생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

요약

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

초록

기도 조직에 대한 반복적 인 손상은 폐 기능을 손상시키고 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 만성 폐 질환을 일으킬 수 있습니다. 재생 의학 및 생물 반응기 기술의 발전은 약물을 스크리닝하고, 질병을 모델링하고, 조직 교체를 엔지니어링하는 데 사용할 수있는 실험실 성장 기능 조직 및 장기 구조물을 생산할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에서, 시험관내 조직 조작 및 배양 동안 외식화된 래트 기관지의 내강을 계내에서 시각화할 수 있게 하는 이미징 양식과 결합된 소형화된 생물반응기가 설명된다. 이 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직 매트릭스의 본질적인 생화학적 특징과 울트라구조를 보존하면서 내인성 세포 성분의 영상화 유도 선택적 제거를 입증한다. 더욱이, 계내에서 광학 모니터링을 갖는 탈세포화된 기도 루멘 상의 외인성 세포의 전달, 균일한 분포, 및 후속적인 연장된 배양이 도시된다. 이 결과는 영상-유도된 생물반응기가 잠재적으로 기능적인 시험관내 기도 조직의 생성을 용이하게 하는데 사용될 수 있다는 것을 강조한다.

서문

호흡기의 발광 표면은 주로 다중 섬모, 클럽, 잔 및 기저 줄기 세포 ^1,2로 구성된 상피 층으로 줄 지어 있습니다. 상피층은 폐의 주요 방어 메커니즘 역할을하며, 흡입 된 병원균, 미립자 또는 화학 가스로부터 기저기도 조직을 보호하는 생물 물리학 적 장벽 역할을합니다. 그것은 세포 간 단단한 접합 형성, 점액 균 클리어런스, 항균 및 항산화 분비 ^3,4를 포함한 여러 메커니즘을 통해기도 조직을 보호합니다. 결함이있는기도 상피는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)⁵, 원발성 섬모 운동 장애 (PCD)⁶ 및 낭포성 섬유증 (CF)⁷과 같은 치명적인 호흡기 질환과 관련이 있습니다.

폐 온 칩 (LOC) 기술의 발전은 인간의 폐 발달을 연구하고, 다양한 폐 질환을 모델링하고, 엄격하게 조절되는 체외 환경에서 새로운 치료 물질을 개발할 수있는 기회를 나타냅니다. 예를 들어, 기도 상피 및 내피는 폐 조직을 교환하는 가스를 모방하기 위해 얇고 다공성 멤브레인의 반대편에서 배양될 수 있어, 충실한 질병 모델링 및 약물 테스트⁽⁸)를 가능하게 한다. 유사하게, 시험관내 질환 모델은 COPD⁹ 및 낭포성 섬유증¹⁰과 같은 시험관내 기도 질환을 모델링하기 위해 생성되었다. 그러나, LOC 디바이스의 주요 과제는 시험관내(¹¹)에서 폐 조직 및 동적 세포-조직 매트릭스 상호작용의 복잡한 3차원(3D) 아키텍처를 재반복하는 것이다.

최근에, 생체외 폐 조직(¹²)의 조작을 허용하는 혁신적인 조직 공학 방법론이 개발되었다. 이들 방법론을 사용하여, 탈착된 동종성 또는 이종 조직 이식편은 화학적, 물리적, 기계적 치료⁽¹³)를 통해 폐 조직으로부터 내인성 세포를 제거함으로써 제조될 수 있다. 또한, 탈세포화된 폐 스캐폴드 내의 보존된 천연 조직 세포외 매트릭스(ECM)는 이식된 세포가 부착, 증식 및 분화하기 위한 물리-모방 구조적, 생화학적, 및 생체역학적 단서^{를 제공한다(14,15}).

