대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

요약

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

초록

다양한 박테리아 종은 지질, 단백질, 핵산, 글리칸 및 모 세포에서 파생된 기타 분자로 구성된 ~20-300nm의 세포외 소포(EV)를 분비합니다. EV는 종내 및 종간 통신 벡터로 기능하는 동시에 감염 및 식민지화의 맥락에서 박테리아와 숙주 유기체 간의 상호 작용에 기여합니다. 건강 및 질병에서 EV에 기인하는 다양한 기능을 감안할 때 체외 및 생체 내 연구를 위해 EV를 분리하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 물리적 특성, 즉 크기에 기반한 EV의 분리는 다양한 박테리아 배양에서 소포의 분리를 용이하게 할 것이라는 가설이 세워졌습니다.

분리 워크플로우는 박테리아 배양에서 EV를 분리하기 위한 원심분리, 여과, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 구성됩니다. 펌프 구동 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통합하여 확장성을 향상시켜 시작 세포 배양 리터에서 물질을 분리할 수 있습니다. 대장균 은 EV 관련 나노루시퍼라제 및 비EV 관련 mCherry를 리포터 단백질로 발현하는 모델 시스템으로 사용되었습니다. 나노루시페라아제는 N-말단을 사이토리신 A와 융합하여 EV를 표적으로 삼았습니다. 관련 사이토리신 A-나노루크와 함께 20-100nm EV를 포함하는 초기 크로마토그래피 분획은 유리 단백질을 포함하는 후기 분획과 구별되었습니다. EV-관련 나노루시퍼라제의 존재는 면역금 표지 및 투과 전자 현미경에 의해 확인되었다. 이 EV 분리 워크플로우는 다른 인간 장 관련 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 종에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 원심분리, 여과, 한외여과/TFF 및 SEC를 결합하면 다양한 박테리아 종에서 EV를 확장 가능한 분리할 수 있습니다. 표준화된 분리 워크플로우를 사용하면 종 간 미생물 EV의 비교 연구가 용이해질 것입니다.

서문

세포외 소포(EV)는 원핵 세포 및 진^{핵 세포 모두에서} 분비되는 지질, 단백질, 글리칸 및 핵산으로 구성된 나노미터 크기의 리포솜 유사 구조입니다1. 그람 음성 박테리아²에서 EV의 방출을 시각화하는 초기 연구 이후, 박테리아 EV (직경 20-300 nm)에 기인 한 생물학적 기능의 수는 지난 수십 년 동안 지속적으로 증가하고 있습니다. 이들의 기능에는 항생제 내성^전달3, 생물막 형성⁴, 쿼럼 감지⁵ 및 독소 전달⁶이 포함됩니다. 또한 박테리아 EV를 치료제로 사용하는 것, 특히 백신학⁷ 및 암 치료⁸에 대한 관심이 증가하고 있습니다.

EV 연구에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고 격리 방법에 대한 기술적 과제는 여전히 남아 있습니다. 특히, 재현 가능하고 확장 가능하며 다양한 EV 생산 유기체와 호환되는 분리 방법이 필요합니다. EV 분리 및 연구 방법을 계획하고 보고하기 위한 통일된 원칙을 만들기 위해 국제 세포외 소포 학회는 MISEV 입장 논문⁹를 발행하고 업데이트합니다. 또한 EV-TRACK 컨소시엄은 투명성을 높이기 위해 출판된 원고에 사용된 EV 격리에 대한 세부 방법론을 보고할 수 있는 개방형 플랫폼을 제공합니다¹⁰.

이 프로토콜에서, 포유류 세포 배양으로부터 EV의 분리에 사용된 이전의 방법론은 박테리아 세포 배양으로부터 EV의 분리를 가능하게 하기 위해^11,12 조정되었다. 우리는 확장 가능한 다양한 미생물로부터 EV를 분리하고 EV 순도와 수율의 균형을 맞추는 방법을 사용하려고 했습니다(MISEV 입장^{논문 9}에서 논의됨). 원심분리 및 여과로 박테리아 세포 및 파편을 제거한 후, 배양 배지는 원심 장치 한외여과(최대 ~100mL의 부피) 또는 펌프 구동 TFF(더 큰 부피의 경우)에 의해 농축됩니다. 그런 다음 EV는 소형 EV의 정제에 최적화된 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 분리됩니다.

