Diamond Light Source의 XChem 시설에서 효율적인 Fragment Screening 달성

요약

이 백서는 결정 기반 단편 스크리닝을 위한 전체 XChem 프로세스를 설명하며, 액세스 신청부터 데이터 보급에 이르는 모든 후속 단계를 설명합니다.

초록

단편 기반 약물 발견에서는 ~300Da보다 작은 수백 또는 수천 개의 화합물을 관심 단백질에 대해 테스트하여 강력한 약물 후보로 개발할 수 있는 화학 실체를 식별합니다. 화합물이 작기 때문에 상호 작용이 약하고 따라서 스크리닝 방법이 매우 민감해야 합니다. 더욱이, 구조 정보는 이러한 히트를 납과 같은 화합물로 정교화하는 데 중요한 경향이 있습니다. 그러므로, 단백질 결정학은 항상 황금 표준 기술이었습니다, 그러나 1 차 스크린으로 대폭적인 사용을 찾아내기에는 역사적으로 너무 어려웠습니다.

초기 XChem 실험은 2014년에 시연된 후 학계 및 산업체 공동 연구자들과 함께 프로세스를 검증했습니다. 그 이후로 대규모 연구 노력과 상당한 빔 타임을 통해 시료 전처리를 간소화하고, 신속한 후속 조치가 가능한 절편 라이브러리를 개발하고, 무인 데이터 수집을 위한 I04-1 빔라인의 기능을 자동화 및 개선하고, 데이터 관리, 분석 및 히트 식별을 위한 새로운 도구를 구현했습니다.

XChem은 이제 대규모 결정학적 단편 스크리닝을 위한 시설로, 전체 결정-증착 공정을 지원하며 전 세계 학계 및 산업 사용자가 이용할 수 있습니다. 동료 심사를 거친 학술 사용자 프로그램은 2016년부터 활발히 개발되어 검증된 프로젝트와 탐색 프로젝트를 포함하여 가능한 한 광범위한 과학적 범위의 프로젝트를 수용합니다. 학술적 접근은 동료 심사 제안서에 대한 격년 요청을 통해 할당되며, 독점 작업은 Diamond의 Industrial Liaison 그룹에 의해 주선됩니다. 이 워크플로우는 이미 다양한 치료 분야의 100개 이상의 표적에 일상적으로 적용되고 있으며, 화합물 설계를 위한 고품질 시작점 역할을 하고 결합 부위에 대한 광범위한 구조 정보를 제공하는 약한 결합제(1%-30% 적중률)를 효과적으로 식별합니다. 이 과정의 탄력성은 COVID-19 팬데믹 기간 동안 주요 단백질 분해 효소에 대한 3주 턴어라운드를 포함하여 SARS-CoV-2 표적을 지속적으로 스크리닝함으로써 입증되었습니다.

서문

FBDD(Fragment-Based Drug Discovery)는 선도 물질 발견을 위해 널리 사용되는 전략으로, 25년 전 등장한 이래 4개의 약물을 임상용으로 전달했으며 40개 이상의 분자가 임상 시험에 진출했습니다 ^1,2,3. 단편은 일반적으로 분자량이 300Da 이하인 작은 화학 물질입니다. 화학적 복잡성이 낮기 때문에 선택되며, 이는 우수한 물리화학적 특성을 가진 리간드 효율이 높은 억제제 개발을 위한 좋은 출발점을 제공합니다. 이들의 크기는 더 큰 약물 또는 납 유사 화합물의 라이브러리보다 단백질의 결합 환경을 더 철저하게 샘플링하여 핫스팟과 추정 알로스테릭 부위를 드러낸다는 것을 의미합니다. 구조 정보와 결합된 단편은 단백질과 리간드 사이의 잠재적인 분자 상호 작용에 대한 자세한 지도를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 표적 단백질에 약하게 결합하는 경향이 있는 개체를 안정적으로 검출하고 검증하려면 표면 플라즈몬 공명(SPR), 핵 자기 공명(NMR) 또는 등온 적정 열량측정법(ITC)^4,5과 같은 강력하고 민감한 생물물리학적 스크리닝 방법이 필요합니다.

X선 결정학은 FBDD 툴킷의 필수적인 부분으로, 약한 결합체를 식별할 수 있을 만큼 민감하며 분자 수준에서 상호 작용에 대한 구조 정보를 직접 생성합니다. 그것은 다른 생물 물리학 스크린에 보완적이며 일반적으로 화합물을 선도하는 단편 히트를 진행하는 데 필수적입니다. 이를 위해서는 고품질 결정 시스템이 필요하며, 이는 결정화의 재현성이 높고 결정이 이상적으로 2.8 Å 분해능 이상으로 회절된다는 것을 의미합니다.

역사적으로, 학계나 산업계에서 결정학을 1차 단편 스크리닝 ^6,7,8로 사용하는 것은 매우 어려웠다. 대조적으로, 싱크로트론은 로봇 공학, 자동화9,10,11 및 검출기 기술(12,13)에서 엄청난 개선을 달성했으며, 동등하게 가속화된 컴퓨팅 성능 및 데이터 처리 알고리즘^(14,15,16)과 결합하여 완전한 회절 데이터 세트를 몇 초 만에 측정할 수 있으며 LillyCAT ⁷에서 개척한 것처럼 많은 수의 데이터 세트를 완전히 무인으로 측정할 수 있습니다 그리고 나중에 MASSIF^17,18 (유럽 싱크로트론 방사선 시설 (ESRF)). 이로 인해 싱크로트론은 매우 간소화된 플랫폼을 개발하여 광범위한 사용자 커뮤니티(XChem at Diamond; EMBL/ESRF¹⁹에서의 CrystalDirect; 베를린 헬름홀츠-젠트룸(Helmholtz-Zentrum)의 BESSY²⁰; MaxIV²¹에서 FragMax).

이 논문은 시료 준비부터 3D 모델링 히트의 최종 구조 결과에 이르기까지 X선 결정학에 의한 절편 스크리닝을 위한 XChem 플랫폼을 구성하는 프로토콜을 문서화합니다. 파이프라인(그림 1)은 결정 식별(²²), 담금(23) 및 수확(24)에 대한 새로운 접근법을 개발해야 했으며, 데이터 관리 소프트웨어⁽²⁵) 및 현재 커뮤니티에서 널리 사용되는 단편(²⁶)을 식별하기 위한 알고리즘 접근법을 개발해야 했다. 결정 수확 기술은 현재 한 공급업체에 의해 판매되고 있으며(재료 표 참조), 도구의 개방된 가용성은 다른 싱크로트론이 동등한 플랫폼⁽²¹)을 설정하도록 적응시킬 수 있게 했다. 진행 중인 프로젝트는 Fragalysis 플랫폼²⁷을 통한 데이터 분석, 모델 완성 및 데이터 보급을 다룹니다. 시료 전처리 실험실은 빔라인 I04-1에 인접해 있어 수백 개의 동결 시료를 빔라인으로 옮기는 물류를 단순화하고 I04-1의 전용 빔타임을 통해 신속한 X선 피드백을 통해 캠페인을 안내할 수 있습니다.

