Brefeldin A Injection에 의한 신장에서 분비되는 단백질의 출처 확인

요약

사이토카인 분비를 담당하는 세포 유형을 식별하는 것은 신장 질환의 병리생물학을 이해하는 데 필요합니다. 여기에서는 분비 억제제인 브레펠딘 A(brefeldin A)와 세포 유형 특이적 마커(cell-type-specific marker)를 사용하여 신장 상피 세포나 간질 세포에서 생성되는 사이토카인에 대해 신장 조직을 정량적으로 염색하는 방법을 설명합니다.

초록

만성 신장 질환(CKD)은 미국에서 가장 큰 10대 사망 원인 중 하나입니다. 급성 신장 손상(AKI)은 종종 회복 가능하지만 환자는 나중에 CKD에 걸리기 쉽습니다. 신장 상피 세포는 AKI와 CKD 모두에서 주요 신호 노드로 확인되었으며, 이를 통해 세포는 사이토카인 및 기타 단백질의 분비를 통해 질병의 진행을 결정할 수 있습니다. 특히 만성콩팥병의 경우, 부적응적으로 복구된 세뇨관 세포가 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 결합 조직 성장 인자(CTGF) 및 기타 프로브로틱 사이토카인의 분비를 통해 질병 진행을 촉진한다는 여러 가지 증거가 있습니다. 그러나 in vivo 에서 다양한 세포 유형에서 분비되는 단백질의 출처와 상대적인 수를 식별하는 것은 여전히 어려운 일입니다.

본 논문은 브레펠딘 A(BFA)를 사용하여 사이토카인 분비를 방지하고, 표준 면역형광 기법을 사용하여 신장 조직에서 사이토카인을 염색할 수 있는 기법에 대해 설명합니다. BFA는 사이토카인 및 기타 단백질의 분비에 필요한 소포체(ER)에서 골지체로의 장치 수송을 억제합니다. 희생 6시간 전에 BFA를 주입하면 AKI의 마우스 시스플라틴 모델에서 근위세뇨관 세포(PTC) 내부에 TGF-β, PDGF 및 CTGF가 축적되고 CKD의 마우스 아리스토록산(AA) 모델에서 TGF-β이 축적됩니다. 분석 결과 BFA + 시스플라틴 또는 BFA + AA는 BFA + 식염수, 시스플라틴 또는 AA 단독에 비해 TGF-β 양성 신호를 유의하게 증가시켰습니다. 이러한 데이터는 BFA를 사용하여 특정 사이토카인을 생성하는 세포 유형을 식별하고 생산된 사이토카인의 상대적 양 및/또는 다양한 유형을 정량화할 수 있음을 시사합니다.

서문

세계 인구의 >10%가 어떤 형태로든 신장 질환을 앓고 있는 것으로 추정됩니다¹. 빠른 발병으로 정의되는 AKI는 대부분 치료가 가능합니다. 그러나 AKI의 발병은 환자가 나중에 CKD로 발전하기 쉬운 원인이 될 수 있습니다 ^2,3. AKI와 달리 만성콩팥병은 진행성 섬유증과 신장 기능 악화가 특징이며, 이로 인해 신대체 요법이 필요한 말기 신장 질환이 발생합니다. 신장에 가해지는 대부분의 손상은 네프론을 구성하는 podocytes 또는 근위세뇨관 세포와 같은 특수 상피 세포를 대상으로 합니다 ^4,5. 손상 후 살아남은 상피 세포는 사이토카인과 다른 단백질의 분비를 통해 복구 반응을 조정하는 데 도움을 줍니다. 이러한 방식으로 살아남은 세포는 면역 반응을 조절하고 세포 외 기질 리모델링을 지시하며 장기 회복을 도울 수 있습니다.