그림 1: 박테리아 EV 격리 워크플로 회로도 개요. 약어 : EV = 세포 외 소포; TFF = 접선 유동 여과; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; MWCO = 분자량 컷오프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Escherichia coli (즉, E. coli MP1¹³)의 마우스-공생 균주를 모델 유기체로서 사용하였고, 이전에 보고된 바와 같이, 세포리신 A에의 융합에 의해 EV-관련 나노루시퍼라제를 발현하도록 변형시켰다¹⁴. 여기에 사용 된 방법은 적어도 몇 리터의 박테리아 배양을 처리하고 EV 관련 단백질과 비 EV 관련 단백질을 효과적으로 분리 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 다른 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 종에도 사용할 수 있습니다. 보고된 실험의 모든 관련 데이터는 EV-TRACK 지식 베이스(EV-TRACK ID: EV210211)¹⁰에 제출되었습니다.

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프로토콜

알림: 박테리아 및 재조합 DNA와 관련된 모든 작업이 각 균주의 생물안전 위험 수준에 적합한 생물안전 억제를 위한 모범 사례를 따르는지 확인하십시오. 작업은 지역, 국가 및 국제 생물 안전 규정에 따라 수행되어야합니다.

1. 세균 균주 및 배양 조건

참고: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 대장균 MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium Breve 및 Bifidobacterium dentium이었습니다 .

1. 대장균의 경우 멸균 루프를 사용하여 단일 콜로니를 250-1,000mL의 Luria-Bertani(LB) 브로스에 접종하고 배양을 처리하기 전에 300rpm 및 37°C의 진탕 인큐베이터에서 48시간 동안 호기적으로 배양합니다. p114-mCherry-Clyluc(보충 방법 및 보충 그림 S1)이 있는 재조합 대장균 MP1 균주의 경우 최종 농도 17μg/mL로 LB 한천 및 브로스에 클로람페니콜을 추가합니다.
2. A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve 및 B. dentium의 경우 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에 줄무늬를 남기고 비닐 혐기성 챔버 내부에서 혐기성으로 배양합니다. 단일 콜로니를 미리 환원된 BHI 브로스 100mL에 접종하고 혐기성 48시간 동안 배양합니다.