XChem은 다이아몬드의 사용자 프로그램의 필수적인 부분으로, 1년에 두 번(4월 초와 10월 초) 호출됩니다. 동료 심사 과정은 학계 및 업계의 신약 개발 전문가와의 협의를 통해 개선되었습니다. 강력한 과학적 사례와 함께, 제안 프로세스²⁸ 은 신청자가 결정계의 준비 상태뿐만 아니라 생화학 및 직교 생물물리학적 방법에 대한 전문 지식과 후속 화학을 통해 스크리닝 히트를 진행할 수 있는 능력을 자체 평가하도록 요구합니다. 액세스 모드는 또한 여러 분야의 사용자 커뮤니티를 수용하기 위해 발전했습니다.

Tier 1(단일 프로젝트 )은 탐색 단계의 프로젝트를 위한 것이며 적중 검증 도구(생물물리학 또는 생화학 도구)이며 후속 전략이 필요하지 않습니다. 승인되면 프로젝트에 개념 증명에 충분한 빔 시간 이동 횟수가 줄어듭니다.

Tier 2(단일 프로젝트) 는 잘 검증된 프로젝트를 위한 것이며 다운스트림 도구 및 후속 전략이 필요합니다. 승인되면 프로젝트에 전체 조각 스크리닝 캠페인을 위한 충분한 빔 시간이 할당됩니다. 단일 프로젝트(티어 1 또는 티어 2)는 할당 기간(4월-9월 또는 10월-3월)의 6개월 이내에 완료되어야 합니다.

블록 할당 그룹(BAG) 은 그룹 및 프로젝트 컨소시엄을 위한 것으로, 명확한 후속 파이프라인과 함께 BAG 내에서 강력한 대상 선택 및 우선 순위 지정 프로세스가 마련되어 있습니다. BAG에는 다이아몬드 직원과 활동을 조정하고 BAG 회원을 교육하는 XChem 교육을 받은 전문가(수퍼유저)가 한 명 이상 있어야 합니다. 할당된 빔타임 시프트 수는 BAG에서 과학적으로 강력한 프로젝트 수로 정의되며 BAG의 보고서를 기반으로 할당 기간별로 재평가됩니다. 액세스는 2년 동안 사용할 수 있습니다.

XChem 실험은 3단계로 나뉘며, 각 단계에 대한 결정 지점은 용매 내성 테스트, 사전 스크리닝 및 메인 화면입니다(그림 2). 용매 내성 테스트는 담금 파라미터, 결정 시스템이 견딜 수 있는 용매(DMSO, 에틸렌 글리콜 또는 필요한 경우 기타 동결 보호제)의 양 및 기간을 정의하는 데 도움이 됩니다. 용매 농도는 일반적으로 최소 두 개의 시점에 걸쳐 5%-30% 범위입니다. 회절 데이터가 수집되어 결정계의 기본 회절과 비교됩니다. 이것은 다음 단계에 대한 담금 매개변수를 결정합니다. 사전 스크리닝의 경우 용매 테스트에서 결정된 조건을 사용하여 100-150개의 화합물을 담그고 그 목적은 결정이 해당 조건에서 화합물을 견딜 수 있는지 확인하는 것입니다. 필요한 경우 동결 보호제를 이미 조각이 들어 있는 방울에 첨가합니다. 성공 기준은 결정의 80% 이상이 양호하고 일관된 품질의 회절 데이터를 생성할 수 있을 만큼 충분히 잘 생존하는 것입니다. 이것이 실패하면 일반적으로 담금 시간 또는 용매 농도를 변경하여 담금 조건을 수정합니다. 성공적인 사전 스크리닝 후 실험을 위해 선택된 나머지 화합물은 최종 파라미터를 사용하여 설정할 수 있습니다.

DSI 포세 라이브러리( 재료 표 참조)는 poised chemistry²⁹ 를 사용하여 신속한 후속 진행을 허용하도록 의도적으로 설계되었으며 시설의 주요 라이브러리였습니다. DMSO에서 500mM 농도로 사용자가 사용할 수 있습니다. 학술 사용자는 또한 DMSO에서 100-500mM 농도로 공동 연구자(총 2,000개 이상의 화합물)가 제공하는 다른 라이브러리에 액세스할 수 있습니다(전체 목록은 웹사이트²⁸에서 찾을 수 있음). 전체 컬렉션의 대부분은 DMSO를 허용하지 않는 결정 시스템을 위해 에틸렌 글리콜로도 제공됩니다. 사용자는 음향 액체 처리 시스템과 호환되는 플레이트에 있는 경우 자체 라이브러리를 가져올 수도 있습니다( 재료 표 참조).

실험의 세 단계(용매 특성화, 사전 스크리닝 또는 전체 스크린)에서 다음 샘플 준비 절차는 동일합니다(그림 3): 이미징을 통한 화합물 분주 위치 선택 및 TeXRank²²를 사용한 결정화 방울 표적화; 용매 및 화합물 모두에 대한 음향 액체 분배 시스템을 사용하여 방울에 분주하는^단계(23); 크리스탈 시프터⁽²⁴)를 이용한 결정의 효율적인 수확; 빔라인 데이터베이스(ISPyB)에 샘플 정보를 업로드합니다. 실험 설계 및 실행을 위한 현재 인터페이스는 플랫폼의 다양한 장비에 필요한 입력 파일을 생성하고 모든 결과를 SQLite 데이터베이스에 추적 및 기록하는 Excel 기반 애플리케이션(SoakDB)입니다. 바코드 스캐너는 샘플 추적을 돕기 위해 프로세스 전반에 걸쳐 다양한 단계에서 사용되며 이 데이터는 데이터베이스에 추가됩니다.

회절 데이터는 빔라인 I04-1의 전용 빔타임을 사용하여 무인 모드에서 수집됩니다. 두 가지 센터링 모드, 즉 광학 및 X선 기반¹⁷을 사용할 수 있습니다. 바늘 및 막대 모양의 결정의 경우 X선 센터링이 권장되는 반면, 더 두툼한 결정은 일반적으로 광학 모드를 지원하므로 더 빠르므로 할당된 빔 시간 내에 더 많은 샘플을 수집할 수 있습니다. 크리스탈의 해상도(플랫폼에 들어가기 전에 설정됨)에 따라 데이터 수집은 총 노출이 60초 또는 15초가 될 수 있습니다. 용매 테스트 단계 중 데이터 수집은 일반적으로 빔라인 I04-1의 성능과 가장 잘 어울리는 조합을 알려줍니다.

