뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

요약

이 프로토콜은 마우스의 심장과 폐를 탈세포화하는 것을 목표로합니다. 생성된 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드는 면역염색및 이미지화되어 구성요소의 위치와 토폴로지를 매핑할 수 있다.

초록

우리는 여기에 마우스 심장과 폐에 대한 탈세포화 프로토콜을 제시합니다. ECM 토폴로지 및 컴포지션을 분석하는 데 사용할 수 있는 구조적 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 그것은 탈세포 에이전트로 심혼 과 폐를 퍼퓨퓨어하기 위하여 안락사 마우스의 기관 및 대오르타를 카테터로 케이터터로 디자인된 미세 외과 절차를 기반으로 합니다. 탈세포화된 심폐 복합체는 구조적인 ECM 단백질의 위치를 밝히기 위하여 그 후에 면역염색될 수 있습니다. 전체 절차는 4 일 이내에 완료 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 발생하는 ECM 스캐폴드는 치수 왜곡이 없습니다. 세포의 부재는 3D에서 서브 미칸 해상도에 ECM 구조의 구조적 검사를 가능하게한다. 이 프로토콜은 섬유증과 암의 마우스 모델을 포함하여 4 주 된 어린 쥐로부터 건강하고 병에 걸린 조직에 적용 될 수 있으며, 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 결정하는 방법을 열어.

서문

ECM은 다세포 유기체의 모든 세포를 수용하는 단백질과 글리칸으로 만든 3차원 네트워크로, 장기에게 모양과 세포 거동을 평생 동안 조절합니다¹. 계란 수정에서, 세포는 ECM을 구축하고 리모델링하고, 차례로 엄격하게 그것에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜의 목적은 마우스가 포유류 병리학학에서 가장 많이 사용되는 모델 유기체이기 때문에 마우스 ECM을 분석하고 매핑하는 방법을 여는 것이다.

이 방법의 개발은 전이 연관된 네이티브 ^ECM2의 특성화 및 분리의 필요성에 의해 주도되었다. 종양이 적당한 해부학 혈관화가 부족하고 마우스는 상대적으로 작은 유기체이기 때문에, 미세 외과 적 절차는 종양으로 이어지는 주요 혈관의 순환을 분리하면서 대동맥을 역행하도록 설계되었으며,이에 따라 시약 흐름에 초점을 맞추고 종양 탈세포화를 허용합니다. 이 방법은 면역 스테인드 및 이미지화 할 수있는 보존 된 구조²를 가진 ECM 스캐폴드를 생성하여 서브미칸 세부 사항으로 ECM 구조 매핑을 허용합니다. 이 프로토콜을 수행하기 위해, 그것의 사용에 잠재적인 한계를 나타낼 수 있는 외과 및 미세 수술 기술 (해부, 미세 주입 및 카테터화)를 취득할 필요가 있습니다. 우리의 지식에, 이 방법은 네이티브 ECM 구조 이미징 분석을 위한 최첨단을 나타냅니다^2,3.

프로토콜

여기에 포함 된 모든 절차는 코펜하겐 대학의 실험 의학을 규제하는 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었으며 덴마크 및 유럽 법률에 동의합니다. 이 프로토콜을 보여주기 위해, 우리는 나이의 8-12 주의 암컷 BALB/cJ 마우스및 11주의 MMTV-PyMT 여성 마우스를 사용했습니다.

참고: 탈세포화된 ECM 스캐폴드의 세균 오염을 피하면 최고의 이미징 결과를 제공하고 장기적인 샘플 저장이 가능합니다. 따라서 모든 단계를 멸균하는 것이 중요합니다. 따라서 봉합사, 마이크로 봉합사, 용액, 튜브, 루어 커넥터 및 카테터를 포함한 모든 기기 및 수술 재료는 멸균되어야합니다. 폴리스티렌 트레이를 포함한 표면은 70% 에탄올로 소독되어야 하며, 관류는 바람직하게는 라미나르 플로우 후드 하에서 수행되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한 모든 절차는 실온에서 진행됩니다.