2. EV 절연

1. 원심분리 및 여과를 통한 박테리아 배양 배지 정화
   1. 단계 1에서 접종된 박테리아 세포 배양액을 250 mL 또는 500 mL 폴리프로필렌 원심분리 병에 부어 세척한다. 대용량 고정각 로터에서 병을 4°C 및 5,000×g에서 15 분 동안 원 심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 부어 원심분리기 병으로 옮기고 10,000× g 에서 15분 동안 다시 원심분리합니다.
      알림: 생물학적 안전성에 적합한 세척 및 오염 제거 후 병을 재사용하십시오.
      1. 두 번째 원심분리 후 박테리아 세포의 큰 펠릿이 존재하면 깨끗한 병에서 원심 분리를 반복하여 세포를 추가로 제거합니다.
   2. 상청액을 적절한 크기의 0.22 μm 폴리에테르술폰 진공 구동 필터 장치에 붓습니다. 여과 장치를 진공 벽 공급 장치에 연결하여 필터링합니다. 여과율이 크게 떨어지면 여과되지 않은 재료를 새 장치로 옮기기만 하면 됩니다. 여과된 배지를 4°C에서 밤새 보관하고, 원한다면 다음날 프로토콜을 계속한다.
      참고: 위의 원심분리는 일반적으로 각 장치를 통해 표시된 세포 배양량의 ~2배를 처리할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 500mL 필터 장치는 ~1,000mL의 사전 원심분리 배양물을 필터링할 수 있습니다. 이러한 장치는 일반적으로 재사용되지 않습니다. 이 단계에서 주사기 필터를 사용하는 것은 테스트 된 모델에서 상당한 손실이 발견되었으므로 최적화하지 않으면 권장되지 않습니다. 이것은 잠재적인 중지 지점입니다.
   3. 여과된 상청액의 분취량을 적합한 한천 플레이트에 확산시킴으로써 이 시점에서 생존 세포의 완전한 제거를 확인하고 박테리아 균주에 대한 최적 조건에서 배양한 후 임의의 콜로니가 없는지 확인한다. 박테리아가 검출되면 추가 원심분리 및/또는 여과를 수행하여 위의 절차를 더욱 최적화하십시오.
2. 여과된 매체의 농도
   1. 100mL> 부피로 작업하는 경우 2.2.2단계로 진행하십시오. ~100mL의 부피로 작업하는 경우 혈청학적 피펫을 사용하여 여과된 배양액 90mL를 각 용량 100kDa 분자량 차단(MWCO) 원심 한외여과 장치의 저장소에 로드합니다. 항상 일치하는 한외여과 장치와 균형을 이루고 상단 저장소의 배지 부피가 <0.5mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000× g 의 스윙 버킷 로터에서 15-30분 간격으로 원심분리합니다.
      1. 남은 여과된 배양 배지로 저장소를 채우십시오. "보충"하는 경우 장치 하단의 플로우 스루를 제거하고 모든 장치의 균형을 다시 조정하십시오.
         참고: 이러한 장치를 사용하여 농축할 수 있는 여과된 배양 배지의 최대 부피는 권장 부피의 <2배인 것으로 관찰되었습니다.
      2. 저장소에서 농축된 배지의 점도가 눈에 띄게 증가하면(어둡고 점성이 있는 물질), 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하고 원심분리에 의해 다시 농축하여 100kDa의 MWCO보다 작은 임의의 비 EV 단백질을 희석한다.
         참고: 이것은 잠재적인 정지 지점입니다.
      3. 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮기고, 4°C에서 밤새 저장하고, 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속한다.
   2. 100mL> 부피로 작업하는 경우 처리할 부피를 수용할 수 있는 적절한 크기의 TFF 장치(100kDa MWCO)를 선택하십시오.
      참고: 100mL에서 >1,000mL를 처리하기 위한 여과 장치는 상업적으로 이용 가능합니다. 현지 가용성, 비용 및 펌프 및 튜브/연결과의 호환성에 따라 가장 유용한 특정 모델이 결정됩니다. 필터를 청소하기 전에 재료 표에 표시된 장치로 최대 2L의 배양액을 처리했습니다(세척 프로토콜은 아래 2.3단계 참조).
      1. 보충 그림 S16에 표시된 대로 #8 저바인딩/저침출 튜브, 1/8인치 호스 바브-Luer 어댑터, TFF 장치 및 연동 펌프로 여과 회로를 조립합니다.