대량의 데이터 분석은 XChemExplorer(XCE)²⁵를 통해 관리되며, PanDDA²⁶을 사용하여 히트 식별 단계를 시작하는 데에도 사용할 수 있습니다. XCE는 단백질-리간드 구조의 대규모 분석을 지원하는 데이터 관리 및 워크플로우 도구입니다(그림 4). Diamond Light Source(DIALS¹⁶, Xia2¹⁴, AutoPROC³⁰ 및 STARANISO³¹)에서 수집된 데이터에서 자동 처리 결과를 읽고 데이터 품질 및 참조 모델과의 유사성을 기반으로 결과 중 하나를 자동으로 선택합니다. 모델이 XChem 스크리닝에 사용되는 결정 시스템을 대표해야 하며, 모든 용수 또는 기타 용매 분자뿐만 아니라 용매로만 담근 결정에서 볼 수 있는 모든 보조 인자, 리간드 및 대체 형태를 포함해야 합니다. 이 참조 모델의 품질은 모델 구축 및 구체화 단계에서 필요한 작업량에 직접적인 영향을 미칩니다. PanDDA는 모든 데이터를 분석하고 결합 부위를 식별하는 데 사용됩니다. 구조를 기준 구조에 정렬하고, 통계 맵을 계산하고, 이벤트를 식별하고, 이벤트 맵^26,32을 계산합니다. PanDDA 패러다임에서는 전체 결정학 모델을 구축할 필요도 없고 바람직하지도 않습니다. 모델링해야 하는 것은 단편이 결합된 단백질의 보기(결합 상태 모델)일 뿐이므로 이벤트 맵³²에 따라 리간드 및 주변 잔류물/용매 분자를 구축하는 데만 초점을 맞추면 됩니다.

프로토콜

1. 프로젝트 제안서 제출

1. 제안 내용: XChem 프로그램은 초과 신청이 있기 때문에 제안서의 철저하고 완전한 정보는 동료 검토를 통과하는 데 매우 중요합니다.
   1. 사례를 만드십시오! 목표의 중요성을 제시하고 더 넓은 맥락에서 설명하십시오.
      1. 단편 스크리닝 캠페인 후 전략을 명확히 합니다: 히트를 검증하기 위한 직교 방법과 진행 방법. 필요한 경우 협업을 정렬합니다.
      2. 집중적인 실험실 및 데이터 분석 부분으로 인해 경험이 풍부한 결정학자를 미리 지정하는 것이 좋습니다.
      3. 견고한 크리스털 시스템은 기술적 변동을 제거하는 데 중요하며 사용자는 이러한 필수 사항을 해결해야 합니다.
         1. 결정화 조건은 reservoir 부피가 30 μL(또는 그 이하)이고 입자 크기가 200-500 nL 사이인 플랫폼에서 사용하기에 적합한 플레이트에서 유사한 회절 품질의 결정으로 재현 가능한 입자를 생성하는지 확인합니다. 이상적으로, 플레이트에 있는 방울의 50% 이상은 최소 35μm 크기³³의 결정을 갖습니다.
         2. 결정의 일관된 회절 품질(2.6 Å 이상)을 보장합니다.
         3. 결정 패킹 및 알려진 부위의 접근성을 포함하여 단편 스크리닝을 위한 결정 시스템의 적합성을 확인합니다. 이러한 부위에 결합된 분자에 대한 이전의 증거는 종종 안심할 수 있습니다.

2. 방문 준비

1. 현장 결정화를 위한 결정화 프로토콜 전송.
   1. 바로 사용할 수 있는 2 x 50mL의 저장 용액을 제공합니다.
   2. 결정화에 필요한 농도의 단백질 용액을 제공하고 30-50 μL의 부분 표본에서 사용할 수 있습니다.
   3. 10mL의 단백질 완충 용액을 제공합니다.
   4. 종자 스톡을 제공합니다(결정화 프로토콜에 필요하지 않은 경우에도).
      참고: 파종은 결정화 재현성을 선호하고 핵형성 시간을 가속화한다³³.
   5. XChem 웹 사이트에서 제공되는 결정화 정보 양식을 작성하십시오²⁸.
   6. XChem 웹 사이트²⁸에서 사용할 수 있는 배송 양식에 보관 정보를 제공합니다.
2. NoMachine을 설치하고 원격 데스크톱을 Diamond(https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html)로 설정합니다.
3. 전문 결정학자 또는 XChem 지원 담당자와 상의하여 우수한 참조 모델을 생성하고 전송합니다.