여기서, 시험 관내 조직 조작 및 삼출된 쥐 기관 조직의 배양을 허용하기 위해 LOC와 조직 공학 기술을 결합하여 만들어진 영상-유도 생물반응기 시스템이 보고된다. 이 기도 조직 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직의 근본적인 상피하 세포 및 생화학적 성분을 파괴하지 않으면서 내인성 상피 세포의 선택적 제거를 입증한다. 다음으로 우리는 새로 시딩된 외인성 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포 (MSCs)의 균질한 분포 및 순간적인 침착을 보여주고, 세포가 로딩된 콜라겐 I 프리겔 용액을 주입함으로써 뾰족한 기도 루멘 상에 나타낸다. 또한, 생물반응기에 집적된 미세광학 이미징 장치를 이용함으로써, 상피 제거 및 내인성 세포 전달 동안 기관 내강의 시각화도 행해진다. 또한, 기관 및 새로 이식된 세포는 눈에 띄는 세포 사멸 및 조직 분해 없이 4일 동안 생물반응기에서 배양될 수 있음을 보여준다. 우리는 영상 지원 생물반응기 플랫폼, 박막 기반 탈상피화 기술, 및 본 연구에 사용된 세포 전달 방법이 시험관내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 기도 조직 생성에 유용할 수 있다고 구상한다.

생물반응기는 프로그램가능한 시린지 펌프, 관류 펌프, 및 분리된 래트 기관을 배양하기 위한 인공호흡기에 연결된 직사각형 챔버를 포함한다. 생물반응기는 기관 또는 조직 배양 챔버에 연결된 입구 및 출구를 특징으로 하여 기관지의 내부 및 외부 공간에 시약(예를 들어, 배양 배지)을 별도로 공급합니다(그림 1). 맞춤형 이미징 시스템을 사용하여 시험 관 내에서 배양된 쥐의 내부를 세포 수준에서 시각화할 수 있습니다(그림 2). 기관지의 내인성 상피는 세제 기반 탈세포화 용액의 점적과 진동 보조 기도 세척을 통해 제거됩니다 (그림 3). 타입 I 콜라겐과 같은 하이드로겔 용액은 외인성 세포를 뾰족한 기관 루멘을 가로질러 균일하고 순간적으로 시딩하기 위한 전달 비히클로서 사용된다(도 4). 생물반응기를 구성하고 실험을 수행하는 데 사용되는 모든 물질은 물질 표에 제공됩니다.

프로토콜

아래의 동물 조직 프로토콜은 스티븐스 공과 대학 (Stevens Institute of Technology)의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 동물 복지 지침 및 규정에 의해 승인되었으며 실험 동물 사용에 대한 NIH (National Institutes of Health) 지침을 준수합니다.