사이토카인(Cytokine)은 다세포 유기체의 성숙, 성장 및 반응성을 조절하는 데 필수적인 작고 분비되는 단백질입니다 ^6,7. 이들은 면역 세포와 상피 세포를 포함한 다양한 세포 유형 사이에서 신호 전달자로 기능합니다⁸. 사이토카인은 주로 면역 세포에 의해 분비되는 것으로 생각되지만, 오랜 연구에 따르면 신장 상피 및 간질 세포도 세뇨관 세포, 간질 세포 및 면역 세포와 같은 다른 상주 신장 세포에 대한 신호로 사이토카인을 분비하는 것으로 입증되었습니다 ^9,10. 특히 PTC는 AKI¹¹ 이후의 시작 및 회복 단계에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 부적응 복구된 PTC는 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 혈소판 유래 성장 인자-D(PDGF-D) 및 결합 조직 성장 인자(CTGF)와 같은 프로브로틱 사이토카인을 분비하여 CKD 진행에 기여하는 것으로 알려져 있습니다¹². 따라서 신장 상피 세포는 분비된 사이토카인을 사용하여 신장 손상을 조절합니다.

신장 상피 세포가 사이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있지만, 분비되는 단백질을 연구하는 기술적 어려움으로 인해 각 세포 유형의 정확한 출처와 상대적 기여도를 파악하기 어려웠습니다¹³. 사이토카인을 측정하는 데 사용되는 일반적인 접근법인 유세포 분석은 손상된 신장, 특히 섬유화가 심한 신장에 대해 수행하기 어렵습니다. 사이토카인 프로모터에 의해 구동되는 Cre 재조합효소를 통해 사이토카인 리포터 마우스는 주어진 사이토카인을 발현하는 세포 유형을 식별하는 데 자주 사용됩니다. 그러나 리포터 마우스의 사용은 다양한 녹아웃 배경으로 리포터 마우스를 교차시켜야 하는 요구 사항, 적절한 리포터의 부족, 한 번에 하나의 사이토카인만 분석할 수 있다는 사실로 인해 제한적입니다. 따라서 사이토카인 방출 신장 세포를 검출하기 위한 간단하고 다재다능하며 저렴한 기술을 개발해야 합니다.

우리는 생체 내에서 소포체-골지체 수송을 차단하는 분비 억제제인 BFA를 주입하면 유세포 분석^{기반 분석 14,15}에서 볼 수 있듯이 신장 조직에서 분비된 단백질의 염색이 가능하다는 가설을 세웠습니다(그림 1A, B). 세포 유형 특이적 제작자와 함께 이 기술은 손상된 신장에서 사이토카인 생성 세포의 출처와 상대적 기여도를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 유세포 분석을 위한 샘플과 달리, 고정 조직은 단백질과 세포 구조를 보존하면서 장기간 보관할 수 있어 분비 세포를 보다 철저하게 조사할 수 있습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 AKI(시스플라틴) 모델 및 CKD(아리스토로칙산 신병증(AAN) 모델로 마우스 신장을 손상시키고 BFA를 주입하고 표준 면역형광 기술을 사용하여 염색했습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 실험은 밴더빌트 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용자 위원회에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 동물

1. 시스플라틴 또는 아리스톨로칙 산 유발 신병증에는 8-12주 된 BALB/c 수컷 마우스(체중: 약 25g)를 사용하십시오.
2. 생쥐가 건강하고 싸움으로 인한 고통이나 부상의 명백한 징후가 없는지 확인하십시오.
   참고: 특히 꼬리에 대한 상처는 여기에 설명된 프로토콜을 방해할 수 있습니다. BALB/c 마우스는 이 마우스에서 주사를 위한 꼬리 정맥을 시각화하는 것이 더 쉽기 때문에 선택되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 마우스 균주에 대해 작동합니다. 그러나 시스플라틴 또는 아리스톨로칙산의 복용량은 균주에 따라 다를 수 있습니다.

