세균 성 내분염의 마우스 모형에 있는 감염 매개변수의 인트라비탈 주입 및 양

요약

우리는 여기에서 세균성 내과염의 마우스 모형에 있는 intravitreal 주입 및 후속 세균량의 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 숙주 면역 반응 및 세균 및 숙주 유전자 발현을 측정하기 위해 확장될 수 있다.

초록

안구 세균 감염은 시력에 위험합니다. 연구원은 가능한 치료 표적을 확인하고 실명을 방지하기 위하여 약을 시험하기 위하여 감염과 관련되었던 호스트 및 세균성 요인 및 면역 반응 통로를 조사하기 위하여 동물 모형을 이용합니다. 인트라비탈 주입 기술은 유기체, 약물 또는 기타 물질을 눈의 후방 세그먼트의 유리체 구멍에 직접 주입하는 데 사용됩니다. 여기에서, 우리는 마우스 눈에서 감염을 시작하는 이 주입 기술 및 안구 내 박테리아를 정량화하는 기술을 시연했습니다. 바실러스 세레우스는 뇌 심장 주입 액체 미디어에서 18시간 동안 재배되었고 농도 100콜로 다시 매립(CFU)/0.5 μL을 하였다. C57BL/6J 마우스는 케타민과 자일라진의 조합을 사용하여 마취되었다. 피콜리터 마이크로인젝터와 유리 모세관 바늘을 사용하여, 바실러스 현탁액의 0.5 μL은 마우스 눈의 중간 유리체에 주입되었다. 금방 대조눈은 멸균 매체(외과적 통제)로 주입되었거나 주입되지 않았다(절대 제어). 감염 후 10시간 동안, 마우스는 안락사되었고, 눈은 멸균 수술 핀셋을 사용하여 수확하고 400 μL 멸균 PBS 및 1mm 멸균 유리 구슬을 포함하는 튜브에 배치되었다. ELISA 또는 골수페록시다제 아사제의 경우, 단백질 효소 억제제가 튜브에 첨가되었다. RNA 추출의 경우 적절한 용해 버퍼가 추가되었습니다. 눈은 1-2 분 동안 조직 균질화로 균질화되었다. 균질화는 PBS에서 10배 연속적으로 희석되고 한천 판에 희석된 추적을 했다. 균질의 나머지 는 추가 적인 에세이를 위해 -80°C에 저장하였다. 플레이트는 24시간 동안 배양되었고 눈당 CFU가 정량화되었습니다. 이러한 기술은 마우스 눈에 재현 가능한 감염을 초래하고 실행 가능한 박테리아의 양을 용이하게, 숙주 면역 반응, 호스트 와 세균 성 유전자 발현의 omics.

서문

세균성 내과염은 염증을 일으키는 치명적인 감염이며, 제대로 치료하지 않으면 시력이나 실명의 손실이 발생할 수 있습니다. 내피탈미염은^{1, 2,3,4,5의내부로}박테리아가 들어온 결과. 일단 눈에, 박테리아 복제, 독 소 및 기타 유해 요인을 생산, 섬세 한 망막 세포와 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 안구 손상은 또한 염증에 의해 발생할 수 있습니다, 눈의 내부로 염증 세포 유입으로 이어지는 염증 경로의 활성화에 의해^1,5,6. 내과 실증염은 안구 수술(수술 후), 눈에 관통하는 부상(외상 후), 또는 다른 해부학 부위(내인성)^{7,8,9,10에서}박테리아의 전이성 확산을 눈으로 볼 수 있다. 세균성 내과염에 대한 치료는 항생제, 항염증제, 또는 외과적 개입^3,4,11을포함한다. 이러한 치료에도 불구하고 시력이나 눈 자체가 손실 될 수 있습니다. 세균성 내막염 후의 시각적 예후는 일반적으로 치료 효과, 프레젠테이션시 시력 및 감염 유기체의 독성에 따라 달라집니다.