3. 단편 스크리닝 실험

1. 화합물 투약 위치 정의.
   1. 이미징 결정화 플레이트.
      1. 결정판 이미저(재료 표 참조)에서 실험에 필요한 모든 결정판(재료 표 참조)을 이미지화합니다. 이미저 소프트웨어를 사용하여 플레이트 유형에 대한 올바른 디렉토리에 다음 형식의 제안 Number_Plate 번호로 플레이트 이름을 생성합니다.
      2. 바코드를 인쇄하고(플레이트 이름을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 메뉴에서 선택) 행 문자에서 플레이트의 반대쪽에 놓고 바코드가 사용자 반대쪽을 향하도록 플레이트를 로드 포트에 넣습니다.
      3. 이미저 제어 소프트웨어를 사용하여 로드 포트를 스캔하고 플레이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 Image Plates를 선택합니다.
      4. 이미징이 완료되면 이미저에서 플레이트를 제거합니다.
   2. 결정 및 화합물 위치 선택
      참고 : 결정화 방울의 이미지는 TexRank의 텍스트 기반 알고리즘 Ranker를 사용하여 Luigi 파이프 라인 내에서 처리되어 결정²²의 존재 가능성에 따라 방울의 순위를 매깁니다. 약 10분이 소요되며 TexRank에서 이미지를 사용할 수 있습니다.
      1. PC에서 TeXRank 를 열고 오른쪽 하단의 목록에서 또는 왼쪽 상단의 상자에 바코드를 입력하여 크리스탈 트레이를 선택합니다.
      2. 올바른 이미저 형식과 단일 웰 보기를 선택합니다. 드롭 이미지를 통해 이동하고 실험에 사용하기에 적합한 결정이 있을 때 크리스탈에서 멀리 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하지만 드롭 내부의 목표는 드롭에서 용매/화합물을 추가할 위치를 목표로 하는 것이므로 크리스탈²³에 직접 부딪히고 싶지 않습니다.
      3. 전체 플레이트를 계속 진행하고 완료되면 Echo 1 Target 버튼을 선택합니다. 관련 방문 아래의 Crystal Targets 디렉토리에 저장합니다. 파일 이름을 변경하지 마십시오.
      4. 추가 플레이트에 대해 반복합니다.
2. 복합 디스펜싱
   1. 복합 분주를 위한 파일 생성
      1. SoakDB에서 라이브러리/용매 테이블에 라이브러리 선택 또는 용매 정보를 입력합니다.
      2. 드롭 볼륨을 입력하고 대상 크리스탈 목록에 로드합니다.
      3. 필요한 배치를 생성합니다.
      4. 담금 매개변수를 입력합니다. Calculate(계산 )를 클릭한 다음 Export Pending(내보내기 보류 중 ) 버튼을 클릭합니다. 용매의 경우 표에 다양한 농도를 추가합니다. 이렇게 하면 음향 디스펜서에서 사용할 파일이 생성됩니다.
      5. 동결 방지제를 사용하는 경우 농도를 입력하고 동일한 방식으로 파일을 만듭니다.
   2. 음향 디스펜서를 사용한 디스펜싱 솔루션( 재료 표 참조)
      1. 소스 플레이트(화합물 또는 용매/동결 보호제)를 가져와서 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리기에서 플레이트를 회전시킵니다.
      2. 용매 또는 동결 보호제를 분주하는 경우 384PP 플레이트의 관련 웰에 30μL를 피펫팅합니다. 마이크로씰 필름으로 덮은 다음 위와 같이 원심분리합니다.
      3. 소프트웨어를 엽니다. 새로 만들기 를 선택하고 올바른 소스 웰 플레이트(384PP, 384LDV 또는 1536LDV)와 액체 등급(DMSO, CP, BP 또는 GP)을 선택합니다. 올바른 플레이트 유형이 대상 플레이트로 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 사용자 지정 상자를 선택하고 계속합니다.
      4. 가져오기를 선택하고 관련 배치 파일을 선택합니다. 소프트웨어의 지시에 따라 가져오기 단계를 완료합니다.
      5. 플레이트 맵을 사용하여 디스펜싱할 용액과 대상 위치를 확인하십시오.
      6. 프롬프트가 나타나면 따라 프로토콜을 실행합니다. 소스 플레이트의 용액이 선택한 크리스탈 방울에 분배됩니다.
      7. 필요한 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 보관하십시오.
         참고: 이러한 파라미터는 용매 특성화 단계에서 결정되며, 온도는 결정 성장 온도에 따라 4°C 또는 20°C이며 시간은 일반적으로 1시간에서 3시간 사이입니다.
3. 반자동 결정 수확 장치를 사용하여 결정 수확( 재료 표).
   알림: 동결 보호가 필요한 경우 샘플을 채취하기 전에 결정 방울에 동결 보호제 용액을 추가하기 위해 3.2.2단계를 반복하십시오.
   1. 수확 준비
      1. SoakDB에서 수집에 필요한 파일을 준비합니다. 메시지가 표시되면 담금이 완료되고 배치가 완료되었는지 확인합니다.
      2. 올바른 제안서 번호로 실험에 필요한 퍽 수를 스캔합니다.
      3. 크리스탈에 적합한 크기의 루프(35μm, 75μm 또는 150μm)의 트레이를 선택합니다. 중요한 것은 크리스털 크기와 최대한 일치하는 루프 크기를 선택하여 빔라인의 자동 센터링이 더 정확해지도록 하고, 배경을 줄여 데이터 품질을 개선하고, 동결 보호제의 필요성을 없애는 것입니다.
      4. 관련 소프트웨어를 열고 워크플로우 탭을 엽니다.
      5. 퍽을 소프트웨어로 스캔하고 목록 맨 위로 다시 스크롤하여 첫 번째 퍽을 강조 표시합니다.
      6. 퍽을 폼 듀어에 넣고 액체 질소로 식힙니다.
      7. SoakDB에서 파일 가져오기를 선택하고 수집할 배치를 선택합니다. 배치가 왼쪽 홀더에 할당되었는지 확인하십시오. 작업 목록이 나타납니다.
      8. 크리스탈 플레이트를 가져 와서 씰을 제거하고 왼쪽 홀더에 넣으십시오. 플레이트를 주차 위치로 이동합니다.
   2. 크리스탈 수확
      1. 편안하게 Start Workflow 버튼(화면은 터치 스크린)을 눌러 첫 번째로 선택한 웰 위치로 이동합니다.
      2. 크리스탈이 살아남았다면 크리스탈을 루프에 장착하고 액체 질소에 뛰어들어 목록의 첫 번째 퍽에서 위치 1에 놓습니다.
      3. 인터페이스에서 크리스탈에 대한 적절한 설명(일반, 용융, 금이 간 상태, 젤리 또는 색상)을 선택합니다.
      4. 방울이 화합물 담금인 경우 화합물 상태(투명, 결정질, 침전, 투약 불량 또는 상 분리)에 대한 설명을 기록합니다.
      5. 크리스탈이 성공적으로 마운트되었으면 마운트 됨을 선택하고, 그렇지 않으면 실패를 선택합니다.
      6. 플레이트가 다음으로 선택한 웰로 이동합니다. 모든 퍽 위치를 연속적으로 채우십시오(크리스탈이 실패한 경우 틈을 남기지 마십시오). 워크플로가 끝날 때까지 계속합니다.
      7. 워크플로가 끝나면 추가 배치를 로드하고 퍽을 순서대로 계속 채웁니다. 새 배치를 위해 새 퍽을 시작할 필요가 없습니다.
   3. 수확 결과의 바코드 추적
      1. 모든 크리스탈이 수확되면 퍽을 바코드 스캐너로 가져가 홀더에 한 번에 하나씩 넣어 퍽을 스캔하고 바코드를 고정합니다.
      2. 이 작업이 완료되면 퍽에 뚜껑을 덮고 액체 질소 저장 듀어에 보관하십시오.
      3. 출력 파일을 SoakDB 인터페이스에 로드합니다.
   4. 샘플 정보를 ISPyB^34,35,36에 기록
      1. ISPyB에 샘플 데이터 업로드
         1. SoakDB에서 빔라인을 업데이트하고 ISPyB에 대한 업데이트를 방문하고 내보내기를 클릭하여 ISPyB에 업로드할 파일을 만듭니다.
         2. 퍼티를 엽니다. 로그인한 후 dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb 디렉토리로 이동합니다.
         3. csv2ispyb 스크립트(csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)를 실행합니다.
            참고: 이제 샘플이 ISPyB에 로드됩니다.
      2. 퍽 위치 및 데이터 수집 전략을 기록합니다.
         1. 퍽의 세부 사항과 위치를 기록하십시오.
            알림: 퍽을 찾아 빔라인에 적재할 수 있도록 퍽의 세부 사항과 위치를 기록하는 것이 중요합니다.
            1. SoakDB에서 Pucks라는 두 번째 탭을 엽니다.
            2. 위쪽에 있는 상자에 세부 정보를 입력합니다. 특히, 퍽의 위치(스토리지 듀어 및 지팡이), 예상 해상도 및 제안 번호를 포함한 데이터 수집 매개변수.
            3. 저장 버튼을 클릭하면 모든 퍽 목록이 테이블에 나타납니다. 최근에 채워진 퍽을 복사합니다.
            4. XChem 대기열 스프레드시트(바탕 화면의 바로 가기)를 열고 정보를 붙여넣습니다. 추가 관련 정보를 입력합니다.

4. 데이터 수집

알림: 데이터는 무인 모드로 수집되며 XChem/beamline 팀에서 관리합니다.

1. 중심이 잘못 잡힌 샘플 회수.
   참고: 이는 특정 샘플에 대한 데이터 수집에 문제가 있을 때 필요하며, 핀이 올바르게 중앙에 있지 않을 때 발생할 가능성이 큽니다.
   1. ISPyB의 샘플 체인저 보기를 보고 AP별 순위 지정 을 선택하여 녹색에서 빨간색으로 색상 눈금이 있는 자동 처리 해상도로 샘플을 등급화합니다.
   2. 샘플을 클릭하여 빨간색 또는 노란색 샘플이 있는지 확인합니다.
      참고: 이렇게 하면 데이터 수집이 시작됩니다.
   3. 크리스탈 스냅샷을 확인하여 크리스탈이 중앙에 있는지 확인합니다.
   4. 중앙에 배치되지 않은 모든 샘플을 기록하고 누락된 샘플을 회수할 현지 담당자에게 보냅니다.

5. 데이터 분석

1. XChemExplorer(XCE)를 통해 Diamond의 자동 처리 결과 검색 및 분석²⁵.
   1. 터미널에서 하위 폴더 Processing: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing 또는 XChem BAG의 경우: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/으로 이동합니다.
   2. 별칭 xce를 사용하여 XChemExplorer를 엽니다.
   3. 데이터 원본에서 테이블 업데이트 단추를 선택합니다.
   4. 개요 탭 아래에는 실험 데이터의 요약이 있습니다. 데이터 원본 메뉴의 Select Columns to Show 옵션을 사용하여 범주를 추가합니다.
   5. 설정 탭에서 데이터 수집 디렉토리(/dls/i04-1/data/year/visit/)를 선택합니다.
   6. 데이터 세트 탭을 열고, 대상 선택 드롭다운 메뉴에서 대상을 선택하고, 데이터 세트 드롭다운 메뉴의자동 처리에서 G et New Results를 선택하고, 실행을 클릭합니다.
      참고: XCE는 이제 자동 처리 결과에 대한 데이터 수집 방문을 구문 분석합니다. 처음 실행할 때 구문 분석되는 데이터 세트/디렉터리의 수에 따라 다소 시간이 걸릴 수 있습니다.
   7. 해상도, 공간 그룹 및 Rmerge를 확인하여 데이터의 일관성과 품질을 확인합니다. 2.8 Å 해상도보다 낮은 데이터는 제외합니다.
      참고: 기본적으로 데이터 세트 선택은 I/sigI, 완전성 및 고유 반사 수에서 계산된 점수를 기반으로 하지만 다른 처리 결과를 사용하여 선택할 수 있습니다²⁵.
   8. 개별 데이터 세트에 대해 다른 처리 결과를 선택하려면 원하는 경우 샘플 ID를 클릭하고 원하는 프로그램/실행을 선택합니다. 모든 데이터 세트에 대한 처리 파이프라인을 변경하려면 기본 설정 메뉴에서 기본 설정 편집을 선택하고 데이터 세트 선택 메커니즘을 변경합니다.
   9. 필요한 경우 ISPyB³⁷을 통해 데이터를 다시 처리합니다.
   10. 샘플에 대해 처리된 데이터가 허용되지 않는 경우 추가 분석에서 제외하지 못함 으로 레이블을 지정합니다.
   11. 완료되면 데이터 원본에서 테이블 업데이트를 클릭하여 후속 테이블에 데이터를 추가합니다.
2. DIMPLE³⁸을 사용하여 초기 맵 계산.
   1. 맵 탭을 열고 드롭다운 메뉴에서 참조 모델을 선택한 다음 원하는 데이터 세트를 선택한 다음 선택한 MTZ 파일에서 DIMPLE 실행을 선택합니다.
   2. XCE는 Diamond의 클러스터에서 수많은 DIMPLE 작업을 동시에 실행합니다. 딤플 상태 열에서 이러한 작업의 상태를 찾고 데이터 원본에서 테이블 업데이트 버튼을 사용하거나 Linux의 qstat 명령을 사용하여 새로 고칩니다.
   3. 완료되면 Dimple Rcryst, Dimple Rfree 및 Space Group 값이 허용되는지 확인합니다. 필요한 경우(높은 Rfree/잘못된 공간 그룹/단위 셀 부피의 큰 차이) 앞에서 설명한 대로 자동 처리 결과를 변경하고 이러한 데이터 세트에 대해 맵 생성을 반복합니다.
3. Grade³⁹, AceDRG⁴⁰ 또는 phenix.eLBOW⁴¹을 사용하여 리간드 억제를 생성합니다.
   1. 원하는 프로그램(기본 설정, 기본 설정 편집, 구속조건 생성 프로그램)을 선택한 다음 맵 탭에서 데이터셋을 선택한 다음 맵 및 구속조건 드롭다운에서 선택한 화합물의 CIF/PDB/PNG 파일 만들기를 실행합니다.
   2. Update Tables from Datasource(데이터 원본에서 테이블 업데이트) 단추를 사용하여 Compound Status(복합 상태) 열 아래에 있는 이러한 작업의 상태를 새로 고칩니다.
4. 지상 상태 모델 구축(사전 실행)
   참고: 기저 상태 모델이라는 용어는 100개의 데이터 세트에서 관찰된 바와 같이 리간드가 없는 형태의 단백질 구조를 나타냅니다(이 숫자는 임의로 선택됨). 기저 상태 모델은 리간드 결합 상태를 구축하기 위한 참조로 사용되기 때문에 전체 단편 스크리닝 캠페인을 분석하기 전에 모든 용매 및 물 분자를 포함한 정확한 기저 상태 모델을 구축하는 것이 중요합니다. 이 단계에서는 PanDDA가 흥미로운 이벤트가 없는 것으로 표시된(따라서 리간드가 없을 가능성이 높은) 첫 번째 가장 높은 해상도의 데이터 세트를 사용하여 바닥 상태 평균 맵을 생성하고 R이_가장 낮은 데이터 세트를 선택하여 미세 조정합니다. 지상 상태 평균 맵은 결정학적 맵이 아니지만 이 맵을 기저 상태 모델 구축에만 사용하는 것이 중요합니다.
   1. PanDDA 탭을 열고 필요한 경우 데이터 원본에서 테이블을 업데이트합니다.
   2. 출력 디렉토리(/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas)를 정의합니다.
   3. 그라운드 스테이트 모델(Ground State Model)에 대해 사전 실행(Pre-run)을 선택하고 실행(Run)을 클릭합니다.
      참고: Rfree가 높고 예기치 않은 공간 그룹이 있는 데이터 세트는 분석에서 자동으로 제외되어야 합니다.
   4. 높은 Rfree 및 예기치 않은 공간 그룹이 있는 데이터 세트를 수동으로 제외하려면 완전히 무시를 선택합니다.
   5. 터미널 창에서 qstat를 사용하여 사전 실행 작업의 상태를 확인합니다.
   6. 완료되면 지상 상태 모델 빌드 를 선택하고 실행을 클릭합니다.
      참고: 이렇게 하면 Coot를 사용한 리모델링 및 미세 조정을 위해 최고 품질의 데이터 세트에서 PanDDA 평균 맵과 참조 모델/2Fo-Fc/Fo-Fc 맵이 있는 Coot가 열립니다. 모델링에는 PanDDA 평균 맵만 사용하는 것이 가장 중요합니다.
5. PanDDA²⁶을 사용하여 히트 식별
   1. PanDDA 분석
      참고: 데이터 세트가 많고, 단위 셀이 크고, 비대칭 단위에 단백질 복사본이 여러 개 있는 경우 클러스터에서 실행하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다.
      1. DLS 자동 처리 결과 분석 및 초기 맵 계산에 대해 이전에 설명한 단계를 반복합니다. 맵 계산의 경우 접지 상태 모델을 참조로 사용합니다(참조 파일 목록 새로 고침 > 새 참조 설정 및 새 데이터에 필요한 리간드 구속조건 생성).
      2. PanDDA 탭에서 출력 디렉터리가 이전과 같이 설정되어 있는지 확인하고 Hit Identification(적중 식별) 드롭다운 메뉴에서 pandda.analyse를 실행합니다.
      3. qstat 명령을 사용하여 Linux 터미널에서 작업 상태를 확인합니다.
   2. PanDDA 검사 - 바인딩 이벤트 확인/빌드
      1. XCE의 PanDDAs 탭 아래에 있는 Hit Identification 드롭다운 메뉴에서 pandda.inspect를 실행하여 PanDDA 제어판으로 Coot⁴²를 엽니다.
         참고: pandda.inspect 제어판은 PanDDA 통계에 대한 요약을 제공하며 사용자가 바인딩 이벤트/사이트를 탐색할 수 있도록 합니다. 결과의 요약 HTML 파일도 생성되며 HTML 업데이트를 선택하여 검사 중에 업데이트할 수 있습니다.
      2. 리간드를 모델링하려면 다른 이벤트로 이동하기 전에 Merge Ligand With Model and Save Model을 클릭하여 경계 상태 모델에 대한 변경 사항이 손실되지 않도록 합니다.
         참고: 업데이트 및 저장된 모델만 이후 단계에서 미세 조정을 위해 내보내집니다.
      3. Event Comment 필드를 사용하여 바인딩 이벤트에 주석을 달고 Record Site Information을 사용하여 바인딩 사이트에 주석을 달 수 있습니다.
      4. 이벤트 맵 및 모델과 비교하기 위해 평균 및 2mFo-DFc 맵(DIMPLE에서)을 로드합니다.
         1. 실행 가능한 모든 리간드가 이벤트 맵을 기반으로 모델링, 병합 및 저장되면 pandda.inspect를 닫습니다.
   3. PanDDA 내보내기 및 개선
      참고: PanDDA 검사 모델은 프로젝트 디렉토리로 다시 내보내지고 초기 미세 조정이 시작됩니다. 현재 XCE의 PANDDA 탭에는 두 가지 파이프라인이 있습니다.
      1. NEW/ALL/SELECTED PANDDA 모델 내보내기 는 미세 조정을 위해 바운드 및 언바운드 모델의 앙상블을 생성하고 Refmac⁴³에 대한 점유 구속 매개변수를 생성합니다.
         참고: 앙상블 모델은 미세 조정에 사용되지만 바인딩 상태 모델만 Coot에서 업데이트되고 PDB에 보관됩니다. 이 파이프라인은 점유율 조각이 적고 단백질 모델이 크게 변경된 데이터 세트에 가장 적합합니다.
      2. Refine NEW/ALL bound-state models with BUSTER Fines NEW/ALL bound-state models with BUSTER Refref NEW/ALL bound-state models with BUSTER (버스터⁴⁴)로 바운드 스테이트 모델을 미세 조정한다.
         참고: 이것은 단백질 모델에 대한 최소한의 변경으로 높은 점유율 리간드/데이터 세트와 함께 사용하는 것이 가장 좋습니다.
6. 히트를 구체화합니다(이제 구체화를 위해 선택한 모든 데이터 세트가 구체화 탭에 표시됨). 미세 조정 드롭다운 메뉴에서 COOT - BUSTER 미세 조정 열기 또는 COOT - REFMAC 미세 조정 열기를 선택하여 XCE 미세 조정 제어판으로 Coot를 엽니다.
   1. Select Samples 드롭다운에서 미세 조정할 샘플의 상태(일반적으로 3 - 미세 조정 중)를 선택하고 GO를 클릭합니다.
      참고: XCE 제어판은 해당 범주에 대한 데이터 세트 수에 대한 요약을 제공하고 세분화 통계에 대한 요약을 제공하면서 데이터 세트 간 탐색을 허용합니다.
   2. XCE 제어판에서 리간드 신뢰도에 주석 달기: 0 - 리간드 존재 없음 - 단편이 결합되지 않았습니다. 1 - 낮은 신뢰도 - 조각이 결합되었을 수 있지만 특별히 설득력이 없습니다. 2 - 올바른 리간드, 약한 밀도 - 사용자는 단편이 결합되었다고 확신하지만 점유율이 낮거나 맵에 몇 가지 문제가 있습니다. 3 - 명확한 밀도, 예상치 못한 리간드- 지도는 제공된 화학 구조와 상관 관계가 없는 리간드 결합을 명확하게 나타냅니다. 4 - 높은 신뢰도 - 리간드가 명확하게 결합되어 있습니다.
   3. 이 단계에서 모델을 필요에 따라 변경하고 미세 조정 버튼을 사용하여 추가 미세 조정을 시작합니다.
   4. MolProbity 할 일 목록 표시 버튼을 사용하여 모든 미세 조정 사이클에서 실행되는 MolProbity⁴⁵ 해석에 액세스할 수 있습니다.
   5. 필요한 경우 미세 조정 매개변수 버튼을 선택하여 미 세 조정 매개변수 (예: 이방성 온도 계수, 트윈 데이터 또는 점유 미세 조정)를 추가합니다.
      참고: 데이터 처리 통계는 XCE의 Refinement 탭에서도 제공되며, Buster 파이프라인으로 미세 조정이 수행되면 MOGUL analysis⁴⁶을 포함한 Buster 보고서가 제공됩니다.
   6. 미세 조정 탭의 기본 XCE 창 또는 Coot XCE 제어판에서 미세 조정이 진행되는 동안 데이터 세트의 상태를 변경합니다. 모델이 리간드 주변에서 정확하고 추가 분석을 위해 공유하기에 적합하다고 판단되면 상태를 CompChem Ready로 변경합니다. 미세 조정이 완료되고 모델을 PDB에 업로드할 준비가 되면 상태를 증착 준비로 변경합니다.

6. 데이터 보관

참고: 조각 화면의 모든 데이터 세트와 PanDDA 이벤트 맵을 생성하는 데 사용되는 지상 상태 모델은 그룹 증착을 사용하여 PDB에 저장할 수 있습니다.

1. Hit Identification 메뉴에서 Event Map ->SF를 실행하여 모든 PanDDA 이벤트 맵을 MTZ 형식으로 변환합니다.
2. Deposition > Edit information을 선택하여 작성자 및 방법과 같은 추가 메타데이터를 제공합니다. 필요한 모든 항목을 입력하고 데이터베이스에 저장을 클릭한 다음 기저 상태 모델의 증착을 위해 이 정보를 저장합니다. 모델 상태가 증착 준비(Deposition Ready)로 변경된 후에 이 작업을 수행합니다.
3. 증착 탭에서 mmcif 준비 버튼을 선택하여 모든 증착 준비 데이터 세트에 대한 구조 계수 mmcif 파일을 생성합니다. 이 작업이 완료되면 터미널 창에 다음 메시지가 나타납니다: wwPDB 증착을 위한 mmcif 파일 준비 완료.
4. mmcif 복사 단추를 선택하여 이러한 모든 파일을 방문의 그룹 증착 디렉토리에 있는 단일 bzip으로 압축된 tar 아카이브에 복사합니다.
5. https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit 로 이동하십시오. 사용자 이름: grouptester 및 비밀번호: !2016rcsbpdb로 로그인합니다. 세션을 생성하고 그룹 증착 디렉토리에서 ligand-bound.tar.bz2 파일을 업로드합니다.
6. 리간드 결합 구조를 성공적으로 제출하면 PDB 코드가 포함된 이메일이 전송됩니다. 증착 메뉴에서 PDB 코드로 DB 업데이트를 선택합니다. 이 이메일의 정보를 복사하여 팝업 창에 붙여넣고 데이터베이스 업데이트를 클릭하여 PDB ID를 추가합니다.
7. PanDDA에서 사용하는 접지 상태 모델을 저장하려면 XCE에서 관련 PanDDA 디렉토리를 선택하고 Hit Identification 메뉴에서 apo->mmcif를 실행합니다.
   참고: XCE는 증착 번들의 모델로 낮은 Rfree를 가진 고해상도 구조를 임의로 선택한 다음 모든 구조 계수 mmcif 파일을 단일 파일로 컴파일합니다.
8. Deposition 탭에서 Group Deposition of Ground-State Model 섹션 아래에 있는 Add to Database 버튼을 선택합니다.
9. 지면 상태 모델에 대한 메타데이터를 입력하고( 다시 한 번 Deposition > Edit Information을 선택하여) 이전 파일을 로드하고 데이터베이스에 저장합니다.
10. Group Deposition of Ground-State Model(기저 상태 모델의 그룹 증착) 섹션에서 Prepare mmcif(mmcif 준비)를 실행하여 기저 상태 mmcif 파일을 준비하고, 완료되면 동일한 섹션에서 Copy mmcif 버튼을 선택하여 mmcif를 Group Deposition 디렉토리에 복사합니다.
11. 이전과 마찬가지로 https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit 로 이동하십시오. 사용자 이름: grouptester 및 비밀번호: !2016rcsbpdb로 로그인합니다. 세션을 생성하고 그룹 증언 디렉토리에서 ground_state_structures.tar.bz2 파일을 업로드합니다.

결과

X선 결정학에 의한 절편 스크리닝을 위한 XChem 파이프라인이 광범위하게 간소화되어 과학계에서 이를 활용할 수 있게 되었습니다(그림 5). 이 프로세스는 적중률이 1%에서 30% 사이인 150개 이상의 스크리닝 캠페인에서 검증되었습니다.47,48,49,50,51,52 그리고 많은 반복 사용자에 의해 검증되었습니다. 적합하지 않거나(낮은 분해능, 결정화 또는 회절 품질에서 일관성이 없음) DMSO 또는 에틸렌 글리콜을 견딜 수 없는 결정 시스템은 공정 초기에 제거되어 시간, 노력 및 자원을 절약할 수 있습니다. 성공적인 캠페인은 표적 단백질에 대한 잠재적 상호 작용 부위의 3차원 지도를 제공합니다. 일반적인 결과는 SARS-CoV-2의 주요 단백질 분해 효소의 XChem 스크리닝입니다(그림 6). 전형적으로, 단편 히트는 다음에서 발견된다: (a) 효소 활성 부위 및 서브-포켓(⁴⁸)과 같은 관심의 공지된 부위; (b) 추정적 알로스테릭 부위, 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용⁵³; (c) 일반적으로 거짓 양성으로 간주되는 크리스털 패킹 인터페이스(그림 6). 이 구조 데이터는 일반적으로 단편 히트를 납과 같은 작은 분자 ^1,3으로 병합, 연결 또는 성장시키기 위한 기초를 제공합니다.

그림 1: XChem 파이프라인. 이 플랫폼은 프로젝트 제안부터 샘플 준비, 데이터 수집 및 히트 식별에 이르기까지 개략적으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 스크리닝 전략. 워크플로는 각 마일스톤의 목적, 실험의 요구 사항 및 결정 지점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 시료 전처리 워크플로우. 샘플 준비에 대한 중요한 단계는 SQLite 데이터베이스에 기록되는 각 단계의 정보와 함께 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: XCE를 사용한 데이터 분석. 데이터 분석의 중요한 단계는 관련 소프트웨어 패키지가 포함된 워크플로 다이어그램으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: XChem 사용자 프로그램의 진화: 이 차트는 2015년부터 2019년까지 사용자 프로그램의 활용 및 통합, 2019년 BAG 생성, 2020년 COVID-19 팬데믹을 통한 플랫폼의 복원력을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: XChem fragment screen의 대표적인 결과. SARS-CoV2 주요 프로테아제(M^pro) 이량체는 활성 부위 히트가 노란색으로 표시된 표면, 추정 알로스테릭 히트가 자홍색으로 표시되고, 표면/결정 패킹 인공물이 녹색으로 표시됩니다. 이 수치는 그룹 증착 G_1002156의 Chimera 및 M^pro PDB 항목을 사용하여 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 백서에 설명된 프로세스는 사용자 커뮤니티에서 광범위하게 테스트되었으며 여기에 설명된 프로토콜의 적응성은 플랫폼에서 일반적으로 발생하는 다양한 프로젝트를 처리하는 데 중요합니다. 그러나 결정계의 몇 가지 전제 조건이 필요합니다.

X선 결정학을 사용하여 수행되는 모든 단편 스크리닝 캠페인의 경우, 재현 가능하고 견고한 결정 시스템이 중요합니다. 표준 XChem 프로토콜은 크리스탈 드롭에 직접 프래그먼트를 추가하는 것을 포함하므로 최적화는 총 크리스탈 수보다는 고품질 크리스탈을 포함하는 드롭의 수에 초점을 맞춰야 합니다. 방울에 여러 개의 결정이 포함되어 있으면 수확 과정을 완화할 수 있지만 효과적으로 중복됩니다. 또한 결정화 프로토콜을 홈 인스티튜트에서 현장 시설로 이전하는 것은 어려울 수 있습니다. 이것은 일반적으로 재현성 핵형성(⁵⁴)을 촉진하기 위해 결정 시드를 사용하여 가장 잘 달성되며, 따라서, 좋은 관행은 사용자가 그들의 단백질 및 결정화 용액과 함께 종자 스톡을 제공하는 것이다.

우수한 화합물 용해도와 지지력을 보장하기 위해 약한 단편, 단편 라이브러리의 결합을 유도하기 위한 높은 담금 농도가 유기 용매, 특히 DMSO 및 에틸렌 글리콜로 제공됩니다. 두 가지 다른 용매를 제공하면 DMSO를 전혀 견디지 못하거나 관심 부위에서 단편의 결합을 막는 결정에 대한 대안을 사용자에게 제공합니다. 사용자는 수용성 완충액에 대체 라이브러리를 제공할 수 있습니다: 화합물은 액체 분주 로봇과 호환되는 플레이트에 완전히 용해되고 포맷되면 잘 분주됩니다.

라이브러리를 용해시키고 결정 시스템에 의해 허용될 수 있는 적절한 유기 용매를 찾을 수 없는 프로젝트의 경우, 대체 절차는 BESSY⁵⁵에 설정된 건조 화합물을 사용하는 것입니다.