1. 사후 미세 수술

1. CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시합니다.
   1. 마우스를 4L 챔버에 넣고 0.2 L/min부터 2분 동안 100% _CO2로 채우기 시작하여 3분 후 0.8 L/min의 흐름에 도달할 때까지 증가합니다. 마우스는 처음 2 분 동안 의식이 떨어지면 호흡이 중단되어야합니다 (일반적으로 약 5 분, 그러나 흐름은 필요에 따라 유지 될 수 있습니다). 다음 단계로 진행하기 전에 사망을 확인합니다.
2. 흉부, 복부 및 마우스 뒷면을 모발 클리퍼로 면도하고 70 %의 에탄올로 소독하십시오. 면도는 이미징 또는 생화학 적 분석을위한 샘플에 머리카락이 존재하기 때문에 유물의 수를 크게 줄입니다.
3. 마우스를 폴리스티렌 트레이에 고정하여 앞다리와 뒷다리뿐만 아니라 머리와 꼬리를 확장합니다. 미세 수술 현미경 아래에 놓습니다.
4. 마요 직선 패턴 가위를 사용하여 하복부 부위에서 하복부로 흐르는 큐탄 절개를 사용하여 외과적 접근을 설정하고 흉부 벽과 복막을 노출하기 위해 피하부 피하한다.
5. 미세 수술 가위를 사용하여 흉부 벽의 양쪽에 있는 여섯 번째 늑간 공간을 따라 가슴 흉부 전공 및 가슴 경 경미한 근육을 잘라.
6. 직선 패턴 가위를 사용하여 이전 절개를 따라 흉골을 자른 다음 긴 축을 따라 흉골을 절단한 다음 흉부 벽의 양쪽을 상승시키고 고정하여 심폐 복합체를 노출시킵니다.
7. 둥근 팁 마이크로 포셉 (또는 Dumont 마이크로 집게)을 사용하여 흉선과 주변 지방 조직을 섬세하게 분리하여 부착물을 제거합니다. 이것은 주요 선박을 공개합니다.
8. 소생을 사용하여 내림차리 정맥을 소작하고 직선 패턴 가위를 사용하여 식도를 자른다.
9. 날카로운 마이크로 포셉을 사용하여, brachiocephalic 정맥과 brachiocephalic을 분리, 일반적인 경동맥을 왼쪽 및 결찰 및 소작을 용이하게하기 위해 기본 조직에서 subclavian 동맥을 왼쪽.
10. 마이크로 바늘 홀더를 사용하여, 날카로운 마이크로 집약과 9-0 봉합사 장소 바늘은 brachiocephalic의 출현 위에 바늘, 일반적인 경동맥을 왼쪽 및 왼쪽 subclavian 동맥.
11. brachiocephalic 정맥을 소생.
12. 중간선을 따라 침샘을 분리하여 목 근육과 기관지를 노출시합니다. 근육을 분리하여 갑상선 인대를 노출시하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 인대를 단면으로 입구를 엽니다.
13. 기관지에 27 G 카테터를 소개하고 기관지나뭇가지가 기관지(예: 카테터에 대한 저항이 충족될 때까지 3mm 후퇴)까지 섬세하게 밀어 넣습니다. 기관지 의 방해하지 않도록주의하십시오. 6-0 봉합사를 사용하여, 카테터를 확보하기 위해 기관 주위에 3 바늘을 놓습니다.
14. 12 흉부 척추의 높이에서 마우스를 절제합니다. 내림차순 대동맥은 척추에 앞쪽으로 실행되며 척추와 함께 여기에 단면해야합니다. 하반부 반쪽을 따로 설정합니다.
15. 대동맥을 역행하여 대동맥에 도달할 때까지 카테터를 밀어 넣습니다. 9-0 봉합사를 사용하여 카테터 팁 아래 5mm부터 대오르타 주변에 4 개의 바늘을 놓습니다.

2. 세포 탈세포화

1. 실리콘 튜빙과 루어 커넥터를 사용하여 마우스를 펌프 시스템에 연결합니다. 15 분 동안 200 μL / 분에서 탈이온 된 물로 퍼퓨즈하십시오. 탈세포화 중에 이 유량을 유지합니다.
2. 관류제를 탈옥수산나트륨(DOC)을 0.5%로 변경하고 밤새 퍼퓨즈한다.
3. 관류제를 분류제를 탈화된 물에 희석한 도데딜 황산염(SDS) 나트륨0.1%로 변경하고 8시간 동안 퍼퓨즈한다.
4. 24 시간 동안 SDS와 DOC를 씻어 밤새 다이온 된 물로 퍼퓨즈하십시오.
5. 변세포화된 심장과 폐는 곡선 가위를 사용하여 흉부에 부착물을 분리하고 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신과 0.3μM 나트륨 아지드를 4°C에서 12^{주 동안} 보관할 수 있다. 스캐폴드가 생화학적 분석(예를 들어 질량 분석법)에 사용되는 경우 액체 질소에서 동결을 스냅합니다.

