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요약

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포생성은 심혈관 질환에 대한 정밀 의학에 엄청난 관심을 끌고 있습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 심장 분화는 배아 심장 발달에 필수적인 정의된 신호 경로에 의해 변조됩니다. 2D 및 3D 플랫폼에 대한 수많은 심장 분화 방법은 다양한 효율성과 심근세포 수율로 개발되었습니다. 이러한 방법의 다양성은 따라하기 어려울 수 있기 때문에 이것은 필드 외부 의아해 수사관이있다. 여기서 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 환자 특정 심근 세포의 견고한 생성 및 확장을 정교하게 하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 먼저 비통합 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 고효율 iPSC 재프로그래밍 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 대부분의 인간 iPSC 라인에서 박동하는 심근세포를 강력하게 생성할 수 있는 작은 분자 매개 단층 분화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 확장 가능한 심근세포 팽창 프로토콜은 산업 및 임상 등급 응용을 위해 환자 유래 심근세포를 빠르게 확장할 수 있는 작은 분자(CHIR99021)를 사용하여 도입된다. 결국, 이러한 iPSC-CM의 분자 식별 및 전기 생리학적 특성화를 위한 상세한 프로토콜이 묘사된다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 발달과 줄기 세포 생물학에 대한 제한된 지식을 가진 초보자를 위한 실용적일 것으로 기대합니다.

서문

인간 유도 만능 줄기 세포의 발견은 현대 심장 혈관 의학1,2에혁명을 일으켰습니다. 인간 iPSCs는 심근세포, 내피 세포, 매끄러운 근육 세포 및 심장 섬유아세포를 포함하여 심장에 있는 모든 세포 모형을 자기 갱신하고 생성할 수 있습니다. 환자 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)는 유전적으로 상속가능한 심혈관 질환(CVDs)을 모델링하고 신약에 대한 심장 안전성 검사를 위한 무기한 자원역할을 할 수있다. 특히, 환자 iPSC-CM은 긴 QT 증후군4 및 확장된 심근병증(DCM)5와같은 심근세포의 결함에서 파생된 CVD의 유전적 및 분자 병각을 잘 조사할 태세입니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집과 결합된 환자 iPSC-CM은 선천성 심장 결함(CHDs)6,7,8을포함한 CVD의 복잡한 유전적 기초를 이해하는 전례 없는 길을 열었습니다. 인간 iPSC-CM은 또한 심장 마비 도중 손상된 심근을 보충하기 위한 자가 세포 근원역할을 하는 잠재력을 전시했습니다9. 최근에는 심장 재생 및 약물 검사를 위한 정의된 하위 형(심방, 심실 및 노달)을 가진 고품질 인간 iPSC-CM을 생성하는 것이 가장중요해졌습니다.

인간 iPSC에서 심장 분화는 지난 10 년 동안 크게 진보되었습니다. 분화 방법은 배아 체(EB)기반의 자발적 분화에서 화학적으로 정의되고 지시된 심장분화(11)로갔다. Wnt, BMP, Nodal 및 FGF와 같은 배아 심장 발달에 필수적인 주요 신호 분자는 인간 iPSC10,12로부터심근구 분화를 향상시키기 위해 조작된다. 중요한 진보는 인간 iPSCs13,14에서심근세포의 견고한 생성을 위한 Wnt 신호 (억제 에 선행된 활성화)의 순차적변조를포함한다. 화학적으로 정의된 심장 분화 레시피는 산업 및 임상 수준의 생산으로 업그레이드될 가능성이 있는 심근세포15,16을치는 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 탐구되었습니다. 더욱이, 초기 인간 iPSC-CM의 강력한 확장은 작은 화학물질(CHIR99021)17을이용하여 구성적인 Wnt 활성화에 노출함으로써 달성된다. 가장 최근에는, 아류형 특이적 심근세포는 인간 iPSC18,19,20,21,22의심근세포 계보 약정 동안 특정 분화 창에서 망막산(RA) 및 Wnt 신호 경로의 조작을 통해 생성된다.

