세포 추적기 주입을 사용하여 쥐 saccular 측벽 모델에서 Neointima-Forming Cells의 기원을 조사합니다.

요약

우리는 내피 세포를 추적하기 위해 원 포인트, 친유성 세포 추적기 주사를 수행 한 다음 복부 쥐 대동맥에 동맥 절제술과 측벽 동맥류의 봉합을 수행했습니다. Neointima 형성은 탈세포화 된 동맥류의 부모 동맥에 의존하는 것처럼 보였고 중요한 세포가 풍부한 벽에있는 동맥류 벽 세포로부터의 모집에 의해 촉진되었습니다.

초록

미세 외과 적 클리핑은 두개내 동맥류로의 혈류 장벽을 만드는 반면, 혈관 내 치료는 신생내막과 혈전 형성에 의존합니다. 신생내막의 내막 층을 덮고있는 내피 세포의 근원은 불분명하다. 따라서, 본 연구의 목적은 이미 잘 확립된 헬싱키 래트 미세외과 측벽 동맥류 모델에서 세포-트레이서 주사 후 신생내막 형성 세포의 기원을 조사하는 것이었다.

측벽 동맥류는 수컷 루이스 래트에서 대동맥에 탈세포화 또는 중요한 동맥 파우치를 종단 대우로 봉합하여 생성되었다. 동맥류 봉합사로 동맥 절제술 전에, CM-Dil 염료를 함유하는 세포-트레이서 주사를 인접한 혈관의 내피 세포를 표지하고 후속 조치 (FU) 동안 그들의 증식을 추적하기 위해 클램핑된 대동맥 내로 수행하였다. 치료 후 코일링 (n = 16) 또는 스텐트 (n = 15)가 뒤 따른다. FU (7 일 또는 21 일)에서 모든 래트는 형광 혈관 조영술을 받았고 동맥류 수확 및 특정 관심 영역에 대한 면역 조직 학적 세포 수를 통한 거시적 및 조직학적 평가를 받았다.

31 개의 동맥류 중 어느 것도 후속 조치로 파열되지 않았습니다. 네 마리의 동물이 조기에 사망했습니다. 거시적 잔류 관류는 75.0% 코일링된 래트와 7.0%의 스텐트 래트에서 관찰되었다. 세포-추적자-양성 세포의 양은 7일째의 혈전(p=0.01) 및 21일째의 네오인티마(p=0.04)에 대하여 코일링된 동맥류에 비해 탈세포화된 스텐트에서 유의하게 상승하였다. 중요한 동맥류에서 혈전 또는 신생 내막에서 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다.

이러한 발견은 스텐트 동맥류에 비해 코일에서 더 나쁜 치유 패턴을 확인합니다. Neointima 형성은 탈세포화 된 동맥류의 부모 동맥에 특히 의존하는 것처럼 보이지만, 중요한 세포가 풍부한 벽에있는 동맥류 벽 세포로부터의 모집에 의해 뒷받침됩니다. 번역 측면에서 스텐트 치료는 고도로 퇴화 된 동맥류에 더 적합 할 수 있지만 코일 만으로는 대부분 건강한 혈관벽을 가진 동맥류에 적합 할 수 있습니다.

서문

두개내 동맥류(IA)의 파열로 인한 Subarachnoid 출혈은 높은 이환률 및 사망률 1,2,3,4와 관련된 파괴적인 신경외과적 상태이다. 내피와 내피 간의 직접적인 접촉을 제공하는 미세 외과 적 클리핑 외에도 혈관 내 장치는 파열되고 우연히 발견 된 IA를 치료하기 위해 지난 수십 년 동안 중요성이 커지고 있습니다. 혈관 내 치료 IAs의 치유 반응은 주로 신생내막 형성 및 혈전 조직에 달려 있습니다. 둘 다 인접한 혈관과 동맥류 벽으로부터의 세포 이동에 따라 시너지 효과가있는 과정입니다. ⁵ 현재까지 혈관 내 처리된 동맥류의 신생내막 형성에서 내피 세포의 기원은 불분명하다. 신인티마 형성 세포가 모집되는 출처에 관한 문헌에서 지속적인 논쟁이 있습니다.

