오올리포종의 대표적인 흔적. 콘텐츠 릴리스는 칼세인(하부 행, 녹색)의 해제를 보여주는 하부 행의 이미지에서 관찰할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

시험관 내 모델 멤브레인 시스템은 잘 정의된 조건하에서 복잡한 멤브레인 프로세스를 설명할 수 있습니다. 이러한 시스템은 분자 메커니즘6,15,,20,,38을드러내기 위해 복잡한 분자 공정에 필요한 최소한의 구성 요소를 구별할 수 있다., 막 단백질의 경우, 리포솜과 평면 지원 이중층은 일반적인 재구성 시스템입니다. 고체 지원 지질 양층과는 달리, 폴리머 테더바이층의 기판과 지지막 사이의 폴리머 쿠션은 대형 멤브레인 단백질의 자유로운 이동성을 허용하고, 막 단백질은 자유롭게 확산및조립34를허용한다. 이러한 특징은 우리가 미토콘드리아 내막 융합36의운동학을 조사하는 데 도움이.

우리는 랭뮤어-블로젯/랭뮤어 셰퍼(LB/LS) 기술을 사용하여 폴리머 테더지질 바이레이어를 준비했습니다. 이를 통해 비대칭 지질 성분이 있는 바이레이어를 준비할 수 있습니다. 세포막은 비대칭 전단지 조성물을 가지며, LB/LS 접근법은 이러한 이중층의 연구를 허용한다. 쉐퍼 전달을 사용하면 전체 유리 기판이 지질 이중 층으로 덮을 수 있습니다. 이중 레이어 준비를 위해 깨끗한 표면을 준비하는 것이 중요합니다. 또한 쉐퍼 전송을 올바르게 수행하는 연습이 필요합니다. 실패한 쉐퍼 전송은 지질 이중 층에서 원치 않는 결함을 만들 수 있습니다. 이 프로토콜에서 필름 밸런스에 첨가된 압력은 20% 심폐진을 함유하는 이중층에 적용됩니다. 다른 구성 요소와 이중 레이어의 경우 주요 구성 요소의 표면 압력 영역 이더렘을 참조하십시오. 다른 방법은 Langmuir-Blodgett/소포 융합(LB/VF) 방법으로, 하부 지질 단층이 랭뮤어 트로프의 공기-물 인터페이스에서 깨끗한 기판으로 옮겨진 다음, 리포솜이 지원되는 지질 단층의 상부로 융합되어 최종이중층(39)을형성한다. LB/VF 방법을 사용하는 멤브레인 단백질의 재구성은 프로테오폴좀의 융합을 통해 재구성이 수행될 수 있기 때문에 LB/LS보다 더 간단하다. 그러나, 소포 융합은 과잉 리포좀의 추가를 요구합니다, 이는 농도 의존적인 단백질 단백질 상호 작용에 의존하는 막 사건의 연구를 복잡하게 할 수 있습니다.

바람직한 기능성 방향에서 폴리머 테더지질 이중층과 리포솜으로 막 이상 단백질의 성공적인 재구성은 중요하지만 시행하기어렵다. 이를 설명하기 위해서는 실험 컨트롤이 필요합니다. 폴리머 테더지질 이중층의 경우, 재구성 하는 동안 지질 이중 층의 무결성을 유지 하는 것이 중요 하다. 계면활성제 농도는 지질 이중층을 용해시키는 것을 방지하기 위해 상대적으로 낮게 유지되어야 하지만, 관심 있는 단백질의 저하를 방지할 수 있을 만큼 충분히높음(37,,40). 여기에서 기술된 방법은 단 하나 분자 연구를 위한 막 단백질을 재구성하는 데 이상적이지만 대규모 연구를 위해 반드시 확장가능한 것은 아닙니다. 계면 활성제 선택은 또 다른 중요한 고려 사항입니다. 정제 및 보관에 사용되는 계면활성제는 좋은 출발점이 되는 경우가 있습니다. 계면활성제의 최대 농도는 일반적으로CMC(36)의200배 이하이며, 계면활성제가 단백질 안정성을 유지하고 단백질 응집을 방지하는 범위에서멤브레인(36)의무결성을 유지한다. 계면활성제 2개 또는 3개가 함유된 칵테일을 고려할 수 있습니다. 리포솜으로 재구성하기 위해서는 계면활성제의 낮은 농도가 필요하지 않습니다. 그러나, CMC 이하의 계면활성제 농도는 리포솜에 대한 균일한 크기 및 형태 분포를 유지하는 것이 바람직하다. 내용 염료의 누출을 방지하기 위해 염료 함유 버퍼에 대해 투석할 필요가 있습니다.