         알림: 생물안전 캐비닛 내에서 TFF를 수행하여 EV 준비를 환경 박테리아로 오염시킬 위험을 최소화하십시오.
      2. 실온에서 여과되고 조절된 배지를 약 200mL/분(최소 100mL/분)으로 순환시키기 시작합니다. 눈금이 매겨진 용기에 200mL의 PBS를 펌핑하여 원하는 유량에 해당하는 적절한 RPM을 결정합니다. 여과된 조절 배지를 순환시킬 때, 한외여과막을 가로지르는 분자 <100 kDa를 별도의 용기에 폐기물로서 수집한다.
         참고: 아래 예에서는 2L의 배양 시작 부피를 가정합니다.
      3. 부피가 ~ 100-200 mL로 감소 될 때까지 조절 된 배지를 계속 순환시킵니다. 필요에 따라 더 작은 선박으로 이동하십시오. PBS로 2 배 희석하고 펌프로 계속 순환하여 75-100 mL까지 농축합니다. PBS로 2배 희석하고, 최종 부피 25 mL까지 계속 순환시킨다. PBS로 2 배 희석하고 <10mL까지 계속 순환시킵니다.
      4. 시료 저장소에서 공급 튜브를 들어 올리고 계속 펌핑하여 필터를 퍼지하고 최대량의 시료를 회수합니다.
         참고: 이것은 잠재적인 정지 지점입니다.
      5. 농축된 샘플을 원뿔형 튜브로 옮기고 원하는 경우 4°C에서 밤새 보관합니다. 또는 프로토콜을 계속 진행합니다.
      6. 농축된 샘플을 15 mL 용량의 100 kDa MWCO 원심 한외여과 장치로 옮긴다. 상단 저장소의 배지 부피가 <2mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000× g 의 스윙 버킷 로터에서 15-30분 간격으로 원심분리합니다.
         참고: 이것은 잠재적인 정지 지점입니다.
      7. 농축된 배지를 저단백 결합 튜브로 옮기고, 4°C에서 밤새 저장하고, 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속한다.
3. TFF 장치 청소(선택 사항)
   알림: TFF 장치가 공정 중에 "막히기" 시작하면 여과 속도가 감소합니다(오염). 필요한 경우 필터 장치를 세척하여 동일한 정제 실행에서 추가 샘플을 쉽게 여과할 수 있습니다. 이론적으로는 가능하지만 교차 오염을 방지하기 위해 세척된 TFF 필터는 다른 정화 실행에 사용되지 않았습니다.
   1. 청소하려면 TFF 장치에서 모든 튜브와 캡을 제거하고 잔류 액체를 배출하십시오.
   2. 연동 펌프와 튜브를 사용하여 TFF 장치의 내부 및 외부 구획(즉, 재료 표에 나열된 모델의 병렬 및 수직 포트를 통해)을 ~100mL의 증류수로 가득 채웁니다. 모든 튜브/캡을 제거하고 TFF 장치를 배출합니다.
   3. 외부(수직, 여과액) 포트를 덮고 증류수에 250mL의 20% 에탄올을 >200mL/분으로 내부 구획을 통해 10분 동안 순환시킵니다. 배수하고 증류수로 범람시킨 후 위와 같이 다시 배수하십시오.
   4. 내부 구획을 통해 250mL의 0.5N 신선한 NaOH 용액을 30분 동안 순환시키고 다시 배수합니다.
   5. 보충 그림 S2와 같이 모든 튜브와 캡을 입구, 출구 및 여과 포트에 다시 연결하고 0.5mL/cm2 필터 표면적의 >부피가 1mL/^cm2 필터 표면적이 필터 멤브레인을 통해 침투하여 여액/폐기물로 수집될 때까지 0.5N NaOH 용액을 다시 순환시킵니다.
   6. 위와 같이 증류수로 TFF 장치를 헹굽니다. TFF 장치를 즉시 사용하거나 ~100mL의 20% 에탄올로 장치를 가득 채우고 4°C에서 밤새 보관하십시오.
      알림: 에탄올에 보관하는 경우 >1mL/^cm2 의 필터 표면적이 필터 멤브레인을 통해 스며들고 여과액/폐기물로 수집되어 시료 처리 전에 잔류 에탄올을 제거하기 위해 여과액/폐기물로 수집될 때까지 장치를 통해 2mL의 PBS를 배수하고 물로 헹구고 배수 및 순환시키십시오.
4. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
   참고: SEC는 EV의 순도를 높이고 비소포 단백질을 제거하는 데 사용됩니다.