2. 시스플라틴 주사

1. 시스플라틴을 멸균 식염수에 최종 농도 1mg/mL로 용해합니다.
   알림: 시스플라틴은 실온에서 완전히 용해되지 않습니다. 흄 후드에서 처리해야 합니다.
2. 시스플라틴 용액을 37°C의 수조에서 가열하고 시스플라틴이 완전히 용해될 때까지 반복적으로 와류를 일으킵니다.
3. 마우스의 무게를 측정하고 체중 20mg/kg(bw)을 주입하는 데 필요한 시스플라틴 용액의 부피를 계산합니다.
4. 포비돈-요오드(7.5%)와 알코올(70%) 면봉을 각각 3회씩 번갈아 사용하여 복부 피부를 소독합니다.
5. 인슐린 주사기에 25G 바늘을 사용하여 시스플라틴 용액을 복강에 주입합니다.
6. 주사 후 3일째에 섹션 4로 진행합니다.

3. Aristolochic 산 (AA) 주입

1. aristolochic acid-I를 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.5mg/mL의 최종 농도로 용해시킵니다.
   알림: AA는 흄 후드에서 처리해야 합니다. AA-I는 신장 손상을 유발하는 지배적인 형태이므로 사용해야 합니다.
2. AA 용액을 37°C의 수조에서 데우고 완전히 용해될 때까지 반복적으로 와류를 일으킵니다.
3. 마우스의 무게를 측정하고 AA 용액의 부피를 계산하여 5mg/kg bw를 주입합니다.
4. 포비돈 요오드(7.5%)와 알코올(70%) 면봉을 3회 사용하여 복부 피부를 소독합니다.
5. 인슐린 주사기에 25G 바늘을 사용하여 AA 용액을 복강에 주입합니다.
6. 격일로 AA를 주사하여 총 3회 주사합니다.
7. 마지막 주입 후 42일째에 섹션 4로 진행합니다.

4. BFA 용액의 제조

1. BFA를 10mg/mL의 농도로 디메틸설폭사이드에 용해시켜 원액을 만듭니다.
2. 원액을 -20°C에서 보관하십시오.
3. BFA 원액을 최종 작업 농도 1.25mg/mL에서 멸균 PBS로 희석합니다.
   참고: 주입 직전에 매번 새로운 작업 용액을 준비하십시오.

5. BFA의 꼬리 정맥 주입

1. 주사하기 전에 케이지를 반은 착용하고 가열 패드를 반은 10분 동안 떨어뜨려 쥐가 꼬리 혈관의 혈관 수축을 일으키고 주입을 방해할 수 있는 체온 강하를 방지하기 위해 따뜻한지 확인합니다.
   알림: 케이지의 절반은 패드 위에 있고 절반은 그렇지 않도록 케이지를 가열 패드 위에 놓습니다. 그렇게 하면 생쥐가 따뜻하다고 느낄 때 케이지 반대편으로 이동할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
2. 적절한 크기의 시판되는 억제 장치를 사용하여 마우스를 제지합니다.
3. 위에서 설명한 대로 포비돈 요오드와 알코올 면봉을 사용하여 꼬리를 3회 소독합니다.
4. 꼬리를 수평으로 잡고 측면 꼬리 정맥을 시각화합니다(그림 1C). 꼬리 아래에 있는 광원을 사용하여 정맥을 시각화합니다.
5. 28g의 바늘을 삽입하고 바늘과 주사기를 머리 방향으로 정맥과 평행하게 유지합니다.
6. 1.25mg/mL BFA 용액(0.25mg BFA) 200μL를 주입합니다. 혈액이 주사 용액으로 교체될 때 정맥이 깨끗해질 때까지 기다리면 주사가 성공했음을 나타냅니다.
7. 바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 꼬리를 부드럽게 누릅니다.
8. 생쥐를 케이지로 되돌려 놓고 추가 출혈이나 고통의 징후가 있는지 모니터링합니다.