바실러스 세레우스(B. cereus)는외상 후 내분비염^7,12를유발하는 주요 세균성 병원균 중 하나입니다. B. 세루내팔염 케이스의 대다수는 며칠 안에 실명을 초래할 수 있는 급속한 과정이 있습니다. B. 세루 내막염의 특징은 빠르게 진화하는 안구 내 염증, 눈 통증, 시력의 급속한 손실 및 발열을 포함합니다. B. 세레우스는 일반적으로 눈 감염을 일으키는 원인이 되는 그밖 박테리아에 비해 눈에서 급속하게 성장하고^2,4,12 및 많은 독성 요인을 가지고 있습니다. 따라서, 성공적인 치료 내정간섭을위한 창은 상대적으로 짧은^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25입니다.} 이 감염을 위한 처리는 일반적으로 그밖 보다 적게 악성 병원체에 기인한 내피세포염 취급에 성공적입니다, 그러나 B. cereus 내분비염은 일반적으로 중요한 비전 손실 때문에 손해를 입는 환자의 70% 이상 귀착됩니다. 그 환자의 대략 50%는 감염된 눈의 evisceration 또는 enucleation를^{겪는7,16,22,23.} B. 세루의 파괴적이고 빠른 본질은 즉각적이고 적절한 처리를 요구합니다. 질병 발달의 근본적인 기계장치를 분별하는 최근 진행은^{내정간섭19,26,27에}대한 잠재적인 표적을 확인했습니다. B. cereus 내피탈미염의 실험 마우스 모델은 감염의 메커니즘을 분별하고 시력 손실을 방지 할 수있는 잠재적 인 치료법을 테스트하는 데 계속 유용합니다.

B. 세레우스를 가진 마우스의 실험적인 안구 감염은 내피염²⁸도중 세균성 및 호스트 요인을 이해하기 위한 중요한 모형이었습니다, 뿐만 아니라 그들의 상호 작용. 이 모델은 외상 후 또는 수술 후 사건을 모방, 있는 박테리아는 부상 하는 동안 눈에 소개. 본 모델은 매우 재현가능하며 실험요법을 테스트하고^{치료 기준 1,6,19,29,30의}개선을 위한 데이터를 제공하는 데 유용하다. 다른 많은 감염 모델과 마찬가지로,이 모델은 감염의 많은 매개 변수의 독립적 인 제어를 허용하고 감염 결과의 효율적이고 재현 가능한 검사를 가능하게합니다. 지난 수십 년 동안 토끼의 유사한 모델에서 연구는 눈^{2,4,13,14,31에} B. 세레우스 독성 요인의 효과를 검사했다. B. 세레우스 돌연변이 균주를 주입함으로써 개인 또는 다중 독성 인자가 결여되어 있으며, 이러한 독성 인자의 질병 중증도에 대한 기여는 소독 후의 다른 시간에박테리아의 농도 또는 시각^{기능(13,14,27,31,32)의}손실과 같은 결과에 의해 측정될 수 있다. 또한, 호스트인자는 특정 염증성 숙주 인자(26,^{29,33,34,35)가}부족한 녹아웃 마우스 균주를 감염시킴으로써 본 모델에서 검사되었다. 이 모델은 감염 후 눈에 새로운 화합물을 주입하여이 질병에 대한 잠재적 인 치료를 테스트하는 데^{유용하다 30,36.} 이 원고에서는 B. cereus로마우스 눈을 감염시키고, 감염 후 눈을 수확하고, 내구 세균 부하를 정량화하고, 질병 중증도의 추가 매개 변수를 분석하기 위해 표본을 보존하는 것을 포함하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

모든 절차는 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을위한 비전과 안과 성명서에 대한 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드와 연구를위한 협회의 권고에 따라 수행되었다. 프로토콜은 오클라호마 대학 건강 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 15-103, 18-043 및 18-087).