3. 면역 염색

1. 이미징 계획: 1차 항체(또는 항체)와 형광공이이차 항체의 조합을 서로 일치시키고 형광 현미경의 레이저 라인에 맞게 결정한다.
2. 6% (v/v) 당나귀 세럼을 포함하는 냉동 튜브에 몰입하여 샘플을 차단 - 3 % (w / v) 소 세럼 알부민 (BSA) 하룻밤.
3. 24 시간 동안 PBS에서 3 % 당나귀 혈청에서 1 차 항체 (또는 항체)로 배양.
4. PBS(PBST)에서 0.05% tween 20으로 매번 1시간 동안 5회 세척합니다.
5. 24시간 PBS에서 3% 당나귀 혈청에서 형광으로 공주된 이차 항체(또는 항체)로 샘플을 배양한다.
6. 0.05%(PBST)로 1시간 동안 5회 세척합니다. 각 세척 사이에 1h를 기다립니다.
7. 탈이온된 물을 넣고 직접 조명으로부터 4°C 떨어진 곳에 보관하십시오. 이 시점에서 스캐폴드는 이미지할 준비가 되어 있습니다.

4. 이미징

1. 샘플을 유리 바닥 접시에 넣고 두 방울의 저장 액수 (PBS 또는 탈온 화 된 물)로 가습하십시오.
2. 목표를 준비합니다. 물 침지 목표를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 형광광을 사용하여 샘플을 검사합니다.
4. 컴퓨터 제어로 전환합니다. 레이저를 켜고 레이저 강도, 핀홀 조리개, 검출기 파장, 게인, 해상도 및 줌을 조정합니다. z 스택의 수와 단계 크기를 설정하고 인수를 시작합니다. 조직 침투를 늘리고 빛, 표백 및 조직 손상의 산란을 최소화하기 위해 다광 레이저 여기를 사용하는 것이 좋습니다.

5. 헤마톡시린-에신 염색

1. 안락사 마우스에서 1 폐 엽을 소비합니다.
2. 10mm x 10mm x 5mm 극저온에 놓고 약 500μL의 100μL로 덮습니다.
3. 드라이 아이스 (-70 °C)에 동결하고 그 온도에서 샘플을 유지합니다.
4. 2.5 단계에 따라 가공 된 마우스에서 세포 제거 된 폐 엽 1 개를 소비합니다.
5. 최대 표면적아래로 극저온에 놓고 5.2 단계에서 지정된 대로 OCT 화합물로 덮습니다.
6. 드라이 아이스(-70°C)를 동결하고 그렇지 않으면 필요할 때까지 샘플을 해당 온도에서 유지합니다. 샘플은 적어도 12 주 동안 저장할 수 있습니다.
7. 섹션 동결 조직 블록 -20 °C는 5 μm 두께와 극저온에서 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 배치하고 -80 ° C에 저장합니다.
8. 공기가 건조 될 때까지 실온으로 슬라이드를 가져 가라 (약 20 분).
9. PBS에 잠시 몰입하고 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에 슬라이드를 몰입하여 수정하십시오. PBS에서 5분 동안 한 번 씻은 다음 증류수로 5분 동안 두 번 씻습니다.
10. 메이어의 헤마톡시린 솔루션에 10분 동안 몰입하십시오. 이번에는 조직 소스 및 얼룩 준비에 따라 최적화 될 수있다.
11. 10 분 동안 흐르는 증류수 아래 코플린 항아리에서 씻으라.
12. 에오신 용액에 7분 동안 담가 두면 됩니다. 이번에는 조직 소스 및 얼룩 준비에 따라 최적화 될 수있다.
13. 에탄올을 50% 찍어 에탄올70% 에탄올에 잠시 담그고, 96% 및 100% 에탄올에서 30초 동안 여분의 에오신과 탈수증을 제거합니다. 자일렌에 여러 번 찍어.
14. DPX 장착 중간 크기의 몇 방울을 바르고 유리 커버슬립을 놓습니다.
15. 슬라이드를 화학 후드 아래에 밤새 건조시십시오.
16. 슬라이드 스캐너에서 슬라이드를 스캔합니다.

결과

심폐 탈세포화
프로토콜을 성공적으로 완료한 후, 대동맥 아크와 같은 부속 조직뿐만 아니라 심장과 폐는 세포가 없습니다. 탈세포화는 ECM 스캐폴드의 헤마톡시린-에오신 염색(도 1)에 의해 검증될 수 있으며, 이는 네이티브 조직과 비교하여 핵의 제거를 보여주는 것이다. 이 비계는 신선한 장기의 치수를 유지하고 그것의 용해할 수 ?...

토론

조직 동요에 기초한 탈세포화 기술은 ECM 구조를 변경하여 ECM 구조 분석에 적합하지 않습니다⁴. 관류 탈세포화는 기관의 대자와 같은 해부학 경로를 사용하여 모세관 침대 또는 말단 폐포에 도달 할 수 있으며 장기 전체에 세포 탈세포화제의 전달을 용이하게합니다. 조직 탈세포화를 위한 zwitterionic, 음이온 및 비이온 세제의 ^{사용은 보고되지만}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L