이 프로토콜에서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 유래하는 인간 적인 CM의 견고한 생성 그리고 증식을 위한 작동 절차를 상세히 설명합니다. 우리는 1) 인간 PBMC를 iPSC로 재프로그래밍하는 프로토콜, 2) 인간 iPSC에서 심근세포를 치고, 3) 초기 iPSC-CM의 급속한 확장, 4) 인간 iPSC-CM의 분자 특성화, 및 5) 단일 세포 수준에서 인간 iPSC-CM의 전기 생리학적 측정을 패치 에 의해 제시한다. 이 프로토콜은 환자 혈액 세포를 심장 구균세포를 구타로 변환하는 방법에 대한 상세한 실험 절차를 다룹니다.

프로토콜

인간 과목에 대한 실험 프로토콜 및 정보에 입각한 동의는 전국 아동 병원의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.

1. 세포 배양 매체, 솔루션 및 시약 의 준비

  1. PBMC 미디어 준비
    1. 기초 PBMC 문화 매체 (1 x)와 0.52 mL의 기초 PBMC 문화 매체의 20 mL을 혼합하십시오. 각각 20μL의 SCF및 FLT3(스톡 농도: 100 μg/mL), IL3, IL6 및 EPO4 μL(재고 농도: 100 μg/mL) 및 L-글루타민 대안(100x)의 200 μL을 추가합니다. 그들을 철저히 섞는다. 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 멸균 후드를 필터링합니다. 이 이름을 완전한 혈액 미디어로 지정합니다.
    2. 기초 PBMC 문화 매체(1x)와 0.52mL의 기초 PBMC 배양 매체(1x)와 0.52mL의 보충제를 혼합합니다. L-글루타민 대체(100x)의 200 μL을 추가합니다. 그들을 철저히 섞는다. 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 필터링합니다. 이 이름을 혈액 보조 자료로 지정합니다.
  2. 완전한 E8 미디어 준비
    1. E8 기저형 미디어 500mL와 10mL의 E8 보충제(4°C에서 하룻밤 동안 해동)를 혼합하여 완전한 E8 미디어를 만듭니다. 사용하기 전에 실온 (RT)에 평형.
  3. iPSC 패시징 미디어 준비
    1. Y-27632 록 억제제(1:5,000 희석, 재고 농도: 10mMM)의 40μL을 완전한 E8 미디어의 200mL에 추가합니다. 그것을 완전히 섞습니다. 사용하기 전에 RT에 평형.
  4. 심근세포 분화 미디어 준비
    1. 미디어 I: 혼합 500 RPMI1640와 함께 10 mL 의 B27 마이너스 인슐린 보충 (50 x).
    2. 미디어 II: 미디어 I(CHIR99021 최종 농도 6μM)에 CHIR99021(GSK3 억제제) 스톡의 적절한 부피를 추가합니다. 완전히 섞으세요.
    3. 미디어 III: 미디어 I(IWR-1 최종 농도 5μM)에 적절한 양의 IWR-1(Wnt 억제제) 스톡을 추가합니다. 완전히 섞으세요.
    4. 미디어 IV: 500mL의 RPMI1640을 B27 보충제(50x)와 혼합합니다. 완전히 섞으세요.
    5. 미디어 V: 500mL의 RPMI1640(포도당 없음)과 B27 보충제(50x)의 10mL를 혼합합니다. 완전히 섞으세요.
    6. 미디어 VI: 미디어 IV(CHIR99021 최종 농도 2 μM)에 CHIR99021 스톡의 적절한 부피를 추가합니다. 완전히 섞으세요.
  5. iPSC-CM 패세이징 미디어 준비
    1. 90mL의 미디어 IV(KSR 최종 농도: 10%)에 녹아웃 세럼 교체(KSR)를 10mL추가합니다. 잘 섞으세요.
  6. iPSC-CM 동결 미디어 준비
    1. KSR9mL에 1mL의 DMSO를 추가하고(최종 농도: 10% DMSO/90% KSR)를 넣고 잘 섞는다.
  7. 지하 멤브레인 매트릭스 중간 코팅 플레이트 준비
    1. 지하 멤브레인 매트릭스 배지를 하룻밤 사이에 4°C, 알리쿼트에서 1.5mL 튜브로 해동한다. DMEM/F12 미디어(1:250 희석)의 250mL에 이 매체의 1mL을 추가하고 이를 철저히 혼합합니다. 6웰 플레이트에 잘 당 2mL의 희석용액을 적용하고 사용하기 전에 30분 동안 37°C에서 5%CO2로 배양한다.