1. 영상 유도 쥐 기관지 생물반응기의 설계 및 시공

1. 쥐 기관 생물반응기의 설계 및 제작
   1. CAD 생성기 소프트웨어를 사용하여 입구, 출구 및 조직 배양 챔버와 같은 관련 설계로 생물반응기 챔버의 CAD(컴퓨터 지원 설계) 모델을 만듭니다. 이 연구에서는 그림 1A-C에 제시된 형상과 치수를 사용합니다. CAD 생성기 소프트웨어의 튜토리얼은^16,17에서 찾을 수 있습니다.
   2. 생성 된 CAD 모델을 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 컨트롤러 소프트웨어로 내보내고 CNC 기계를 사용하여 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 플라스틱을 절단하여 생물 반응기 챔버를 만듭니다. CNC 컨트롤러 소프트웨어의 튜토리얼은¹⁸에서 찾을 수 있습니다.
      참고: PTFE 외에도 초고분자량 폴리에틸렌(UHMWPE) 및 폴리에테르이미드와 같은 다른 플라스틱 재료를 사용하여 배양 챔버를 제작할 수 있습니다.
   3. Luer 어댑터 및 나사와 같은 모든 생물반응기 구성 요소를 멸균하여 장치에서 배양된 조직 및 세포의 오염을 방지합니다. 모든 생물반응기 성분을 깨끗한 환경에서 주 조직 배양 챔버에 조립한다(도 1A).
2. 그라디언트 인덱스(GRIN) 렌즈 기반 영상화 장치 구축
   1. in situ 이미징 장치를 만들려면 튜브 렌즈를 적층 가능한 렌즈 튜브에 삽입하고 고정 링을 사용하여 고정하십시오. 렌즈 튜브 어셈블리를 C-마운트 어댑터를 통해 과학적인 CMOS 카메라에 장착합니다.
   2. Micro-Manager와 같은 소프트웨어를 사용하여 카메라를 작동하고 사진 및 비디오를 획득하십시오. 장거리(예를 들어, 카메라로부터 10m)에 위치한 물체를 조준하고, 사용되는 이미징 소프트웨어에 의해 피사체의 초점이 맞춰진 이미지가 컴퓨터 스크린 상에 형성될 때까지 카메라의 튜브 렌즈와 이미징 센서 사이의 거리를 조정한다.
   3. 이중 에지 초분해능 이색성 거울에 필터 렌즈를 장착하고 조립 로드, 나사 케이지 플레이트 및 케이지 큐브를 포함한 광학 케이지 시스템 구성 요소를 사용하여 장치에 레이저를 장착합니다.
   4. 대물 렌즈(20x)를 장치에 연결합니다. XY 변환기를 통해 렌즈 튜브의 원위 끝에 GRIN 렌즈(직경 = 500μm)를 장착합니다. GRIN 렌즈와 대물 렌즈 사이의 거리를 조정하여 초점을 맞춘 현미경 이미지를 형성합니다(그림 2A,B).

2. 쥐 기관의 분리

1. 수술 부위를 소독하고 수술 전에 121°C에서 30분 동안 오토클레이브를 이용하여 수술 기구를 멸균한다.
2. 래트를 유도 챔버에 놓고 작은 기화기를 사용하여 15분 동안 이소플루란의 2.5%를 전달하여 동물을 마취시킨다. 페달 반사에 의해 마취 깊이를 평가하십시오. 이렇게하려면 발가락을 단단히 꼬집고 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하십시오.
3. 마취 후 챔버에서 이소플루란을 제거하고 측방 꼬리 정맥을 통해 1,000 unit/mL 헤파린 1 mL를 투여하여 폐 혈관 구조에서 혈액 응고를 방지합니다.
4. 동물을 안락사시키기 위해, 동물을 추가로 15-20분 동안 5% 이소플루란에 노출시킨다. 유도 챔버에서 동물을 제거하고 페이스 업 수핀 위치의 수술 보드에 놓습니다.
5. 접착 테이프를 사용하여 다리와 꼬리를 고정시켜 수술 보드에 쥐를 고정시킵니다. 다음으로, 70 % 이소프로필 알코올 (IPA)을 사용하여 쥐의 목과 가슴 부위를 멸균하십시오. 피부에 가위를 사용하여 3-4cm 절개를하여 복강을 엽니 다.
   참고: 가위 끝을 위쪽으로 향하게 하여 피부를 깊게 자르지 않도록 주의하십시오.
6. 가위를 사용하여 열등한 정맥 카바 (IVC)를 횡단하고 exsanguination에 의해 안락사를 확인합니다.
7. 목의 중간 선에있는 가위를 사용하여 절개를하고 기관을 노출시켜 기관 절제술을 수행하십시오. 흉벽에 절개를하고 갈비뼈 사이를 절단하여 폐에 연결된 기관 끝에 도달하여 중간 선 흉부 절제술을 수행하십시오. 다음으로, 이두박근과 가위를 사용하여 기관의 양쪽 끝을 자르고 기관을 분리하십시오.
8. 단리 후, 20 mL의 1x 포스페이트 완충 식염수 (1x PBS)를 사용하여 기관을 헹구었다. 멸균된 이두박근을 사용하여 기관을 생물반응기로 옮깁니다. 기관지의 두 끝을 4-0 봉합사 나사를 사용하여 Luer 커넥터에 고정하십시오.
9. 5mL/min의 유속으로 생물반응기 챔버에 연결된 튜브를 통해 프로그래밍 가능한 시린지 펌프를 사용하여 5mL의 배양액을 생물반응기 챔버로 전달합니다.
   참고: 배양 배지는 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM), 재조합 인간 FGF-염기성 (0.1 ng/mL), 태아 소 혈청 (FBS, 10%), 및 항생제-항균제 (1%)로 구성된다.
10. 아크릴 플라스틱 뚜껑과 나사로 생물반응기 뚜껑을 단단히 닫습니다. 튜브 내의 배양 배지의 흐름을 방지하기 위해 남성/여성 Luer 플러그와 생물반응기 챔버 튜빙 연결을 닫습니다.