6. 신장의 희생과 수확

1. 이소플루란을 과다 투여한 마우스와 BFA 주사 후 6시간 후에 경추 탈구를 유발하는 마우스를 안락사시킵니다.
   참고: 6시간 시점은 다른 장기에서 6시간 동안 BFA를 치료하면 세포 내에 사이토카인이 충분히 축적되어 면역형광 염색으로 이를 시각화할 수 있음을 입증하는 문헌을 기반으로 선택되었습니다¹⁶.
2. 제물 직후, 복부 정중선 절개로 마우스의 복부와 심장을 노출시킵니다.
3. 심장 천자에 의한 혈액 요소 질소(BUN) 분석을 위해 100-500μL의 혈액을 수집합니다. 25G 바늘과 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 혈액을 채취합니다. 응고를 방지하기 위해 각 샘플에 5μL의 헤파린 용액(100mg/15mL의 dH₂O)을 추가합니다.
   참고: BUN 분석에는 최소 20μL의 혈액이 필요합니다. 그러나 안락사 후 심장 천자로 약 500μL를 수집할 수 있으며 이는 다른 분석에 유용할 수 있습니다. 가능한 한 많은 피를 모으십시오.
4. 아래 섹션 7에서 신장이 수집될 때까지 혈액 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
   1. 혈액 샘플을 1,300 × g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   2. 플라즈마를 부드럽게 분리하고 아래 섹션 17에서 BUN 분석을 수행할 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관합니다. 또는 크레아티닌 분석을 위해 혈장 샘플을 보관하십시오.

7. 신장의 관류 그리고 제거

1. 관류액이 투명해질 때까지 20-4mL/분의 유속으로 20mL 주사기를 사용하여 좌심실을 통해 10-20mL의 PBS를 마우스에 관류합니다.
2. 신장 동맥과 정맥을 집게로 유두에 가깝게 잡고 신장에서 멀리 떨어진 쪽의 혈관을 잘라 신장을 제거합니다.
3. 신장 캡슐을 손으로 떼어내거나 미세하고 멸균된 집게로 조심스럽게 제거합니다.
4. 항체에 따라 고정 파라핀 포매 조직의 준비를 위한 섹션 8 또는 고정 동결 조직의 준비를 위한 섹션 10으로 진행합니다.
   참고: 염색에 사용할 각 항체에 맞게 조직 처리를 최적화해야 합니다.

8. TGF-β와 PDGF-D 염색을 위한 파라핀 끼워넣어진 조직

1. 깨끗한 유리 슬라이드에 신장을 놓고 새 면도날로 수평으로 잘라 신장을 이등분합니다. PBS의 4% 파라포름알데히드(PFA) 10mL에 반쪽을 10rpm의 속도로 엔드-투-엔드 로테이터에서 24시간 동안 놓습니다.
   참고: 절편을 위해 신장 전체가 필요한 것은 아닙니다. 신장의 절반은 보관하거나 다른 분석에 사용할 수 있습니다.
2. PFA를 70% 에탄올로 교체하십시오.
3. 이 단계에서 처리 및 파라핀 포매를 위해 신장 반쪽을 제출한 다음 마이크로톰을 사용하여 파라핀 포매 신장 조직을 4-6μm로 절편하고 미리 세척되고 충전된 슬라이드에 장착합니다^17,18.
   참고: 신장은 Vanderbilt University Medical Center Translational Pathology Shared Resource에 의해 처리되어 파라핀에 삽입되어 실온에서 보관되었습니다.

9. 탈파라핀화와 재수화(reparaffinization)

1. 슬라이드를 슬라이드 염색 랙에 넣고 D-리모넨이 들어있는 염색 웰에 5분 동안 담그어 조직이 완전히 잠기도록 합니다. 신선한 D-리모넨이 들어있는 우물에서 반복합니다.
2. 에탄올 100%(2x), 95%, 90%, 70%를 각각 5분 동안 연속적으로 희석하여 슬라이드를 떨어뜨려 조직을 재수화합니다.
3. 흐르는 dH_2O에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다.
4. 구연산염 완충액(pH 6.0)의 절편을 121°C 및 15psi의 압력솥에서 45분 동안 배양하여 항원 회수를 수행합니다.
5. 흐르는 dH₂O에서 20분 동안 슬라이드를 세척합니다.
6. 섹션 12로 진행합니다.