2. PBMC의 iPSC 리프로그래밍

  1. 혈액 샘플에서 PBMC를 분리합니다.
    1. 환자 혈액 샘플 (~5mL)을 수집하고 혈액 세포 분리 튜브로 전달합니다(재료 표참조). 10x반전으로 섞는다.
    2. 원심분리기는 실온에서 30분 동안 1,500 x g의 원심분리기.
    3. 튜브를 조심스럽게 꺼내 70% 에탄올로 스프레이하세요. 생물 안전 후드 에서 단핵 세포 (버피 층)를 방해하지 않고 캡을 제거하십시오. PBMC는 플라즈마 층 바로 아래에 희끄럼파 층에있을 것입니다(도 1A). 1000 μL 파이펫을 사용하여 전체 버피 층을 수집하고 15mL 원문 튜브로 옮김합니다.
    4. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 계산합니다. RT에서 25분 동안 300 x g로 튜브를 회전시하십시오.
    5. 상부체를 폐기합니다. DPBS 10mL (Ca2 +/ Mg2 + 무료)로 세척하십시오.
    6. RT에서 15 분 동안 300 x g에서 튜브를 회전합니다.
    7. 상부체를 제거합니다. 동결 매체의 1mL에서 세포 펠릿을 재중단(KSR + 10% DMSO). 유리병 당 1 x 106 세포를 만들기 위해 세포 밀도를 조정합니다.
    8. PBMC 극저온을 세포 동결 용기에 넣고 하룻밤 동안 -80°C로 보관하십시오. 액체 질소 탱크로 이송하여 다음 날 장시간 보관합니다.
  2. iPSC 리프로그래밍.
    1. 15mL 원물 튜브에 3mL의 혈액 보조 혈액 미디어를 추가합니다. 37°C 수조에서 PBMC를 해동하고 원물 튜브로 옮기다. RT에서 7 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
    2. 상부체를 폐기합니다. 완전한 혈액 매체로 PBMC를 재중단합니다. 24 개의 잘 조직 배양 플레이트 (지하 막 매트릭스 없음)의 두 개의 우물로 시드하십시오.
    3. 하룻밤 사이에 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오. 다음 날 부드럽게 이전 미디어의 절반을 제거 (0.5 ml) 신선한 완전 혈액 미디어의 0.5 mL을 추가합니다.
    4. 오래된 미디어의 절반을 새로 고침하여 격일로 미디어를 변경합니다.
    5. 일주일 후, 적극적으로 보충 혈액 미디어의 1 mL와 함께 잘 씻어 15 mL 원심 분리 튜브로 세포를 전송.
    6. 셀 번호를 계산합니다. 2 x 105 셀과 원심 분리기를 300 x g에서 7 분 동안 복용하십시오.
    7. 상부체를 폐기합니다. 완전한 혈액 매체의 300 μL로 세포를 재중단합니다. 제조업체의 지침에 따라 센다이 바이러스 재프로그래밍 벡터의 적절한 볼륨을 추가하여 트랜스페션을 수행합니다. 24웰 플레이트(지하 멤브레인 매트릭스 없음)의 한 우물로 옮기. 하룻밤 사이에 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
    8. 다음날 은 300 x g에서 7 분 동안 회전합니다. 상체를 제거하고 완전한 혈액 미디어의 2 mL에서 다시 중단하십시오. 지하 멤브레인 매트릭스로 미리 코팅 된 6 웰 플레이트의 우물로 옮김하십시오. 이것은 1 일 (D1)입니다.
    9. 다음날 접시를 만지지 마십시오.
    10. D3에서 이전 미디어의 1mL를 제거합니다. 보충 혈액 미디어의 1 mL을 추가합니다.
    11. D5에서 2.2.10 단계를 반복합니다.
    12. D7에서 이전 미디어의 1mL을 제거합니다. 완전한 E8 미디어의 1mL를 추가합니다.
    13. D8에서 반복 단계 2.2.12.
    14. D9에서 이전 미디어를 제거합니다. 완전한 E8 미디어의 2mL를 추가합니다. 완전히 다시 프로그래밍 된 세포는 식민지형성을 연결하고 시작할 것으로 예상됩니다.
    15. 매일 2mL의 완전한 E8 미디어로 새로 고칩니다.
    16. 센다이 바이러스 트랜스퍼션 후 약 2주 후, 대형 iPSC 식민지가 나타나고 따기 위한 준비가 되어 있습니다.
    17. 후드의 스테레오현미경으로 iPSC 콜로니를 자르고 개별 식민지를 0.5mL의 iPSC 패시징 미디어로 미리 장전된 지하 막 매트릭스 코팅 24웰 플레이트로 이송합니다.
    18. iPSC 콜로니가 새로운 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트로 통과할 만큼 충분히 커질 때까지 매일 0.5mL의 완전한 E8 미디어로 새로 고침하십시오.