3. 기관 상피의 이미징 유도 제거

1. 기관 내강을 밝은 필드 또는 형광으로 시각화하려면 생물반응기를 이미징 스테이지에 놓습니다(그림 3A).
2. CFSE 용액을 1x PBS로 희석하여 CFSE 세포 표지 키트에 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 용액 (농도: 100 μM)을 제조하였다.
   참고: 원래 CFSE 용액의 농도는 10 mM입니다(디메틸설폭사이드(DMSO)에서).
3. 5 mL/min의 유속으로 기관 캐뉼라에 연결된 튜빙을 통해 시린지 펌프를 통해 기관지를 통해 CFSE 용액 500 μL를 주입하십시오. CFSE 용액이 기관을 채울 때 펌프를 중지하십시오. 10분 동안 기다린 다음, 시린지 펌프를 사용하여 1x PBS 중 10 mL를 주입하여 기관 루멘을 세척한 후 잔류 비혼입 CFSE 시약을 제거하였다.
4. GRIN 렌즈의 원위 이미징 단부를 기관의 한쪽 끝에 부착된 Luer 커넥터를 통해 기관지에 삽입합니다. 그런 다음 기관 표면이 집중 될 때까지 기관 내부의 GRIN 렌즈를 부드럽게 움직이고 20x 배율로 밝은 필드 또는 형광으로 사진과 비디오를 촬영하십시오.
5. Micro-Manager 소프트웨어에서 밝은 필드 이미지를 캡처하려면 아래 단계를 따르십시오.
   1. 케이지 큐브를 통해 백색광을 도입하여 기관 내강을 비추십시오. 라이브 아이콘을 클릭하면 기관의 발광 표면이 실시간으로 표시됩니다. 이미징 설정 > 노출(ms) 을 사용하여 노출 시간을 원하는 값으로 변경합니다. 본 연구에서, 사용된 노출 시간은 10 ms 및 50 ms의 범위였다.
   2. 이미지의 대비와 밝기를 조정하려면 히스토그램 및 강도 배율 창을 사용하여 대화형 히스토그램 디스플레이의 끝점에서 흑백 화살표를 이동합니다. 또는 소프트웨어가 밝기와 대비를 자동으로 최적의 수준으로 조정할 수있는 자동 스트레치 옵션을 사용하십시오.
   3. 스냅 아이콘을 클릭하여 이미지를 고정시킵니다. 그런 다음 설정 > 이미지 변위로 내보내기를 사용하여 이미지를 원하는 형식으로 저장합니다. 또는 ImageJ > 설정을 사용하여 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 직접 내보내고 저장합니다.
6. 형광 모드에서 사진 및 비디오를 얻으려면 케이지 큐브를 통해 CFSE 특정 레이저 광 (CFSE : 여기 파장 : 488nm, 방출 파장 : 515nm)으로 기관 루멘을 비추십시오. 3.5.2-3.5.3단계에 따라 이미지를 가져옵니다. 사진과 비디오를 찍은 후 기관지에서 GRIN 렌즈를 부드럽게 제거하십시오.
7. 하기와 같이 탈상피화를 수행한다.
   1. 증류수(DI) 물에 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 탈세포 화 용액을 준비한다. 기관 캐뉼라를 통한 주사기 펌프를 사용하여 기관 내강에 세제 용액의 박막을 생성함으로써 6.3 mL/min의 유속으로 기관을 통해 50 μL의 SDS를 주입하십시오.
   2. 남성 / 여성 Luer 플러그를 사용하여 생물 반응기의 튜브 연결을 닫고 생물 반응기를 인큐베이터로 옮깁니다. SDS가 37°C에서 10분 동안 기관 내에 거주하도록 허용한다. 또 다른 50 μL의 SDS 용액을 기관지를 통해 주입하고 10분 동안 인큐베이션한다.
   3. 3x 동안 10 mL/min의 유속으로 주사기 펌프를 통해 500 μL의 1x PBS로 기관 루멘을 관개하여 용해된 상피 및 SDS를 제거한다. 생물반응기를 진탕기 위에 놓고 약 0.3 mm의 20 Hz 주파수와 변위 진폭에서 생물반응기를 기계적으로 진동시켜 기관 내강으로부터 SDS 처리된 상피 세포의 분리를 물리적으로 촉진한다.
      참고: 이 연구에서 셰이커는 서브우퍼 스피커, 서브우퍼 플레이트 앰프 및 가속도계를 조립하여 맞춤 제작되었습니다. 정현파 파형은 컴퓨터에 의해 생성되어 증폭기를 통해 셰이커에 공급 되었으며, 셰이커의 응답은 가속도계를 통해 모니터링되었습니다(그림 3B). 또한, 전자기 및 관성 쉐이커와 같은 통상적인 쉐이커는 세포의 분리를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 하려면 셰이커의 주파수와 가속도를 각각 20Hz 및 0.5g(변위 진폭 0.3mm에 해당)으로 설정합니다.
   4. 기관 루멘을 통해 500 μL의 1x PBS를 두 번 주입하여 기관지가 기계적으로 진동하는 동안 잔류 SDS 및 세포 파편을 제거한다. 상피 제거 절차에 따라, 단계 3.6에서와 같이 GRIN 렌즈 이미징 장치를 사용하여 CFSE의 강도를 측정하여 상피층의 클리어런스를 평가한다(도 3C).