   1. 출발 물질 <100mL에서 EV를 분리하려면 작은 SEC 컬럼(10mL 베드 부피)을 사용하고 >100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 더 큰 컬럼(47mL 베드 부피)을 사용합니다.
      참고: 아래 예에서는 큰 열에 대한 볼륨을 나열하고 괄호 안에 작은 열에 대한 볼륨을 나열합니다.
   2. SEC 컬럼과 PBS를 몇 시간에 걸쳐 실온에 둡니다. 표준 실험실 스탠드와 홀더를 사용하여 수직 위치에서 SEC 컬럼을 안정화합니다. 또는 상업용 크로마토그래피 컬럼 스탠드를 사용하십시오.
   3. SEC 컬럼에 연결하기 전에 5mL의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 시료 저장소에 수분을 공급합니다. SEC 컬럼의 입구 캡을 풀고 샘플 저장소에 PBS 2mL를 추가한 다음 PBS가 프릿을 통해 떨어지므로 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다(작은 SEC 컬럼에는 적용되지 않음).
      알림: 이 이전 단계는 기포가 SEC 열의 맨 위에 갇히는 것을 방지합니다. 공기가 갇힌 경우 저장소를 제거하고 컬럼을 탭하여 기포를 빼낸 다음 연결 절차를 반복하십시오. 더 작은 컬럼의 경우 SEC 컬럼의 상단을 열고 샘플 호퍼를 부착하기만 하면 됩니다.
   4. 47mL(10mL)의 PBS를 시료 저장소에 추가하고 SEC 컬럼의 하단을 풉니다. 로드된 모든 샘플 버퍼가 평형을 위해 컬럼을 통과하도록 합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
   5. 최대 2mL(0.5mL)의 시료를 시료 저장소에 로드하고 플로우스루를 폐기한 후 시료가 컬럼에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다.
   6. PBS를 시료 저장소 또는 호퍼에 14.25mL에서 시료 부피를 뺀 값(3mL에서 작은 컬럼의 경우 시료 부피를 뺀 값)으로 즉시 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 하고 컬럼 보이드 부피와 동일한 이 양을 폐기합니다.
      참고: 일반적인 2mL 샘플의 경우 샘플 저장소 또는 호퍼에 추가할 PBS의 양은 12.25mL입니다.
   7. 2mL 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 놓습니다. 즉시 2mL(0.5mL)의 PBS를 샘플 저장소에 추가하고 컬럼에 들어가도록 합니다. 이 처음 2mL(0.5mL)의 플로우스루를 분획 1로 표시합니다. 한 번에 2mL (0.5mL)를 샘플 저장소에 계속 추가하여 각각의 후속 분획을 수집합니다.
      알림: 대부분의 박테리아 EV는 처음 5개의 분획에서 용리됩니다. 최적화하는 동안 처음 12 개의 분획이 수집되었습니다.
   8. 분획을 단기 보관(일)의 경우 4°C에서 저장하거나 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관하십시오.
   9. 재사용 가능한 SEC 컬럼의 청소 및 보관
      참고: 이 프로토콜에 설명된 SEC 열은 제조업체에 따라 최대 5회까지 재사용할 수 있습니다. <5회 사용 후 SEC 컬럼의 유속이 감소하면 제조업체는 농축된 샘플을 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 SEC 전에 응집체를 제거할 것을 권장합니다. 그런 다음 EV 분리를 위해 이 원심분리의 상청액을 SEC 컬럼에 로드합니다.
      1. 사용 후 SEC 컬럼을 세척하고 보관하려면 0.5M NaOH 2mL(0.5mL)를 넣고 컬럼에 완전히 들어가도록 합니다. 컬럼을 통해 20% 에탄올 100mL(20mL)를 실행하고 다음 사용 때까지 4°C에서 보관합니다. 다음 사용 전에 에탄올을 위와 같이 실온으로 평형화하고 컬럼을 통해 PBS 150mL(30mL)를 추가로 실행하여 PBS 완충액으로 교환합니다.
      2. 사용 후 SEC 컬럼을 세척하고 즉시 재사용하려면 0.5M NaOH 2mL(0.5mL)를 넣고 컬럼에 완전히 들어가도록 합니다. 약 150mL(30mL)의 PBS 버퍼를 실행하여 NaOH를 씻어냅니다. 용출액의 pH가 PBS(~7)와 같으면 새 샘플을 로드할 수 있습니다.