1. 멸균 유리 바늘

1. 바늘 파이펫 풀러를 켭니다.
2. 디스플레이에 12.6이 표시될 때까지 히터 노브를 조정합니다.
3. 튜브의 절반이 필라멘트(그림1A)아래로 확장될 때까지 도어를 열고 상부 클램프및 히터 필라멘트를 통해 5μL 모세관 튜브를 수동으로 공급한다.
4. 모세관 튜브가 상부 클램프의 "V" 홈에 있는지 확인합니다. 상부 클램프를 조입니다.
5. 하부 클램프를 열어 아래 쪽 클램프가 상한에 도달할 때까지 수직 슬라이드를 수동으로 조정합니다. 튜브가 하부 클램프의 "V" 홈에 있는지 확인합니다. 하부 클램프를 조입니다.
6. 문을 닫고 '준비' 표시등이 켜져 있는지 확인합니다. 시작 버튼을 눌러 히터및 당기기 시퀀스(그림1B)를시작합니다.
7. 열과 중력이 모세관튜브(도 1C)를분리한 후 히터가 자동으로 꺼지도록 하고 슬라이드가 아래로 이동합니다.
8. 문 여세요. 모세관 튜브의 상단을 잡고있는 동안 상단 클램프를 풀십시오. 상부 모세관 튜브를 제거하고 따로 둡니다.
9. 아래 슬라이드에 모세관 튜브를 잡고 하부 클램프를 풀수 있습니다. 하부 모세관 튜브를 제거하고 따로 둡니다.
10. 0.05 μm 알루미나 연마 플레이트가 있는 마이크로 전기 전제 베블러를 사용하여 뽑아낸 모세혈관을 배관하여 주입 바늘을 만듭니다.
11. 파이펫은 연삭 플레이트에 충분한 물을 주어 표면을 덮습니다(도1D).
12. 60 rpm에서 회전하기 시작되도록 베벨러를 켭니다. "V" 홈의 파이펫 클램프에 당겨진 모세관 튜브를 놓습니다. 클램프를 조이고 파이펫 클램프의 각도를 30°로 조정합니다.
13. 연삭 플레이트의 회전 중심에서 약 3분의 2 떨어진 모세관 튜브의 뾰족한 가장자리의 끝을 조정합니다.
14. 조작기 의 상단에 거친 제어 노브를 조정하여 고정 모세관 튜브를 낮춥다. 모세관 관의 끝이 수면 아래로 뻗어 연삭 판의 연마 표면에 닿을 때까지 모세관 튜브를 계속 낮춥시다.
15. 베벨러에 부착된 현미경을 사용하여 베벨링 진행 상황을 모니터링합니다. 5 분 후, 연삭 플레이트에서 유리 바늘을 들어 올리기 위해 미세 조절을 조정합니다.
16. 유리 바늘을 제거하고 모세관 관의 끝을 확인하기 위해 10배 배율 아래에 놓습니다(도1E, F).
17. 막힘이 없는지 확인하려면 유리 바늘을 주사기의 파이펫 홀더에 삽입하고 공기를 99% 에탄올의 1mL 튜브로 밀어 넣습니다. 바늘 끝에 기포가 형성되면 바늘에는 막힘이 없으며 미세 주입에 사용할 수 있습니다. 이 과정은 또한 유리 바늘의 멸균을 보장합니다.
18. 하나의 모세관 튜브는 최대 5 μL 액체를 보유 할 수 있습니다. 모세관 튜브를 10개의 섹션으로 표시하여 바늘의 거리를 계산하여 0.5 μL 부피를 표시합니다. 향후 준비를 위해 0.5 μL을 보유하는 거리로 스케일을 표시합니다. 5 μL 바늘의 경우 0.7mm 떨어져 있는 거리는 0.5μL(도 1G)에해당합니다.

2. 바실러스 세레우스 문화

1. 바이오 세이프티 레벨 2 조건하에서 이 섹션의 모든 절차를 수행합니다.
2. B. cereus ATCC 14579의 줄무늬 냉동고 육수는 5% 양 혈액 한천판에 단 하나 식민지 절연을 위한 37°C(그림2A)에서하룻밤 동안 배양한다.
3. 10mL 멸균 스냅 캡튜브(도 2B)로멸균 뇌 심장 주입(BHI) 국물의 파이펫 5mL. 멸균 루프 또는 바늘을 사용하여, 한천 판에서 B. cereus ATCC 14579의 단일 콜로니를 선택하고 액체 BHI를 접종한다.
4. 샘플을 간략하게 소용돌이시다. 스냅 캡 튜브를 회전하는 인큐베이터에 넣습니다. 온도를 37°C로 설정하고 속도는 200 rpm에서 설정합니다. 18h 후 인큐베이터(도2B)로부터배양을 제거한다.

3. 인트라비티리얼 주입을 위한 세균 희석

1. 바이오 세이프티 레벨 2 조건하에서 이 섹션의 모든 절차를 수행합니다.
2. 하룻밤 B. 세레우스 배양의 부피를 계산하여 10mL의 신선한 BHI에 추가하여 마이크로리터당 200개의 콜로니 성형 유닛(CFU/μL)을 달성한다. 예를 들어, BHI의 B. 세레우스의 하룻밤 문화는 약 2 x 10⁸ CFU/mL로 복제되며, 이는 하룻밤 문화의 10 μL을 신선한 BHI의 10mL로 파이프팅하여 200 CFU/μL로 희석될 수 있습니다.
3. 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브로 갓 희석 된 배양의 파이펫 1 mL. 이 튜브를 얼음 위에 유지하여 인트라비티리얼 주사까지 유지합니다. 세균 배양을 희석한 60분 이내에 인트라비티리얼 주사를 수행합니다.