4. 추가 분석을위한 기관지 조직 준비

1. 상피 제거를 확인하려면 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, 삼색, 펜타크롬 및 면역염색과 같은 추가 조직 분석을 수행합니다. 이렇게 하기 위해, 생물반응기로부터 기관을 제거하고, 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(pH = 7.4) 중의 4% 중성 완충 파라포름알데히드 용액 30 mL에 고정시켰다.
2. 탈수 및 아래 단계에 따라 고정된 기관 조직을 내장한다.
   1. 고정 후, 기관 조직을 10 mL의 1x PBS로 세척하고, 기관지를 30 mL의 70% 알코올로 옮기고, 밤새 4°C에서 유지한다. 날카로운 칼날을 사용하여 기관지를 작은 원통형 절편 (~ 5mm)으로 자르고 카세트를 내장 한 조직에 조직 섹션을 삽입하십시오 (길이 x 너비 x 높이 : 4cm x 2.5cm x 0.5cm). 각 카세트에 두 개의 기관 섹션을 보관하십시오.
   2. 일련의 이소프로필 알코올 (IPA) 용액 (85 %, 90 %, 95 %, 100 % )에서 절편을 각 용액의 30 mL에서 1 시간 동안 탈수하십시오. 다음 솔루션을 추가하기 전에 이전 솔루션을 제거하십시오.
   3. 완료시, 카세트를 30 mL의 클리어링제 (예를 들어, 자일렌)에 2 시간 동안 침지시켜 IPA 용액을 조직 절편으로부터 완전히 대체시킨다. 적절한 환기가 가능한 흄 후드에서이 단계를 수행하십시오.
   4. 카세트를 파라핀에 2시간 동안 침지시키고, 이어서 이들을 4°C에서 하룻밤 동안 파라핀에 임베드시킨다. 다음으로, 파라핀 포매된 조직을 H&E, 삼색, 펜타크롬 및 면역염색을 위한 마이크로톰 장치를 사용하여 얇은 절편(5-8 μm)으로 절단한다.
3. 주사전자현미경(SEM) 분석을 위한 조직을 제조하기 위해, 4°C에서 하룻밤 동안 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(pH=7.4) 중의 2.5% 글루타르알데히드 용액 30 mL에 기관을 고정시켰다. 그 후, 아래의 단계에 따라 SEM에 대해 고정된 기관 조직을 탈수시킨다.
   1. 고정 후, 기관 조직을 10 mL의 1x PBS로 헹구십시오. 가위를 사용하여 기관 조직을 세로 방향으로 작은 반 실린더 섹션 (길이 : ~ 5mm)으로 자르고 조직 섹션을 카세트에 삽입하십시오.
   2. 일련의 IPA 용액 (35 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % 및 100 %)에서 절편을 각 용액의 30 mL에서 10 분 동안 탈수시킵니다. 다음 솔루션을 추가하기 전에 이전 솔루션을 제거하십시오.
   3. 조직을 다음 용액에 침수하여 헥사메틸디실라잔(HMDS) 기반 건조 방법을 수행합니다: 100% IPA: HMDS(2:1; v/v)를 10분 동안 유지한 후 10분 동안 100% IPA: HMDS(1:2; v/v)를 10분 동안 그리고 마지막으로 100% HMDS로 하룻밤 동안 HMDS를 가합니다.
      참고: HMDS는 독성이 있습니다. 모든 건조 단계에서 흄 후드 아래에서 작업하십시오.
   4. HMDS 용액에서 조직을 제거하고 흄 후드 아래에서 1 시간 동안 건조시킵니다. SEM 이미징을 위해 카본 양면 전도성 테이프 또는 실버 전도성 페이스트를 사용하여 알루미늄 핀 스터브에 섹션을 장착합니다.