10. CTGF 염색을 위한 동결 조직의 준비

1. 새 면도날을 사용하여 수평축을 따라 신장을 이등분합니다.
   참고: 절편을 위해 신장 전체가 필요한 것은 아닙니다. 신장의 절반은 보관하거나 다른 분석에 사용할 수 있습니다.
2. 15mL 튜브에 0.5% PFA 10mL에 신장 반쪽을 넣고 4°C에서 10rpm의 속도로 2시간 동안 회전자에 넣습니다.
3. 적절한 폐기를 위해 PFA를 용기에 넣고 PBS에 0.1M 글리신 10mL를 4°C에서 10rpm의 속도로 1시간 동안 첨가합니다.
4. 글리신을 디캔팅하고 PBS에 용해된 15% 자당 10mL를 첨가한 다음 튜브를 4°C 및 10rpm으로 밤새 회전기에 놓습니다.
5. 15% 자당을 디캔팅하고 4°C 및 10rpm에서 1시간 동안 PBS에 용해된 30% 자당 10mL로 교체합니다.
6. 임베딩 몰드에 최적 절단 온도 화합물(OCT)을 채우고 신장의 절단면이 아래를 향하도록 10.5단계의 신장 절반을 매립합니다.
7. 반 신장과 OCT가 들어있는 곰팡이를 액체 질소 풀에 조심스럽게 넣어 얼립니다.
   알림: 액체 질소가 OCT에 직접 닿지 않도록 하면 기포가 형성될 수 있습니다. 액체 질소를 사용할 때는 고글/안면 보호대, 극저온 장갑, 실험복과 같은 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 곰팡이를 액체 질소에 넣기 위해 긴 ~25cm의 집게를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
8. 일단 단단하게 얼면 금형을 -80 °C에서 보관하십시오.

11. 동결 단면

1. 저온 유지 장치가 -20 °C에 있는지 확인하십시오.
2. OCT의 시료가 포함된 주형을 -20°C의 저온 유지 장치에 2시간 동안 보관하여 온도를 평형화합니다.
3. 탭을 잡고 바닥에서 눌러 금형을 제거합니다.
4. 새 OCT를 표본 홀더에 놓고 조직 면이 표본 홀더에서 반대쪽을 향하도록 하여 동결된 표본 블록을 위에 놓습니다.
5. 표본 홀더와 표본을 냉동 선반에 놓습니다.
6. 블록 위에 가중 추출기를 놓아 표면을 평평하게 만듭니다. 온도 변화를 방지하기 위해 사용하지 않을 때는 저온 유지 장치 덮개를 닫아 두십시오.
7. 시편 블록과 시편 홀더 사이의 새 OCT가 얼면 연결이 안전한지 확인하십시오.
8. 표본 홀더를 저온 유지 장치 마이크로톰 헤드에 고정합니다.
9. 표본 블록에서 조직이 보일 때까지 절편을 시작합니다.
10. 신장 조직을 4-6μm로 절단하고 실온이 충전된 슬라이드¹⁹로 절편을 집어 올립니다.
11. 조직을 집어 올리면 염색 준비가 될 때까지 슬라이드를 -20 °C에서 -80 °C로 보관하십시오. 염색을 시작할 준비가 될 때까지 해동하지 마십시오.
12. 염색하기 전에 보관에서 슬라이드를 제거하고 실온으로 데우십시오. 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.
13. 실온에 도착한 후 즉시 PBS로 단면을 5분 동안 세척하고 실온에서 두 번 세척하여 OCT 화합물을 제거합니다.
14. 섹션 12로 진행합니다.