3. 인간 iPSC 유지 보수 및 패시징

  1. 인간 iPSC가 90% 이상의 인플루엔자에 도달하면 오래된 미디어를 제거합니다. DPBS의 3mL한 번 헹구기.
  2. DPBS 솔루션에 0.5mM EDTA의 1mL를 추가합니다. 5-8 분 동안 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
  3. 포부로 EDTA를 제거합니다. iPSC 패싱 미디어 1mL을 추가합니다. 수동으로 iPSC를 빼내기.
  4. 단일 셀 서스펜션의 600-900 μL을 가지고 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트에 다시 판화 (희석 : 1:6 받는 사람은 1:10). 하룻밤 사이에 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
  5. 매일 2mL의 완전한 E8 미디어로 새로 고칩니다. iPSC 문화권은 일반적으로 3-4일 후에 합류에 도달합니다.

4. 화학적으로 정의된 심근세포 분화

  1. 문화 인간 iPSC는 완전한 E8 미디어에서 95 %의 컨실수 (3-4 일)까지.
  2. 이전 미디어를 제거합니다. CM 분화 미디어 II(RPMI1640의 6 μM CHIR+ B27 마이너스 인슐린 보충제)를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이것은 D0입니다. D1에 만지지 마십시오.
  3. D2에서 CM 분화 미디어 I (RPMI1640 + B27 마이너스 인슐린 보충제)의 2 mL로 대체하십시오.
  4. D3에서 CM 분화 미디어 III의 2mL로 교체하십시오 (RPMI1640에서 5 μM IWR-1 및 B27 마이너스 인슐린 보충제)로 바꿉니다. D4에 만지지 마십시오.
  5. D5에서 CM 분화 미디어 I의 2mL로 교체하십시오.
  6. D7에서 CM 차별화 미디어 IV(RPMI1640 + B27 보충제)의 2mL로 교체하십시오. 그 후, 매일 미디어를 새로 고칩니다.
  7. D11에서 수축 세포가 관찰될 때, CM 분화 미디어 V의 2mL로 대체하십시오(포도당 없음).
  8. D13에서 CM 차별화 미디어 V의 2mL로 교체하십시오.
  9. D15에서 CM 분화 미디어 IV의 2mL로 교체하십시오.
  10. D17-D21에서는 매일 CM 분화 미디어 IV2mL로 교체하십시오.