5. 외인성 세포를 뾰족한 기관 내강으로의 균질한 분포

1. 단계 3에서 프로토콜을 사용하여 탈상피화된 기관지 래트를 제조한다. 냉동 중간엽 줄기 세포 (MSCs)를 37°C 수조에서 30 s 동안 해동시킨다.
   참고 :이 연구에서, 우리는 모델 세포로 중간엽 줄기 세포 (MSCs)를 사용하여 탈상피화 된 기관 상으로의 외인성 세포의 분포를 보여주었습니다. 이상적으로는, 일차 기도 상피 세포, 기저 세포, 또는 유도-인간 다능성 세포 (iPSCs)가 상피 재생 목적을 위해 사용될 수 있다.
2. 혈구세포계로 세포를 계수하고 5 x 10⁶ cells/mL의 농도로 세포 용액을 준비하십시오. 세포를 실온에서 15분 동안 2 mL의 CFSE 용액 (농도: 100 μM)으로 인큐베이션함으로써 세포를 형광으로 표지한다. 세포를 3x 동안 5 mL의 1x PBS로 헹구고 세포를 3 x 10⁷ cells/mL의 최종 농도로 신선한 배지에 재현탁시킨다.
3. 하이드로겔 프리겔 용액을 세포 전달을 위한 비히클로서 준비한다. 이 연구를 위해 콜라겐 I을 MSC 세포의 전달 비히클로 사용하고 제조업체의 지침에 따라 프리 젤을 준비하십시오. 예를 들어, 3.6 mg/mL 콜라겐 프리젤을 얻으려면 냉각된 중화 용액의 한 부분을 1.5 mL 멸균 튜브에서 쥐 꼬리 콜라겐의 아홉 부분과 섞는다. 그런 다음 적절한 혼합을 위해 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫하십시오.
   참고: 연구 및 사용자의 필요에 따라 콜라겐 I 대신 다른 생체적합성 하이드로젤을 사용할 수 있다.
4. 하이드로겔 용액이 제조되면, 세포를 원하는 농도(예를 들어, 5 x 10 6 세포/mL)로 용액^에 신속하게 첨가한다. 균일한 세포-하이드로겔 혼합물을 수득하기 위해, 마이크로피펫으로 부드럽게 피펫팅함으로써 세포 및 겔 용액을 혼합한다.
5. 생물반응기 내의 기관지의 한쪽 끝을 Luer 커넥터를 통해 프로그래밍 가능한 시린지 펌프에 부착하십시오. 37°C에서 5mL의 신선한 배양액을 생물반응기 챔버에 전달하여 5mL/min의 유속으로 시린지 펌프를 사용하여 기관지 외부 표면을 덮습니다.
6. 세포-하이드로겔 혼합물의 10 μL 볼루스를 5 mL/min의 유속으로 시린지 펌프를 사용하여 생물반응기 내의 탈상피화된 기관지에 투여하여 기관 내강에 세포-하이드로겔 층을 생성한다(그림 4).
7. 세포 주입 후, 생물반응기를 겔화를 위해 37°C 및 5%_CO2 의 멸균 세포 배양 인큐베이터에 놓는다. 콜라겐 I의 경우, 겔화는 30분 내에 발생한다.
8. 이식된 세포의 분포를 시각화하려면 70% IPA 또는 에탄올로 닦아 GRIN 렌즈를 멸균하고 이미징 단계에 생물반응기를 놓습니다. 필요에 따라 밝은 필드와 형광 모드에서 사진과 비디오를 촬영하십시오.
9. 세포 시딩 30분 후, 1mL/min의 유속으로 시린지 펌프를 사용하여 기관 루멘에 배양액 1mL를 주입한다.
10. 세포 시딩된 기관 내 생물반응기를 원하는 시간 동안 37°C의 인큐베이터에서 배양한다. 장기 배양을 위해, 24시간마다 기관 루멘 및 생물반응기 챔버에서 배양 배지를 리프레시한다. 세포 배양 중에 루멘 내부의 배지를 정적으로 유지하고 매 24 시간마다 변경하며, 기관 외부의 배지는 5 mL / min에서 단방향 흐름을 통해 지속적으로 관류됩니다.
11. 세포를 특정 기간 동안 (예를 들어, 본 연구에서 1 및 4일) 동안 배양한 후, 생물반응기로부터 기관을 제거하였다. 가위를 사용하여 기관지를 세로 방향으로 두 개의 반 실린더 섹션 (즉, 상부 및 하부 섹션)으로 절단하여 시험관 내 배양의 1 일과 4 일에 세포 성장을 모니터링하고 세포 밀도를 계산하기 위해 내부 표면을 노출시킵니다. 기존의 형광 현미경을 사용하여 내부 표면의 세포를 시각화하십시오.
12. Micro-Manager 소프트웨어를 사용하여 이미지를 가져오려면 3.5단계 및 3.6단계를 수행하십시오. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 필터를 사용하여 형광 모드에서 CFSE 표지된 세포를 시각화합니다. 형광 현미경으로 촬영한 이미지를 분석하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 위쪽 및 아래쪽 섹션의 세포 밀도를 계산합니다. 셀 수와 셀 밀도를 계산하려면 아래 단계를 따르십시오.
    1. ImageJ 소프트웨어에서 이미지를 열고 이미지 > 유형 > 16비트를 사용하여 이미지를 이진 이미지( 16비트)로 변환합니다. [눈금 설정] 분석(Analyze > Set Scale)을 사용하여 배율 표시줄로 이미지 배율을 설정합니다.
    2. 이미지의 임계값을 조정하여 셀 구조를 강조 표시합니다. 이미지를 사용> 여 임계값> 조정합니다. 파티클 분석> 분석을 사용하여 셀 수를 계산합니다. 셀 수를 이미지의 표면적별로 나누어 세포의 밀도를 계산합니다.
13. 세포 시딩 후 생존력을 평가하려면 세포 생존력 키트를 사용하십시오. 이 연구를 위해, 기관 조직 및 세포를 생물반응기에서 6시간 동안 37°C에서 인큐베이션하고, 세포를 실온에서 15분 동안 1x PBS 중 1 mL의 4 mM 칼세인-AM 및 2 mM 에티듐 호모다이머-1로 염색하였다.
14. 1x PBS로 헹구고 난 후, 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화한다. 단계 5.12에 설명된 단계를 사용하여 살아있는 셀과 죽은 세포를 계수합니다. 세포 생존율을 총 세포 (살아있는 세포와 죽은 세포 모두) 당 살아있는 세포 (calcein-AM로 염색)의 백분율로 계산하십시오.

결과

GRIN 렌즈 기반의 현장 이미징 양식은 현장에서 기관 내부 루멘의 시각화를 허용 할 수 있습니다 (그림 5A). 이 이미징 방법을 사용하면 천연 및 탈상피화 기관의 밝은 필드 및 형광 이미지를 모두 얻을 수 있습니다 (그림 5B, C). CFSE 표지 이전에 천연 기관지로부터 형광 신호가 관찰되지 않았다(도 5Bii). 그러...

토론

이 작업에서, 우리는 (i) 세포 제거 및 외인성 세포 전달 후 계내에서 기관 내강의 모니터링과 (ii) 세포 시딩된 기관 조직의 장기 시험관내 배양을 허용할 수 있는 이미징 유도 생물반응기를 만들었습니다. 이 맞춤형 생물반응기를 사용하여, 우리는 (i) 세제 및 진동 보조 기도 세척을 사용하여 기관 내강으로부터 내인성 상피 세포를 선택적으로 제거하고 (ii) 세포가 로딩된 콜라겐 I 프...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10-010-031
3-port connector	World Precision Instruments	14048-20
4-port connector	World Precision Instruments	14047-10
Accelerometer	STMicroelectronics	IIS3DWBTR
Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub	TED PELLA	16111
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062
Assembly rod	Thorlabs	ER1
Button head screws	McMaster-Carr	91255A274
Cage cube	Thorlabs	C4W
Carbon double-sided conductive tape	TED PELLA	16073
CFSE labelling kit	Abcam	ab113853
Citrisolv (clearing agent)	Decon	1061
C-mount adapter	Thorlabs	SM1A9
Collagen I	Advanced BioMatrix	5153
Conductive liquid silver paint	TED PELLA	16034
Dichroic mirror	Semrock	DI03-R488	Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter	Cole-Parmer	EW-45501-30
Female luer to tubing barb	Cole-Parmer	EW-45508-03
Female to male luer connector	Cole-Parmer	ZY-45508-80
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10082147
Filter lens	Chroma Technology Corp	ET535/50m
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse E1000 - D
Fusion 360	Autodesk
Hex nut	McMaster-Carr	91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Fisher Scientifc	AC120585000
Imaging fiber	SELFOC, NSG group	GRIN lens
Laser	Opto Engine	MDL-D-488-150mW
Lens tubes	Thorlabs	SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L3224
MACH 3 CNC Control Software	Newfangled Solutions
Objective lens	Olympus	UCPLFLN20X
Peristaltic Pump	Cole Parmer	L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic	PeproTech	100-18B
Retaining ring	Thorlabs	SM1RR
Scientific CMOS camera	PCO Panda	PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate	VWR	97064-472
Solidworks (2019)	Dassault Systèmes
Stackable lens tube	Thorlabs	SM1L10
Subwoofer plate amplifier	Dayton Audio	SPA250DSP
Subwoofer speaker	Dayton Audio	RSS21OHO-4	Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump	World Precision Instruments	AL-4000
Threaded cage plate	Thorlabs	CP33
Threaded luer adapter	Cole-Parmer	EW-45513-81
Tube lens	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Tygon Tubing	Cole-Parmer	13-200-110
XY Translator	Thorlabs	CXY1