4. 마우스 인트라비티리얼 주입

1. 바이오 세이프티 레벨 2 조건하에서 이 섹션의 모든 절차를 수행합니다.
2. 수술대에 의료 언더패드를 배치하여 절차 부위를 준비합니다.
3. 마이크로인젝터를 켜고 마이크로인젝터에 부착된 압축 공기 탱크의 가스 밸브를 엽니다. 가스 전달이 약 60 psi가 될 때까지 탱크 레귤레이터를 조정합니다.
4. 마이크로 인젝터에서 화면이 균형이표시 될 때까지 모드를 누릅니다. 균형을 누르고 컴퓨터 마우스를 작동 테이블에 놓습니다. 인젝터의 '채우기/출력'에 부착된 튜브에 스테인리스 스틸 파이펫 홀더를 연결합니다. 이 튜브는 항상 인젝터에 연결됩니다.
5. 피펫 홀더의 다른 쪽 끝에 모세관 바늘을 삽입하여 바늘 주위의 파이펫 홀더 커넥터를 단단히 나사로 고정시하십시오.
6. 안과 현미경을 켜고 빛을 50 %의 강도로 켭니다. 수술대에 있는 절차 부위에 현미경을 조정하고 원하는 초점으로 현미경을 조정합니다.
7. 절차가 시작되기 전에 페달 철수 반사를 테스트하여 마우스가 적절하게 마취되어 있는지 확인합니다. 마취를 위해 IACUC 승인 프로토콜을 따라야합니다.
8. 마취된 마우스를 오른쪽을 가리키고 왼쪽에 기대어 있는 의료 언더패드에 놓습니다.
9. 안과 현미경을 통해 마우스의 오른쪽 눈을 보고 주사부위(도 3C)를노출시키기 위해 눈의 양쪽에 역작용 집게의 집게를 열어 뚜껑을 열어 뚜껑을 열어 보세요.
10. 마이크로인젝터(도3D)에연결된 마우스 패드를 왼쪽으로 클릭하여 200 CFU/μL 희석으로 모세관 바늘을 채웁니다.
11. 동물의 머리를 왼손으로 고정하고 바늘 끝을 눈의 림다리에 놓습니다. 바늘이 벨 업 위치와 45° 각도로 마우스 눈을 뚫고 주입 할 때 바늘 (~0.5 mm)의 날카로운 끝만 삽입되도록하십시오.
12. 바늘 팁이 삽입되면 마우스 헤드에서 마우스 패드로 왼손을 이동하고 마우스 패드를 마우스 로 클릭하여 B. 세루크 희석의 0.5 μL을 주입합니다. 누출을 방지하기 위해, 제거하기 전에 2-3 초 동안 마우스 눈 안쪽에 바늘 끝을 두고(그림 3E)^{1,19,26,27,32,34,36,37, 38.}
13. 집게를 풀어 놓고 마우스를 온난화 패드에 앉아있는 케이지에 넣습니다. 마취(그림 3F)에서회복될 때까지 이러한 마우스를 모니터링합니다.
14. 마우스가 마취에서 회복되면 케이지를 적절한 랙으로 되돌려 놓습니다. 마우스가 전하로 망막 기능 분석을 받게 된다면, 케이지는 적절한 어두운 적응을 위해 어두운 방으로 돌아와야 한다.

5. 튜브 준비 수확

1. 1mm 멸균 유리 구슬을 1.5mL 나사 캡 튜브에 넣습니다.
2. 건조한 환경에서 자동 복제로 이 튜브를 살균합니다. 사용하기 전에 튜브를 실온으로 식힙니다.
3. 멸균 15mL 원심분리기 튜브에 멸균 인산염 완충식식염(PBS)의 10mL를 추가합니다.
4. 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛 1정을 튜브에 넣습니다. 19,^{27,29,34,35를}소용돌이시켜 섞는다.
5. 각 오토클레이브 수확 튜브에 프로테아제 억제제가 함유된 1x 인산염 완충식염(PBS)의 파이펫 400 μL. 튜브에 라벨을 부착하고 얼음 위에 놓습니다. (그림4A).