12. 면역형광 염색

1. 소수성 장벽 마커 펜으로 조직 단면의 윤곽을 그립니다. 조직에서 소수성 장벽 윤곽선까지 최소 5mm 거리를 유지하십시오.
2. 섹션 위에 1% 소 혈청 알부민/Tris-buffered Saline(TBS)에 3% 당나귀 혈청과 0.1% Triton을 함유한 50μL의 차단 완충액을 추가하고 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
3. 1차 항체를 적절한 농도의 PBS로 희석합니다. 사이토카인 검출을 위해 TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) 및 CTGF (1:200)에 대한 1차 항체 용액 50 μL를 사용하십시오. 근섬유아세포를 라벨링하려면 1:200에서 Cy3와 접합된 알파-평활근 액틴(α-SMA)에 대한 1차 항체 용액 50μL를 사용합니다.
4. 차단 용액을 제거하고 단면에 1차 항체를 추가하여 원형 소수성 윤곽선에서 누출되지 않도록 하고 가습 챔버에서 4°C에서 밤새 배양합니다. 누출이 발생하면 소수성 장벽을 다시 적용하십시오.
5. PBS로 3분 동안 5번 세탁합니다.
6. PBS로 적절한 2차 항체를 1:200으로 희석합니다.
7. 50 μL의 2차 항체 용액으로 샘플을 가습된 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
8. PBS로 5분 동안 세척합니다.
9. 10μg/mL의 농도로 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 와 함께 PBS에서 플루오레세인과 결합된 묽은 연꽃 테트라고놀로버스 렉틴(LTL)을 희석합니다.
   참고: Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 는 LTL 결합에 필요합니다.
10. 50μL의 LTL 용액으로 조직을 가습된 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
11. Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 가 함유된 PBS로 5분 동안 세척합니다.
12. 50 μL의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 물 내 5 μg/mL)으로 배양하여 실온에서 5분 동안 DNA/핵을 염색합니다.
13. 티슈에 20μL의 퇴색 방지 장착 시약을 추가하고 커버슬립을 천천히 올려 커버슬립을 장착합니다. 이미징하기 전에 퇴색 방지 시약이 응고될 때까지 24시간 동안 기다립니다.
    참고: 렉틴 결합은 시간이 지남에 따라 저하되어 신호 손실이 발생할 수 있습니다. 마운팅 시약을 설정한 직후 렉틴으로 염색된 샘플을 이미지화하는 것이 가장 좋습니다. 신호 손실이 관찰되면 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 를 장착 시약에 추가하여 염색을 보존할 수 있습니다.

13. 이미지 획득

1. 자동화된 XY 스테이지로 도립 현미경( 재료 표 참조)을 켭니다.
2. 20x 목표를 선택합니다.
3. 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조).
4. Live를 클릭하여 라이브 뷰 창을 엽니다.
5. 조직 부분을 찾아 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.
6. Acquire 메뉴를 클릭하고 Scan Large Image를 선택합니다.
7. Scan Large Image(큰 이미지 스캔) 창에서 조이스틱을 사용하여 스테이지를 조직 섹션의 가장 왼쪽 부분으로 이동하여 스캔할 영역을 설정하고 왼쪽 화살표를 클릭합니다. 가장 위, 가장 오른쪽 및 아래쪽 조직 세그먼트에 대해 반복합니다.
8. 획득 메뉴를 클릭합니다.
9. 큰 이미지에 대한 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다.
   1. 다중 채널 이미지를 캡처하는 경우 Lambda 탭을 클릭합니다.
   2. 각 채널을 클릭하고 노출 시간을 이미지의 어떤 부분도 채도가 떨어지지 않고 얼룩이 뚜렷한 수준으로 설정합니다.
      참고: 이러한 설정은 하나의 실험 그룹 내에서 일관되어야 합니다. 샘플 간에 수집 설정을 변경하면 결과가 부정확해질 수 있습니다.
   3. 수집할 각 채널에 대해 9.2단계를 반복합니다.
10. 스캔을 클릭합니다.

14. 이미지 분석

1. 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다.
2. File(파일) | 이미지를 열고 선택합니다.
3. 이미지 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다각형 관심 영역(ROI)을 선택합니다.
4. 자유형 도구를 사용하여 ROI를 간략하게 설명합니다. LTL 양성 세뇨관 세포 또는 α-SMA 양성 간질 세포의 윤곽을 설명합니다.
5. Measurement(측정) 탭을 클릭합니다. 임계값.
6. 슬라이더를 양의 신호 영역의 양쪽으로 조정하여 임계값의 상한과 하한을 설정합니다.
7. ROI 탭을 클릭합니다.
8. Export 아이콘을 클릭하여 값을 저장합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 양의 신호 영역/ROI 영역의 백분율을 계산합니다.