3. EV 준비 품질 관리

1. 무균 테스트
   알림: 이러한 EV는 박테리아 배양에서 나오기 때문에 다운스트림 사용 전에 무균성을 보장하는 것이 중요합니다.
   1. 분석에 사용할 분획 100μL(20μL)를 얻고 공급원 박테리아를 성장시키는 데 사용된 배지 3mL를 접종합니다. 각각의 최적 조건 하에서 적어도 3일 동안 배양하고 탁도를 관찰한다. 또는 분획 샘플을 생산 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 배지가 포함된 한천 플레이트에 적용하고 콜로니 형성을 찾습니다.
      알림: 박테리아 오염이 감지되면 실험에 EV 준비를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신, (a) 조절된 박테리아 세포 배양 배지의 충분한 원심분리/여과를 수행하고, (b) 깨끗한 병, 튜브, 필터 및 크로마토그래피 컬럼을 사용하고, (c) 적절한 무균 기술을 사용하여 박테리아 오염 위험을 최소화하도록 주의하면서 분리를 반복합니다.
2. 단백질 정량
   참고: 고감도 형광 기반 단백질 정량 키트가 사용되었습니다( 재료 표 참조). 이 키트는 485/590 nm의 여기/방출 파장에서 일치하는 독점 형광계와 함께 작동합니다.
   1. 모든 시약, 표준물질 및 샘플을 실온으로 가져옵니다.
   2. 분석할 각 샘플 및 표준물질에 대해 1μL의 시약을 199μL의 버퍼에 추가하여 단백질 시약과 버퍼의 마스터 믹스를 준비합니다. 얇은 벽의 0.5mL PCR 튜브를 사용하여 각 표준 튜브에 10μL 표준 + 190μL의 마스터 믹스를 추가합니다.
      참고: 분석 범위 내에 있으려면 각 샘플 튜브에 첨가되는 각 분획의 양은 정제의 예상 단백질 수율에 따라 다릅니다. 전형적으로, 각 분획의 5 μL + 195 μL의 마스터 믹스가 사용되었다. 샘플 + 마스터 믹스의 최종 부피는 200 μL여야 합니다.
   3. 분석 튜브를 와동시키고, 암실에서 실온에서 적어도 15분 동안 배양한다.
   4. 적절한 독점 형광계( 재료 표 참조)에서 화살표 버튼을 사용하여 단백질 분석 옵션을 선택하고 GO 버튼을 눌러 확인합니다. 화면의 지시에 따라 각 표준 튜브를 삽입하고 GO를 누릅니다.
   5. 실험 샘플 튜브를 삽입하는 단계; 읽으려면 GO 를 누르십시오. 그리고 분석 완충액/샘플 혼합물의 실제 단백질 농도인 표시된 결과를 확인합니다. 샘플의 단백질 농도를 얻으려면 화살표 키를 사용하여 샘플 농도 계산 옵션을 선택하고 GO를 누른 다음 화살표 키를 사용하여 주어진 샘플의 분석 버퍼에 추가된 샘플 부피 를 선택합니다. GO 를 누르고 샘플 단백질 농도를 기록합니다. 분석할 각 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
3. 입자 계수 및 크기 분포
   참고: 미세유체 저항성 펄스 감지(MRPS)를 사용하여 EV 농도 및 크기 분포를 정량화했습니다.
   1. 0.02μm 주사기 필터를 통해 여과된 1% Tween-20이 보충된 PBS에서 샘플을 약 0.1μg/mL의 단백질 농도로 희석합니다.
      참고: 희석의 목표는 EV 함유 분획에서 10¹⁰ particles/mL 범위의 예상 입자 농도에 도달하는 것입니다. 최적의 희석은 경험적으로 결정될 필요가 있을 수 있다. 이후 분수(분수 6 이상)에 대해서는 EV가 거의 없을 것으로 예상됩니다. 따라서 입자 농도는 낮은 희석률로 분석하더라도 <10¹⁰ particles/mL일 것입니다.
   2. 각 시료 3μL를 마이크로피펫으로 일회용 미세유체 카트리지에 로드하고 카트리지를 MRPS 기기에 삽입한 다음 파란색 조명 테두리가 있는 금속 버튼을 누릅니다.
   3. 수집 소프트웨어에서 Go! 를 클릭하고 기기에서 샘플을 분석할 때까지 기다립니다. 1,000개에서 10,000개의 파티클 이벤트를 수집하여 분석의 기술적 통계적 오류를 최소화합니다. 이 시점에서 중지 및 실행 종료 를 클릭하여 샘플 수집을 완료합니다.
      참고: 원시 데이터 파일과 함께 기기는 샘플의 입자 농도를 나열하는 요약 스프레드시트를 출력합니다. 샘플 희석에 따라 이 값을 수정합니다.
   4. 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 로드하고 크기 분포의 맞춤형 그래프를 생성합니다.

4. EV 스토리지

1. 개별 또는 풀링된 분획을 저단백질 결합 튜브에서 개별 분획 크기(사용된 컬럼 크기에 따라 다름)의 25-50%로 분취하고 동결-해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 보관합니다.
   참고: 다른 응용 분야에서는 각 실험에 사용된 예상 양에 따라 더 작거나 더 큰 분취량이 필요할 수 있습니다. 이것은 경험적으로 결정되어야합니다. 비 EV 함유 분획은 연구 목표에 적용 할 수없는 경우 폐기 할 수 있습니다.