5. 통로 인간 ipPsC-CM

  1. 오래된 미디어를 제거하고 DPBS의 3mL로 세포를 헹구는 경우 한 번.
  2. CM 해리 솔루션 1mL(재료 표참조)를 6웰 플레이트의 각 웰에 적용합니다. 5-8 분 동안 37 °C에서 5 % CO2에서 배양하십시오.
  3. iPSC-CM을 격렬한 파이펫팅으로 기계적으로 단일 셀로 분리합니다.
  4. 세포를 15mL 원문 튜브로 옮킨다. CM 페이징 미디어 2mL(RMPI1640의 KSR 10% 플러스 B27 보충제)를 추가하여 CM 해리 솔루션을 중화합니다.
  5. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
  6. 상부체를 폐기합니다. CM 패세이징 미디어의 원하는 부피로 셀을 다시 중단합니다. 지하실 막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시에 그들을 씨앗. 인간 iPSC-CM은 통과 후 1-3 일 구타 재개.

6. 인간 ipC-CM 의 확장

  1. 린세 D10-12는 1회 6웰 플레이트의 각 웰에 대해 DPBS 3mL로 iPSC-CM을 1회 치고 있습니다. CM 해리 솔루션 1mL(5.2단계)를 추가합니다. 7-10 분 동안 37 °C에서 5 % CO2에서 인큐베이션하십시오.
  2. iPSC-CM을 격렬한 파이펫팅으로 기계적으로 단일 셀로 분리합니다.
  3. 세포를 15mL 원문 튜브로 옮킨다. CM 페이징 미디어를 2mL에 추가하여 CM 해리 솔루션을 중화합니다.
  4. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
  5. 상부체를 폐기합니다. CM 패세이징 미디어의 적절한 부피로 세포를 다시 중단합니다. 파이펫을 위아래로 사용하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 100만 개의 iPSC-CM을 지하 막 매트릭스 코팅 10cm 접시에 넣습니다.
  6. 다음 날 오래된 미디어를 제거합니다. 심근세포 증식 매체 10mL를 추가합니다(미디어 VI: 2 μM CHIR99021). 매일 미디어를 변경합니다.
  7. iPSC-CM이 7-9일 간의 문화 이후 혼잡해지면 iPSC-CM의 추가 확장을 위한 통과 단계를 반복합니다.

7. 면역형광

  1. 면역 형광 염색 하기 전에, 씨앗 iPSC-CM 에 지하 막 매트릭스 코팅 커버립 24 웰 플레이트에 배치 되는 (파 종 밀도: 0.5-1 x 106 세포/mL). 적어도 4 일 동안 문화권에서 iPSC-CM을 유지관리합니다.
  2. DPBS 1mL을 사용하여 셀을 한 번 세척합니다.
  3. 4% 파라포름알데히드(PFA)의 0.5mL를 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
  4. DPBS 의 1 mL를 사용하여 셀을 세척합니다. 한 번 반복합니다.
  5. 0.5mL00% 트리톤 X-100을 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
  6. DPBS 1mL로 두 번 세척합니다.
  7. DPBS(차단 솔루션)에 0.2% BSA의 0.5mL를 추가합니다. 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션.
  8. 차단 용액으로 희석된 1차 항체의 200 μL을 추가합니다(희석: 1:400-1:1000). 하룻밤 동안 4 °C에서 배양하십시오.
  9. 흔들림으로 3 분 동안 블로킹 용액의 0.5 mL을 사용하여 셀을 씻으시다. 두 번 반복합니다.
  10. 차단 용액에 희석된 이차 항체의 200 μL을 추가합니다. 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션.
  11. DPBS의 0.5 mL로 세 번 헹구고, 각각 3 분 동안 흔들어.
  12. DAPI를 가진 카운터스테인 핵 (1:2000 희석) RT에서 5 분 동안 배양.
  13. DPBS의 0.5 mL로 세 번 헹구는 세포.
  14. 커버스 에 셀을 마운트하여 5 μl의 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 장착합니다. 4 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.