15. 대안: 무료 소프트웨어(ImageJ)를 사용한 이미지 분석

1. ImageJ를 엽니다.
2. File(파일) | 이미지를 보려면 엽니다.
3. 자유형 선택을 클릭합니다.
4. 자유형 도구로 윤곽을 그려 ROI를 선택합니다. LTL 양성 세뇨관 세포 또는 α-SMA 양성 간질 세포의 윤곽을 설명합니다.
5. 편집 메뉴를 클릭하고 외부 지우기를 선택합니다.
6. 분석을 클릭하고 측정을 선택하여 ROI 영역을 결정합니다.
7. 이미지로 이동 | 색상 | 채널 분할.
8. 임계값의 상한과 하한을 조정하여 양의 신호 영역을 검출합니다.
9. 분석을 클릭하고 측정을 선택합니다.
10. 데이터를 저장합니다.
11. 스프레드시트 소프트웨어로 데이터를 열고 양의 신호 영역/ROI 영역의 비율을 계산합니다.

16. 선택: 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 가진 화상 진찰

참고: 출판물을 위한 고해상도 이미지를 얻기 위해 컨포칼 현미경 스캔은 신장 조직의 더 선명한 이미지와 감소된 배경을 제공합니다.

1. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 켭니다( 재료 표 참조).
2. 40x 대물렌즈를 선택합니다( 재료 표 참조).
3. 찾기 탭을 클릭하고 초점을 조정하여 조직을 찾습니다.
4. Acquisition 탭으로 이동하여 Channels를 클릭하고 핀홀 설정에서 1AU를 선택합니다.
5. 각 채널에서 레이저 게인 강도를 조정하여 양의 신호가 보이지만 포화되지 않도록 합니다. 실험 샘플 세트 내의 설정이 일정하게 유지되는지 확인합니다.
6. 스냅을 클릭하고 원하는 형식으로 이미지를 저장합니다.

17. 플라즈마 롤빵 수준

1. -20 °C에서 샘플을 제거하고 얼음에서 해동합니다.
2. 플라즈마를 dH₂O로 1:10 비율로 희석합니다.
3. 각 샘플에 대해 96웰 플레이트에 3개의 개별 반응을 복제하여 설정합니다.
   1. Sample Plus 표준물질의 경우 5μL의 200mg/dL 요소와 20μL의 희석된 플라즈마를 추가합니다.
   2. 샘플의 경우, 5 μL의 dH₂O와 20 μL의 희석된 플라즈마를 첨가합니다.
   3. 샘플 블랭크의 경우 5μL의 dH₂O와 20μL의 희석된 플라즈마를 추가합니다.
4. 샘플당 85μL의 시약 + 1μL의 우레아제를 혼합하여 작업 용액을 준비합니다.
5. 80 μL의 작업 용액을 'sample plus standard' 및 'sample alone' 웰에 추가합니다.
6. 80 μL의 시약(우레아제 없음)을 위의 17.3 단계에서 'sample blank' 웰에 추가합니다.
7. 플레이트를 가볍게 두드려 섞고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
8. 플레이트 리더로 OD₅₆₀ 을 판독합니다.
9. 요소 농도 Eq (1)를 계산하고 Eq (2)를 사용하여 BUN으로 변환합니다.
   요소(mg/dL) = (시료 단독-시료 블랭크)/(표준-시료 단독) x (표준/4) x (희석 계수) (1)
   BUN (mg/dL) = 요소 농도/2.14 (2)
   참고: 이 분석법은 혈청의 요소(분자량: 60) 함량을 측정합니다. 그러나 BUN은 요소의 질소 함량(분자량: 28)만 참조합니다. 따라서 요소 농도를 BUN으로 변환하려면 2.14(60/28)의 보정이 필요합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