6. 눈을 수확

1. 바이오 세이프티 레벨 2 조건하에서 이 섹션의 모든 절차를 수행합니다.
2. CO₂ 흡입으로 마우스를 안락사시합니다. 보조 방법을 사용하여 안락사를 확인합니다.
3. 안락사 된 마우스 머리를 안전하게 잡고 감염된 눈의 양쪽에 미세 팁 집게를 엽니 다. 머리 쪽으로 아래로 밀어 눈을 전파합니다. 집게가 눈의 세계 뒤에 있으면 집게를 함께 짜냅니다. 눈알(도4B)을분리하기 위해 머리에서 집게를 당깁니다.
4. 즉시 안구를 라벨이 붙은 수확 튜브에 넣습니다. 60분 이상 얼음 위에 튜브를놓습니다(그림 4C).

7. 안구 세균 수

1. 바이오 세이프티 레벨 2 조건하에서 이 섹션의 모든 절차를 수행합니다.
2. 모든 수확튜브가 단단히 닫혀 있고 조직 균질화(도5A)에있는 동안 균형을 이루는지 확인합니다. 시료를 균질화하기 위해 1 분 동안 조직 균질화를 켭니다. 30초 동안 기다린 다음 1분 동안 켭니다. 얼음에 튜브를 놓습니다(그림 5B, C).
3. 동형모의 20 μL을 멸균 1x PBS의 180 μL로 순차적으로 전송하여 각 샘플을 10배 연속적으로 희석시 합니다. ^10-7의 계수에 도달할 때까지 희석하십시오(그림5D).
4. 적절한 희석 계수와 함께 따뜻한 정사각형 BHI 플레이트의 각 행에 레이블을 지정합니다. 각 희석의 10 μL을 연속으로 약 45°기울어진 상단 BHI 플레이트로 옮기습니다. 샘플이 거의 플레이트의 바닥에 도달 할 때까지 실행한 다음 플레이트를 평평하게 놓습니다(그림 5E)^39.
5. 샘플이 BHI 한천에 흡수되면 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮기합니다. 식민지는 인큐베이터에 배치 된 후 8 h를 볼 수 있어야합니다.
6. B. 세레우스 식민지의 성장 전에 인큐베이터에서 플레이트를 제거하여 개별 식민지를 식별하는 데 방해가된다(도 5F).
7. 샘플의 농도를 정확하게 표현하기 위해 10-100 개의 식민지 가있는 행을 계산하십시오. 예를 들어, 45개의 콜로니가 있는^10-4의 희석 분획이 있는 행은 4.5 x 10⁵ CFU/mL의 농도를 갖습니다.
8. 눈당 총 세균 수를 계산하려면, 눈을 균질화하는 데 사용되는 1x PBS의 밀리리터 부피를 나타내는 농도를 0.4로 곱한다. 예를 들어, 4.5 x 10⁵ CFU/mL 농도는 눈당 1.8 x 10⁵ CFU B. 세루로 변환됩니다.

8. 샘플 보존

1. 라벨이 부착된 냉동고 상자에 균질화 샘플을 넣고 이 상자를 -80°C 냉동고에 넣습니다. 이러한 샘플은 나중에 ELISA에 의한 염증 성 중재자 분석을 위해 사용될 수 있다.

결과

인트라비탈 주사 절차의 재현 가능한 접종과 정확도를 생성하는 것은 미생물 내과막염의 모델을 개발하는 데 있어 중요한 단계입니다. 여기에서, 우리는 그람 양성 바실러스 세레우스를사용하여 인트라비티리얼 주입 절차를 시연했습니다. 우리는 5 개의 C57BL6 마우스의 중간 유리체에 B. cereus의 100 CFU/0.5 μL를 주입했습니다. 10 시간 후 소독 후, 우리는 약 1.8 x 10⁵ CFU / 눈으로

토론

강력한 항생제, 항염증제 및 비트레절제술 수술의 가용성에도 불구하고 세균성 내과염은 환자를 눈멀게 할 수 있습니다. 임상 연구는 폐막염을 연구하는 데 유용했습니다. 그러나, 폐염의 실험 모형은 환자를 위한 더 나은 시각적 결과의 결과로 배려의 표준에 있는 진행으로 번역될 수 있는 신속하고 재현가능한 결과를 제공합니다.

마우스 눈의 유리체 부피는 약 7 μL

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA