뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

요약

이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.

초록

호흡기는 외부 환경과 직접 접촉하며 환경 항원에 대한 원치 않는 반응을 억제하면서 보호를 제공하기 위해 정밀하게 조절된 면역 체계가 필요합니다. 폐는 면역 감시를 제공하지만 보호 면역 반응을 매개하는 선천적 및 적응 면역 세포의 여러 집단을 호스트합니다. 건강한 폐 면역 체계의 균형을 유지하는 이러한 세포는 천식, 감염, 자가면역 질환 및 암과 같은 여러 병리학 적 상태에도 참여합니다. 표면 및 세포내 단백질의 선택적 발현은 폐의 면역 세포에 독특한 면역표현형 특성을 제공한다. 결과적으로, 유세포 측정은 정상 상태 및 병리학 적 조건 동안 그러한 세포 집단의 확인에 중요한 역할을합니다. 이 논문은 정상 상태 조건 하에서 건강한 마우스의 폐에 상주하는 면역 세포를 확인하기위한 일관되고 재현 가능한 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 그러나, 이 프로토콜은 또한 폐 면역 환경에서 질환 특이적 변화를 식별하는 것을 돕기 위해 다양한 질병 모델에서 이들 세포 집단의 변화를 확인하는데 사용될 수 있다.

서문

뮤린 호흡기에는 병원균과 싸우고 면역 항상성을 유지하는 독특한 면역 체계가 포함되어 있습니다. 폐 면역 체계는 표현형, 기능, 기원 및 위치에서 상당한 이질성을 가진 세포 집단으로 구성됩니다. 상주 폐포 대식세포 (AMs)는 주로 태아 단핵구에서 유래하여 폐포 루멘¹에 상주하며, 골수 유래 간질성 대식세포 (IMs)는 폐 실질²에 상주합니다. IMs는 CD206의 발현에 의해 추가로 하위분류될 수 있다. CD206⁺ IM은 기관지 주위 및 혈관주위 영역을 채우는 반면, CD206-IM은 폐포 간질³에 위치한다. IM의 몇 가지 하위 분류가 최근에 제안되었습니다 3,4,5,6. IM이 AM보다 덜 연구되었지만, 최근의 증거는 폐의 면역 체계 조절에 중요한 역할을지지합니다⁷. 또한, CD206은 또한 대안적으로 활성화된 AMs8에서 발현된다.

폐 수지상 세포 (DCs)는 폐 면역 세포의 또 다른 이종 그룹으로서 그들의 기능적 특성, 위치 및 기원과 관련하여 존재한다. DC의 네 가지 하위 범주가 폐에 기술되었다: 통상적인 CD103+ DCs(cDC1로도 알려짐), 통상적인 CD11b⁺ DCs(cDC2로도 알려짐), 단핵구 유래 DCs(MoDCs), 및 혈장세포성 DCs9,10,11,12,13. 처음 세 개의 서브클래스는 주조직 적합성 복합체(MHC) II⁺CD11c^+9,10,14,15로 정의될 수 있다. 플라스마사이토이드 DC는 MHC II를 발현하고 CD11c에 대해 중간 양성이지만 높은 수준의 B220 및 PDCA-19,13,16^을 발현한다. 순진한 뮤린 폐에서 CD103 DC와 CD11b DC는 기도 간질에 위치하는 반면, 혈장 세포질 DC는 폐포 간질에 위치합니다¹⁷.

단핵구의 두 가지 주요 집단은 정상 상태 동안 폐에 거주합니다 : 고전적인 단핵구와 비 고전적 단핵구. 고전적 단핵구는 Ly6C⁺이며 초기 염증 반응에 매우 중요합니다. 대조적으로, 비고전적 단핵구는 ^Ly6C-항염증 세포^3,16,18로서 널리 간주되어 왔다. 최근에, CD64⁺CD16.2+ 단핵구의 추가 집단이 기술되었고, 이는 ^Ly6C-단핵구로부터 기원하고 CD206⁺ IMs3를 야기한다.

호산구는 주로 기생충 감염이나 알레르기 상태 동안 폐에 나타납니다. 그러나, 정상 상태 동안 폐 실질에는 소수의 호산구가 존재하며, 이는 상주 호산구로 알려져 있다. 상주 호산구와는 달리, 염증성 호산구는 폐 간질염 및 기관지 폐포 세척 (BAL)에서 발견됩니다. 집먼지 진드기 (HDM)의 마우스 모델에서, 염증성 호산구는 항원 매개 자극 후 폐로 모집된다. 상주 호산구는 ^HDM19에 대한 T 헬퍼 2 (Th2) 감작을 억제함으로써 알레르기에 대한 조절 역할을 할 수 있다고 제안되었습니다.

나머지 폐 골수성 세포와는 달리, 호중구는 CD68이 아닌 Ly6G를 발현하며 CD68-Ly6G⁺ 면역표현형^16,20,21의 시그니처를 특징으로 한다. 시각화 연구는 정상 상태 동안, 폐는 혈관내 구획에 호중구 풀을 보유하고, 상당한 수의 혈관외 호중구를 숙주로 한다는 것을 보여주었다²². 호산구와 유사하게, 호중구는 정상 상태에서 BAL에서 발견되지 않는다; 그러나 LPS 챌 린지, 천식 또는 폐렴과 같은 여러 형태의 면역 자극은 호중구를 폐포 내강으로 유도하여 ^BAL21,22,23에 존재하게됩니다.

폐의 상당한 수의 CD45⁺ 세포는 자연 살해 (NK), T 세포, 및 B 세포를 나타내며, 대부분의 골수성 마커²⁴에 대해 음성이다. 순진한 마우스의 폐에서, 이들 세 가지 세포 유형은 CD11b 및 MHC ^II18의 발현에 기초하여 확인될 수 있다. 폐 CD45⁺ 세포의 약 25%는 B 세포인 반면, NK 세포의 비율은 다른 림프성 및 비림프성 조직보다 폐에서 더 높다^24,25,26. 폐 T 세포 중에서, 상당한 분획은 CD4-CD8^-호흡기 감염²⁶에서 중요한 역할을 한다.

폐는 매우 복잡하고 독특한 면역 체계를 보유하고 있기 때문에 폐 면역 세포의 확인을위한 몇 가지 게이팅 전략이 개발되어 16,18,20,27보고되었습니다. 본원에 기재된 게이팅 전략은 9개의 마커를 사용하여 최대 12개의 상이한 폐 골수성 및 비골수성 면역 집단을 확인하기 위한 포괄적이고 재현가능한 방법을 제공한다. 결과의 유효성을 검사하기 위해 추가 마커가 사용되었습니다. 또한, 세포 사멸을 최소화하고 폐의 면역 세포 구획의 가장 완전한 프로파일의 확인을 허용하는 단일 세포 현탁액의 제조를 위한 상세한 방법이 제공된다. 상피 세포 (CD45-CD326+CD31-), 내피 세포 (CD45-CD326-CD31⁺), 및 섬유아세포와 같은 폐의 비면역 세포의 동정은 상이한 접근법을 필요로 한다는 점에 유의해야 한다^28,29. 이러한 집단의 확인은 여기에 설명된 프로토콜 및 방법에 포함되지 않는다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 연구 및 실험은 Beth Israel Deaconess Medical Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 지침에 따라 수행되었습니다. 6 내지 10주령의 C57BL/6 생쥐 중 어느 한쪽 성별이 이 프로토콜을 개발하는데 사용되었다.

1. 외과 적 절제 및 조직 준비

1. 1 mL의 트리브로모에탄올을 복강내 주사하여 마우스를 안락사시킨다 (표준 프로토콜에 따라 제조됨; 자료의 표).
   참고 : _CO2 질식은 폐 손상을 유발하고 폐 면역 세포의 특징과 특성을 변화시킬 수 있으므로 폐 연구에서 피해야합니다. 자궁 경부 탈구는 폐의 기계적 손상을 일으킬 수 있으므로 피해야합니다.
2. 외과 수술을 위해 마우스를 깨끗하고 전용 영역으로 옮깁니다.
3. 네 사지에 바늘이나 테이프를 사용하여 마우스 등쪽을 아래로 안정시킵니다. 복부 부위의 피부를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용하십시오.
4. 목에서 복부까지 피부를 절개하십시오. 흉부 부위에서 피부를 조심스럽게 제거하십시오.
5. 흉골과 갈비뼈를 조심스럽게 제거하십시오.
6. 폐가 완전히 흰색이 될 때까지 18-21 G 바늘을 사용하여 차가운 PBS 10 mL를 우심실에 직접 주사하여 폐를 플러시하십시오.
7. 폐를 만지지 않고 흉선과 심장을 조심스럽게 제거하십시오.
8. 폐를 주변 조직으로부터 부드럽게 분리하고 차가운 BSA 완충액이 있는 튜브로 옮깁니다(표 1).
   참고 : 단일 세포 현탁액을 더 준비하기 전에 폐에서 인접한 모든 지방을 제거하기위한 노력이 이루어져야합니다.이 측정은 판독 값을 편향시킬 수 있습니다.

2. 단세포 현탁액의 제조

1. 폐를 빈 페트리 접시로 옮기고 두 개의 미세한 메스로 다듬어 라. 다진 폐의 모든 조각을 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 5 mL의 소화 완충액을 사용하여 플레이트를 세척하고 다진 폐가 들어있는 50 mL 튜브에 첨가한다 (표 1).
   참고: 소화 완충액은 사용 직전에 준비해야 합니다. 5 mg/mL의 콜라게나제²⁸을 사용하십시오. 1 또는 5 mg의 콜라게나제를 BSA 완충액 또는 단백질이 없는 PBS와 조합하는 것은 결과를 개선하지 않았다(보충 도 S1).
2. 튜브의 뚜껑을 고정시키고 37°C에서 150 rpm의 속도로 오비탈 진탕기 상에서 30분 동안 폐를 소화시켰다. 차가운 BSA 완충액 10 mL를 첨가하여 반응을 정지시킨다.
3. 소화 후 18G 바늘을 사용하여 폐 조각을 혼합하고 용해시킵니다. 70 μm 필터 스트레이너를 새로운 50 mL 코니컬 튜브의 상단에 놓습니다.
   참고: 더 작은 미크론 필터를 사용하면 주요 골수성 집단이 손실될 수 있습니다.
4. 소화 된 폐 혼합물을 스트레이너에 직접 천천히 옮깁니다. 10mL 주사기 플런저의 고무 면을 사용하여 필터의 나머지 폐 조각을 부수십시오. 필터에서 처리 된 재료를 BSA 버퍼로 씻으십시오.
5. 단일 세포 현탁액을 4°C에서 8분 동안 350 × g 에서 원심분리한다.
6. 조심스럽게 상청액을 버리고 세포를 ACK 용해 완충액 1 mL에 재현탁시킨다. 1 mL 피펫을 사용하여 잘 혼합하고, 실온에서 90 s 동안 인큐베이션한다.
7. 차가운 BSA 버퍼 10 mL를 첨가하여 반응을 중지시키고 350 × g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 버리고 펠렛을 염색 완충액에 재현탁시켜 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수한다.
8. 세포를 5 × ¹⁰⁶ cells/mL의 농도로 재현탁하고 표면 염색에 사용하십시오 (섹션 3 참조).
   참고: 이 목적을 위해, 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이트화한 다음, 항체 염색 및 세척을 실시한다. 플레이트 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 플레이트 대신 플로우 튜브를 사용하십시오. 이 프로토콜을 사용하면 폐 당 ¹⁰⁶ 개× 15-20 세포를 평균 크기의 6-10 주령 C57BL / 6 마우스로부터 얻을 수 있습니다.

3. 표면 항체 염색

1. 1 × ¹⁰⁶ 세포를 웰 당 200 μL의 96-웰 플레이트로 옮긴다. 플레이트를 350 × g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리한다. 그 동안, 항-16/32 항체 (1:100)를 염색 완충액으로 희석하여 Fc-block 용액을 제조하였다 (표 1).
2. 세포를 미리 제조된 Fc-블로킹 용액 (표 물질)의 50 μL에 재현탁시키고, 4°C 또는 얼음 상에서 15-20분 동안 인큐베이션한다.
3. 150 μL의 염색 완충액을 첨가하고, 플레이트를 4°C에서 5분 동안 350 × g 에서 원심분리한다. 한편, 표면 항체 칵테일을 희석하여 표면 항체 칵테일을 준비하십시오 (1:100; 표 2) 염색 완충액에서.
   참고: (i) Fc-차단을 위한 항-16/32 항체는 동일한 혼합물의 표면 항체와 함께 사용될 수 있다. (ii) 고정 가능한 생존력 염료가 사용되는 경우, 1:1,000의 희석으로 표면 항체 칵테일에 첨가한다.
4. 세포를 미리 제조된 표면 항체 칵테일의 50 μL에 재현탁시키고, 어둠 속에서 4°C에서 30-40분 동안 인큐베이션한다. 염색 완충액으로 세포를 두 번 세척하십시오.
   참고: 세포내 염색이 필요하지 않은 경우, 세포를 200μL의 염색 완충액에 재현탁시키고 유세포 분석기에 대한 데이터 수집을 직접 진행하십시오. 대안적으로, 세포는 고정되고 추후 획득을 위해 4°C에서 저장될 수 있다. 우리는 24 시간 이내에 유세포 측정을 위해 세포를 사용하는 것이 좋습니다.

4. 세포 고정 및 세포 내 염색

1. FoxP3/전사 인자 염색 버퍼 세트의 고정/투과 농축액 3부와 고정/투과 희석제 1부를 혼합하여 고정/투과 완충액(Fix/Perm Buffer)을 준비합니다(표 1).
2. 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 미리 준비된 픽스/퍼름 버퍼 중 50 μL에 재현탁시키고, 여기서 세포를 섹션 3에 기재된 바와 같이 플레이팅하고, 어둠 속에서 4°C에서 20-25분 동안 인큐베이션한다.
3. 10x 투과화 완충액을 정제된 탈이온수에 1:10으로 희석하여 1x 투과 완충액을 제조하였다.
4. 세포를 1x 투과화 완충액으로 한 번 세척한다. 한편, 세포내 항체 (1:100)를 투과 완충액 1 mL에 희석하여 세포내 항체 칵테일을 준비한다.
5. 96-웰 플레이트의 세포당 미리 제조된 표면 항체 칵테일 50 μL를 사용하여 세포를 재현탁시키고, 어둠 속에서 4°C에서 40분 동안 인큐베이션한다.
6. 투과 완충액으로 한 번, 염색 완충액으로 한 번 세포를 씻으십시오. 최종 세척 후, 세포를 200 μL의 염색 완충액에 재현탁시킨다.
   참고: 플레이트 판독기가 있는 유세포 분석기를 사용할 수 없는 경우, 세포를 유세포 분석기 튜브로 옮기십시오.
7. 유세포 분석기 상에서 샘플 당 최소 1.5 × ¹⁰⁶ 세포를 획득한다.
   참고 : 단일 색상 및 염색되지 않은 대조군 샘플의 경우 샘플 당 0.5-1 × ¹⁰⁶ 세포로 충분합니다. 최적의 염색을 달성하고 비용을 줄이기 위해 사용되는 개별 항체를 역가하는 것이 좋습니다. 본 프로토콜은 FoxP3 염색 버퍼 세트를 사용하여 제조된 픽스/펄 버퍼를 사용하여 최적화되었다. CD68은 핵마커가 아닌 세포질이기 때문에, 저농도의 파라포름알데히드 또는 다양한 벤더로부터의 세포고정/사이토퍼름 키트와 같은 다른 투과화 용액으로 충분할 수 있다.

결과

게이팅 전략
게이팅 전략의 첫 번째 단계는 파편과 더블릿을 배제하는 것입니다(그림 1A). 위양성 집단을 피하기 위해 더블릿을 신중하게 배제하는 것이 중요합니다 (보충 그림 S2). 이어서, 면역 세포는 조혈 세포에 대한 마커인 CD45⁺를 사용하여 확인된다(도 1B). 살아있는 죽은 얼룩은 죽은 세포를 배제하기 위해 추가 ...

토론

폐 면역 세포의 확인은 폐에 상주하는 여러 면역 세포 유형과 다른 조직에 거주하는 상대편에 비해 독특한 면역 표현형 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 여러 병리학 적 조건에서 뚜렷한 표현형 특징을 가진 세포가 폐에 나타납니다. 예를 들어, 블레오마이신-유도된 폐 손상은 폐포 공간에서 순환하는 단핵구 유래 대식세포의 모집을 초래하며, 여기서 이들은 일년 동안 남아있을 수 있고 심지어 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co