커뮤니티에서는 높은 염분 농도를 포함하는 결정화 조건에서 성장한 결정에 화합물을 담글 수 있는지에 대한 오랜 질문이 있습니다. 실제로, 수확 단계에서 화합물의 더 많은 침전과 염 결정의 빠른 형성이 관찰되며, 이는 수확 지역 주변에 습한 환경을 적용함으로써 감소됩니다. 일반적으로 고염 결정화 조건에서 결정계의 스크리닝 캠페인은 저염 조건과 유사한 적중률을 제공합니다.

XChem 공정의 초기 단계(용매 내성 테스트 및 사전 스크리닝)는 비교적 소규모의 빠른 실험이지만 프로젝트에 대한 명확한 합격/불합격 결정을 내릴 수 있습니다. 가장 고통스럽게도, 용매가 모두 허용되지 않거나 사전 스크리닝으로 인해 적중률이 매우 낮은 경우 대체 결정 시스템을 찾아야 합니다. 반대로, 성공적일 경우, 결과는 스크리닝 실험에 사용할 담금 조건과 데이터 수집을 위한 최상의 전략을 직접 알려줍니다. 데이터의 품질, 특히 분해능은 히트 식별 및 분석을 위한 전자 밀도의 품질에 영향을 미치기 때문에 회절 품질에 해로운 영향을 미치지 않는 가능한 가장 높은 화합물 농도에 담그는 것이 목표입니다(대부분의 데이터 세트(~80%)가 2.8Å 이상의 분해능으로 회절됨).

데이터 분석 프로세스는 취약한 바인더를 감지하기 위해 PanDDA 소프트웨어에 의존하는 XChemExplorer 내에서 간소화되며 사용자는 스크리닝 캠페인의 결과를 빠르게 시각화하고 검토할 수 있습니다. XChemExplorer는 각 패키지에 대한 표준 방법(즉, CC1/2 = 0.3)에 의해 결정된 해상도 제한으로 Diamond(DIALS¹⁶, autoPROC³⁰, STARANISO³¹ 및 Xia2¹⁴)에서 사용할 수 있는 패키지에서 데이터 처리 결과를 가져옵니다. 기본적으로, 데이터셋 선택은 I/sigI, 완전성, 및 다수의 고유 반사로부터 계산된 점수에 기초하지만, 특정 처리 결과는 전역적으로 또는 개별 샘플들 모두에 사용하기 위해 선택될 수 있다(²⁵). 또한 분해능, R_free, 참조 데이터와 타겟 데이터 간의 단위 셀 부피 차이(기본값은 각각 3.5Å, 0.4 및 12%)를 포함한 기준에 따라 PanDDA의 분석에서 데이터를 제외하므로 회절이 불량하거나 중심이 잘못 지정되거나 인덱싱이 잘못된 결정이 분석에 영향을 미치지 않습니다.

PanDDA 알고리즘은 단편 캠페인 중에 수집된 상당한 수의 데이터 세트를 활용하여 표준 결정학 맵에서 볼 수 없는 부분 점유 리간드를 감지합니다. 처음에 PanDDA는 용매 내성 테스트 및 사전 스크리닝 단계에서 수집된 데이터를 사용하여 평균 밀도 맵을 준비한 다음 바닥 상태 모델을 만드는 데 사용합니다. 이 모델은 모든 후속 분석 단계에 사용되므로 단편 스크리닝에 사용되는 조건에서 리간드되지 않은 단백질을 정확하게 나타내는 것이 중요합니다. 그런 다음 PanDDA는 통계 분석을 사용하여 결합된 리간드를 식별하고 결정의 결합된 상태에 대한 이벤트 맵을 생성합니다. 이벤트 맵은 부분 점유 데이터 세트에서 결정의 결합되지 않은 부분을 빼서 생성되며 리간드가 완전 점유 시 결합될 경우 관찰되는 내용을 나타냅니다. 종래의 2mF_{o-DF c} 맵에서 명백하게 나타나는 단편들조차도 이벤트 맵들이 참조되지 않는다면 잘못 모델링될 수 있다³². PanDDA는 평균 맵(일반적으로 단편 결합을 나타냄)과 다른 데이터 세트를 식별하는 강력한 방법이며 정제 중 RSCC, RSZD, B 인자 비율 및 RMSD와 같은 메트릭이 사용자에게 제공되지만, 관찰된 밀도가 예상 리간드와 가장 적합한 형태를 정확하게 나타내는지 여부를 결정하는 것은 궁극적으로 사용자의 책임입니다.

데이터 분석 및 정제 후 모든 사용자가 XChemExplorer를 사용하여 PDB(Protein Data Bank)에 여러 구조를 동시에 예치할 수 있습니다. 각 조각 스크린에 대해 두 개의 그룹 증착이 이루어집니다. 첫 번째 증착에는 MMCIF 파일에 포함된 PanDDA 이벤트 맵을 계산하기 위한 계수와 함께 모든 프래그먼트 바인딩 모델이 포함됩니다. 두 번째 증착은 실험의 모든 데이터 세트의 측정된 구조 계수와 함께 수반되는 기저 상태 모델을 제공합니다: 이 데이터는 PanDDA 분석을 재현하고 향후 알고리즘을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 히트의 구조에 관해서는, 단편 점유가 낮을 때, 모델이 리간드-결합 및 교란 기저 상태 구조(³²)의 복합체인 경우 미세화가 더 잘 거동된다. 그럼에도 불구하고 전체 복합 모델은 일반적으로 복잡하고 해석하기 어렵기 때문에 제한된 상태 분수만 예치하는 것이 좋습니다. 그 결과, PDB에 의해 재계산된 일부 품질 지표(특히 R/Rfree)가 약간 상승하는 경우가 있습니다. Zenodo⁵⁶과 같은 플랫폼을 사용하여 모든 원시 데이터를 제공하는 것도 가능하지만 현재 XChem 파이프라인에서는 지원되지 않습니다.

전반적으로, 2016년 수술 이후 이 절차를 사용하여 표적의 95% 이상에서 단편 리간드를 식별할 수 있었습니다. XChem이 지원해 온 많은 프로젝트로부터의 경험은 결정 준비⁽³³)를 위한 모범 사례로 정제되었으며, 한편 단편 진행(²⁹)을 돕기 위한 침착한 개념을 구현한 단편 라이브러리가 발전했으며, 또한 라이브러리 구성을 공개하는 관행을 확립하는 데 도움이 되었다. 이 플랫폼은 잘 관리된 인프라와 문서화된 프로세스의 중요성을 입증했으며, 여기에 자세히 설명되어 있으며, 다른 단편 라이브러리(^57,58)를 평가하고, 라이브러리(⁴⁸)를 비교하고, 협업 EUOpenscreen-DRIVE 라이브러리(^59,60)의 설계를 알릴 수 있게 했다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSI-poised library	Enamine	DSI-896	fragment library
Echo 550 and 650 series	Beckman-Coulter		acoustic dispensing system
Echo microplates	Beckman-Coulter	001-12380; 001-8768; 001-6025	1536-well and 384-well microplates
Shifter	Oxford Lab Technology		harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor	Sigma	model 11121	microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates	Swissci	3W96T-UVP	Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software	Formulatrix		Crystallisation plates imaging device