5. 투과전자현미경

1. 음성 염색
   1. 5μL의 EV 샘플을 탄소 코팅된 구리 400메쉬 그리드에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 5 mM Tris 완충액(pH 7.1) 5방울로 시편 면을 세척한 다음 증류수 5방울로 세척합니다.
   2. 표본면을 2 % 우라 닐 아세테이트 5 방울로 얼룩지게합니다. 여과지로 여분의 얼룩을 닦아내고 그리드를 몇 시간 또는 밤새 완전히 건조시킵니다. 80kV에서 작동하는 전자 현미경으로 표본을 시각화합니다.
2. 면역골드 라벨링
   1. EV 현탁액 10μL를 포름바/탄소 400 메쉬 그리드에 적용하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그리드를 PBS로 3회 세척한 다음 4% 파라포름알데히드를 10분 동안 적용하여 샘플을 고정합니다. PBS로 그리드를 5 번 씻으십시오.
   2. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS를 3회 세척하여 그리드를 차단한다. 그런 다음 실온에서 40분 동안 1차 항체 10μL를 적용합니다(여기서는 nluc 항체 1μg/mL). 0.1% BSA가 함유된 PBS로 다시 3회 세척합니다.
   3. 10μL의 2차 금 표지 항체를 그리드에 추가하고 실온에서 40분 동안 배양합니다. PBS로 그리드를 세 번 씻으십시오.
      참고: 여기서, 10nm 금 나노입자와 접합된 염소 항-마우스 항체를 블로킹 완충액에서 1:10으로 희석한 후 사용하였다. 금 라벨링이 EV 시각화를 가리는 경우 더 작은 금 나노입자(예: 5nm)를 가진 2차 항체를 대신 사용할 수 있습니다.
   4. 그리드를 실온에서 10분 동안 10μL의 2.5% 글루타르알데히드로 사후 고정합니다. PBS로 세 번 씻으십시오. 2% 우라닐 아세테이트(10μL)로 15분 동안 음성 염색을 수행합니다. 샘플을 10 μL의 0.5 % 우라 닐 아세테이트 및 0.13 % 메틸 셀룰로오스 용액에 10 분 동안 삽입합니다.
   5. 전자 현미경으로 이미징하기 전에 샘플 그리드를 실온에서 밤새 건조시킵니다.
   6. 현미경 획득 소프트웨어에서 최적의 이미지 품질(예: 이 특정 설정에서 0.80851초)을 얻기 위해 경험적으로 노출을 결정하고 노출 시간 옵션 상자에 이 값을 입력하여 조정합니다. 80kV 옵션을 선택하고 획득 시작을 클릭하여 이미지를 캡처합니다.

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결과

EV에 대해 어떤 SEC 크로마토그래피 분획이 농축되었는지 평가하기 위해 SEC 컬럼에 TFF에 의해 1,000배 농축된 대장균 MP1 조절 배양액 2mL를 로드하고 순차적 분획을 수집했습니다. MRPS를 사용하여 분획 1-6에 가장 많은 EV가 포함되어 있음을 알 수 있습니다(그림 2A). 후속 분획에는 EV가 없는 단백질 대신 포함된 EV가 거의 포함되어 있지 않았습니다(그림 2B

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토론

위의 프로토콜에서는 확장 가능하고 다양한 그람 음성/양성 및 호기성/혐기성 박테리아로부터 EV를 안정적으로 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 몇 가지 잠재적인 정지 지점이 있지만 컨디셔닝된 박테리아 배양 배지에서 EV를 분리하는 데 48시간 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.

첫째, 컨디셔닝 된 박테리아 배양 배지를 생성하기 위해 박테리아를 배양?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter	Beckman Coulter	392077	Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusion (BHI) broth	Himedia	M2101	After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramphenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Electron microscope	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (gift)		commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)	Electron microscopy sciences	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller	Difco	244620
L-Cysteine Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-08	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-24	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3)	MP	102259	Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack	Izon		for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit	ThermoFisher	Q33211	Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Microplate reader	Molecular Devices		This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate	Electron microscopy sciences	22400
Vinyl anaerobic chamber	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	to filter MRPS diluent