시스플라틴 유도 AKI에 따른 사이토카인 생산에서 세뇨관 상피 세포의 역할을 조사하기 위해 시스플라틴 농도 20mg/kg으로 시스플라틴을 주입한 후 시스플라틴 주입 후 3일째에 BFA 0.25mg을 정맥 주사했습니다. 신장은 6시간 후에 적출하였다. 파라핀이 삽입된 신장을 절편하여 AKI의 조직 복구를 담당하는 대표적인 사이토카인인 TGF-β, PDGF-D 및 CTGF로 염색했습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

신장 PTC는 TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, 혈관 내피 성장 인자 및 기타 많은 단백질의 분비를 통해 AKI와 CKD를 조절하는 것으로 알려져 있습니다 20,21,22,23. 마찬가지로, 사구체(glomeruli), 원위세뇨관(distal tubules) 및 기타 신장 상피 세포(interstitial cell)는 간질세포(interstitial cell)뿐만 아니라...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin syringes	BD	329654
10 mL Syringe	BD	302995
2 mL tube	Fisher brand	05-408-138
20 mL Syringe	BD	302830
25 G needles	BD	305125
28 G needles	BD	329424
96-well-plate	Corning	9017
Aristolochic acid-I	Sigma-Aldrich	A9461
α-SMA antibody conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	RRID:AB_476856
Blade for cryostat	C.L. Sturkey. Inc	DT315R50
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B6542
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394
Citric acid	Sigma-Aldrich	791725
Confocal microscope	ZEISS	LSM710
Confocal microscopy objectives	ZEISS	40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
Confocal software	ZEISS	ZEN
Coplin jar	Fisher Scientific	19-4
Cover glass	Fisher brand	12545F
Cryostat	Leica	CM1850
CTGF antibody	Genetex	GTX124232	RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable base molds	Fisher brand	22-363-553
donkey serum	Jackson immunoresearch	017-000-121
Ethanol	Decon Labs, Inc.	2701
Forceps	VETUS	ESD-13
Glycine	Fisher brand	12007-0050
Heating pads	Kent scientific	DCT-20
Heparin sodium salt	ACROS organics	41121-0010	100mg/15ml of dH2O
Humidified chamber	Invitrogen	44040410	A plastic box covered in foil can be used as an alternative humidified chamber.
Insulin syringes	BD	329461
Inverted microscope	NIKON	Eclipse Ti-E2	immunofluorescence
KIM-1 antibody	R & D	AF1817	RRID: AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)	National diagnostics	HS-200
lotus tetragonolobus lectin	Vector	FL-13212
Microscope slide	Fisher scientific	12-550-343
Microtome	Reichert	Jung 820 II
monochrome CMOS camera	NIKON	DS-Qi-2
Mouse surgical kit	Kent scientific	INSMOUSEKIT
NIS Elements	NIKON
Objectives	NIKON	Plan Apo 20x/0.75	image acquisition software linked to Eclipse Ti-E2 (invertd microscope)
OCT compound	Scigen	4586
Pap pen	Vector	H-4000
PBS with calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
PBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
PDGF-D antibody	Thermo-Fisher scientific	40-2100
PFA	Electron Microscopy Science	15710	RRID: AB_2533455
Plate reader	Promega	GloMax® Discover Microplate Reader	4% PFA is diluted from 16% in PBS.
povidone-iodine (Betadine)	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
Pressure cooker	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930
Quantichrom Urea (BUN) assay Kit II	BioAssay Systems	DUR2-100
Single-edge razor blade for kidney dissection (.009", 0.23 mm)	IDL tools	521013
Slide warmer	Lab Scientific Inc.,	XH-2001
Software	NIKON	NIS elements
Sucrose	RPI	S24060
TGF-b1 anitbody	Sigma-Aldrich	SAB4502954
Tris EDTA buffer	Corning	46-009-CM	RRID: AB_10747473
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
White Glass Charged Microscope Slide, 25 x 75 mm Size, Ground Edges, Blue Frosted	Globe Scientific	1358D