8. 유동 세포측정 샘플 준비

  1. 한 번 DPBS의 3 mL로 인간의 iPSC-CM을 세척합니다.
  2. CM 해리 용액 1mL을 넣고 7-10분 동안 37°C에서 5% CO2로 배양합니다.
  3. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 세포를 빼내게 합니다. 스트레이너 캡을 통해 셀 서스펜션을 둥근 FACS 튜브로 전송합니다. FACS 튜브는 효소 활성을 중화시키기 위해 iPSC-CM 패세징 미디어(10% KSR)의 1mL로 미리 채워집니다.
  4. 300 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
  5. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하십시오. 고정/침투화 솔루션 250μL을 추가합니다(재료 표 참조). 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
  6. 파름/워시 버퍼 1mL를 추가합니다. 소용돌이를 짧게 하고 300 x g에서 4분 동안 회전합니다.
  7. 상부체를 폐기합니다. 1x 파마/워시 버퍼에 희석된 1차 항체(1:200-1:500)를 100 μL을 추가합니다. 소용돌이는 4 °C에서 하룻밤 동안 잠깐 배양하고 배양합니다.
  8. 파름/워시 버퍼 1mL를 추가하여 셀을 세척합니다. 소용돌이를 짧게 하고 300 x g에서 4분 동안 회전합니다.
  9. 상부체를 폐기합니다. 희석된 이차 항체의 100 μL을 추가합니다(1:500-1:1,000). 소용돌이는 RT에서 1시간 동안 잠깐 배양하고 배양합니다. 이차 항체가 빛에 민감한 형광으로 결합되는 경우 빛으로부터 보호하십시오.
  10. 파름/워시 버퍼 1mL를 추가하여 셀을 세척합니다. 소용돌이를 짧게 하고 300g에서 4분 동안 회전합니다.
  11. 상부체를 폐기합니다. FACS 염색 버퍼(PBS/4% FBS)의 400 μL로 셀을 다시 중단합니다. FACS 기기에 적재될 때까지 4°C에 보관하십시오.

9. 실시간 qPCR

  1. 인간 iPSC-CM 문화에서 오래된 미디어를 제거합니다. 용해 버퍼500-700 μL을 추가하여 셀을 용해합니다. RT. Scape 셀 용해에서 3 분 동안 배양하고 1.5ml RNase가없는 튜브로 옮김하십시오. 총 RNA 추출을 즉시 진행하거나 -80 °C에 저장하십시오.
  2. 제조 자의 지시에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다.
  3. RNA 농도를 측정하고 분광계에 의한 총 RNA의 품질을 평가합니다.
  4. cDNA 합성 키트를 사용하여 역전사 반응을 수행한다. RT 반응의 총 부피는 반응 혼합 4μL(5x), 역실 제1μL, 총 RNA 및 RNase 없는 물의 1μg을 포함하여 20 μL이다.
  5. 다음 프로토콜을 사용하여 열 사이클러에서 전체 RT 반응 믹스를 배양합니다: 5분 동안 25°C; 20 분 동안 46 °C; 95 °C 1 분; 4 °C에서 유지합니다.
  6. 핵이 없는 물을 사용하여 cDNA를 1:10까지 희석시. cDNA 템플릿 1μL, 프라이머/프로브 1μL, qPCR 마스터 믹스 10μL, 뉴클레아제 없는 물의 8μL을 혼합하여 실시간 qPCR 반응을 설정합니다.
  7. 실시간 PCR 시스템에서 실행됩니다. 사이클링 프로토콜은 50°C 2분(홀드), 95°C 10분(홀드), 95°C 15초, 60°C 1분, 40사이클반복이다.
  8. 각 샘플의 각 유전자에 대한 CT 값을 수집합니다. 상대적인 mRNA 풍부는 가사 유전자의 CT 값으로부터 표적 유전자의 CT 값을 빼서 계산된다. 상대적 유전자 발현은2-ΔΔCT 방법에 의해 분석된다.