리포솜 기반 융합 분석과는 달리, 우리가 설립한 플랫폼은 멤브레인 융합의 각 단계의 운동학을 조사하는 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 거의 네이티브 조건하에서 막 간 융합 단백질을 연구하는 기능을 제공합니다. 모델 멤브레인 플랫폼은 미토콘드리아 내막과 같은 세포 외 환경에서 막 단백질 조립 및 올리고머화, 멤브레인 "조각"및 단백질 지질 상호 작용을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 이 방법은 또한 이중층 조성 비대칭과 같은 막 단백질 상호 작용에서 중요한 생리적 조건을 탐구할 수 있게 합니다. 리포솜과 폴리머 지원 이중층의 이중층 특성에서 주요 미토콘드리아 지질, 심막의 역할은 정의되어야 한다. 이온 강도, 막 두께, 막 강성, 멤브레인 곡률 및 멤브레인 탄성 점도 특성과 같은 특성은 모두 단백질이 특정 기능 상태로 조립하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 모형 막 시스템을 창의적으로 적용하는 미래 연구는 막 단백질 조직 및 기능의 새로운 양상을 밝힐 가능성이 있습니다.

공개

없음.

감사의 말

저자는 찰스 H. 후드 재단 아동 건강 연구 상에서 지원과 매사추세츠 종합 병원에서 분자 생물학의 부서에서 관대 한 지원을 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5)Avanti polar lipidCat #: 810335C1mgmembrane fluorescent markers
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)Avanti Polar lipidsCat #: 880130Plipid molecules
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt)Avanti Polar lipidsCat #: 710335Plipid molecules
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)Avanti Polar lipidsCat #: 850375Plipid molecules
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar lipidsCat #: 850757Plipid molecules
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling KitThermoFisher ScientificA20181
Amber vial with PTFE linerFisher scientific14-955-332sample vials to keep lipid solutions
CalceinSigma-AldrichCat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279fluorescent dye
ChloroformFisher scientific298-500/ C295-4Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.
Concavity slide (1 well)Electron Microscopy Science71878-05applied as Schaefer Slide
FCS analysis toolSmith Lab, University of Akronsoftware tool
Fiji /ImageJFijiSCR_002285software tool
Fisherbrand Cover Glasses: CirclesFisher scientific12-545-102Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M
GTP Disodium saltSIGMA-ALDRICH INCCat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett TroughBiolin ScientifcKN2002
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt)Avanti Polar lipidsCat #: 850091Plipid molecules
Mini ExtruderAvanti Polar lipids610020
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceCat #: D310 25 GMsurfactant for reconstitution
n-Octyl-α-D-GlucopyranosideAnatraceCat #: O311HA 25 GMsurfactant for reconstitution
PC Membranes 0.2μmAvanti Polar Lipids610006
Rabbit Anti-Opa1 antibodyNOVUS BIOLOGICALSCat #: NBP2-59770antibody for Opa1 C-terminal detection
SlidebookIntelligent imagingRRID: SCR_014300software tool
Teflon threaded seal tapeFisher ScientificNC0636085taflon tape for sample storage
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)ThermoFisher ScientificCat #: T1395MPmembrane fluorescent markers

참고문헌

  1. Sackmann, E., Lipowsky, R., Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. 1, 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J., Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. , (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

JoVEOpa1TIRF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유