10. 전셀 패치 클램프 레코딩

  1. iPSC-CM을 이전에 설명한 바와 같이 CM 해리 솔루션을 사용하여 단일 세포로 해리.
  2. 지하 막 매트릭스 코팅 커버립에 낮은 밀도에서 종자 세포. 미디어 IV에서 3-4 일 동안 문화하십시오.
  3. 수평 미세 전기 전체 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세 혈관에서 파이펫 (저항 0.9-1.5 MΩ)을 당깁니다.
  4. 티로드의 용액(pH=7.35)에서 세포를 배양합니다.
  5. 다음 화학물질로 구성된 전극 용액(pH=7.3)으로 파이펫 채우기: 120mM 아파르트산, 20mM KCl, 2m MM MgCl2,5m HEPES, 10mM NaCl, 5m EGTA, 0.3 mM Na-GTP, 14m 인포크레아틴, 4m K-ATP 및 2mM 크레아틴 인포키나아제.
  6. 1.5-2 확장기 임계값 5 ms 전류 펄스를 사용하여 현재 클램프 모드에 셀을 배치합니다.
  7. 마이크로 전극 증폭기와 소프트웨어 기반 인수 보드를 사용하여 실행 잠재력(AP)을 기록합니다.

결과

PBMC에서 인간 iPSC 리프로그래밍
7일 동안 완전한 혈액 매체를 통해 사전 배양 후, PBMC는 눈에 보이는 핵과 세포질(도1B)으로커져 바이러스 이식에 대한 준비가 되었음을 나타냅니다. 센다이 바이러스 재프로그래밍 인자와 의전 후, PBMC는 또 다른 주 동안 후생 유전학 재프로그래밍 과정을 받게됩니다. 전형적으로, 우리는 1 x 105 PB...

토론

iPSC 재프로그래밍 하는 동안, 그들은 명확한 핵과 세포질로 확대 될 때까지 1 주일 동안 PBMC를 배양하는 것이 중요합니다. PBMC가 증식하지 않기 때문에 바이러스 성 트랜스듀션에 적합한 세포 수는 성공적인 iPSC 재프로그래밍에 중요합니다. PBMC의 세포 수, 감염의 복합성 (MOI) 및 바이러스의 titer는 최적의 트랜스유도 결과에 도달하기 위하여 고려되고 조정되어야 합니다. 심장 분화의 경우 초기 시?...

공개

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 미국 심장 협회 (AHA) 경력 개발 상 18CDA34110293 (M-T.Z.), 추가 벤처 AVIF 및 SVRF 상 (M-T.Z.), 국립 보건원 (NIH /NHLBI) 보조금 1R01HL1HL13225 (1R01HL132520)에 의해 지원되었다. 밍타오 자오 박사는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 스타트업 기금으로도 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMicroelectrode Amplifier
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement minus insulinThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tubeBD Biosciences362753Blood cell separation tube
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermo Fisher ScientificA16517Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200BAxon InstrumentsAcquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050RNA extraction kit
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061L-glutamine alternative
Growth factor reduced MatrigelCorning356231Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891cDNA synthesis
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Molecular DevicesElectrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Recombinant human FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Recombinant human IL3Peprotech200-03
Recombinant human IL6Thermo Fisher ScientificPHC0065
Recombinant human SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medium, no glucoseThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Mounting media
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol redThermo Fisher ScientificA1217703CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC dissociation solution
Y-27632 2HClSelleck ChemicalsS1049

참고문헌

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