쥐의 복부 대동맥에 CM-Dil 염료 ( 물질의 표 참조)를 주사 한 세포 추적기를 사용하여, 우리는 두 개의 다른 FU 시점 (7 일과 21 일째)에서 신생 내막 형성에서 부모 동맥에서 기원되는 내피 세포의 역할을 분석하는 것을 목표로했습니다 (그림 1). 이 모델의 장점은 동맥류 봉합 전에 부모 동맥 에서 생체 내에서 직접 국소 세포 추적기 인큐베이션하여 나중 시점에서 FU를 허용하는 것입니다. 생체내 주입 기술, 예컨대 세포-트레이서 인큐베이션은 문헌에 기재되어 있지 않다. 이 기술의 장점은 직접, 원 포인트, 수술 내, 생체 내 주사로 모델을 강력하고 재현 가능하게 만듭니다.

프로토콜

수의학 지원은 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 스위스 지역 윤리위원회 (BE 60/19)의 승인을 받았다. ARRIVE 지침과 3R 원칙은 ^6,7을 엄격히 준수했습니다. 12주령이고 체중이 492± 8g인 서른 마리의 수컷 루이스 래트가 포함되었다. 모든 쥐를 23 °C의 실온과 12 시간의 빛 / 어두운 사이클에 보관하십시오. 물과 펠릿에 무료로 접근 할 수 있습니다. 통계 분석은 비모수 Wilcoxon-Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 수행되었습니다. 0.05 및/또는 0.01≤의 확률 값(p)≤ 유의한 것으로 간주하였다.

1. 수술 전 단계 - 일반 준비 및 마취 학적 측면

1. 웹 기반 무작위화 시스템을 통해 쥐를 코일 또는 스텐트 처리 그룹(그림 2)으로 무작위화합니다. 이제 23 ± 3 °C의 실내 온도를 유지하는 조용하고 무균 수술실 옆에서 수술을 위해 계획된 모든 동물에 대한 수술 전 임상 검사를 수행하십시오. 동물의 행동을 분석하고 수술 전 임상 검사의 일환으로 점막과 터고르를 검사하십시오.
2. 각 동물의 무게를 기록하십시오.
3. 수술 전에, 공여 래트로부터 동맥 파우치를 37°C에서 10시간 동안 0.1% 소듐 도데실 설페이트에 인큐베이션하여 탈세포화된 동맥류⁸을 얻었다. 수술 며칠 전에 기증자 동물로부터이 파우치를 수집하십시오.
   1. 미세 가위와 포셉으로 복부 대동맥의 전체 길이를 준비하고 3-4mm 간격으로 6-0 개의 비 흡수성 합자를 적용하십시오.
   2. 기증자 동물의 흉부 부분으로부터 이전에 결찰된 동맥 혈관 파우치에 의해 수술내 중요한 동맥류를 직접 생성한다⁹. 표시된 FU 시점에서 가위 및 수술 포셉으로 흉부 절제술을 수행하고 원하는 길이로 용기 주머니를 리게이트하십시오.
4. 파우치를 수용자에게 직접 이식하고 추가 거시적 분석 및 조직학적 처리를 위해 기증자 동물로부터 동맥류를 수확합니다.
5. 마취 유도를 위해, 모든 쥐를 5-10분 후에 의식이 상실될 때까지 산소(_O2)가 제공된 깨끗한 상자에 넣는다. 펜타닐 0.005 mg / kg, 메데토미딘 0.15 mg / kg 및 미다 졸람 2 mg / kg의 혼합물을 피하 (SC) 주사로 쥐를 마취하십시오.
   참고: 이것은 적어도 45 분의 수술 평면을 보장합니다.
6. 페달 금단 반사의 부재에 의해 마취의 깊이를 확인하십시오.
7. 쥐를 수핀 위치에 놓고 전기 면도기로 흉부 복부 부분을 면도하십시오.
8. 자동 조절 직장 프로브에 연결된 가열 패드로 덮인 보드에 테이프로 쥐의 4 발을 고정하십시오. 직장 프로브를 쥐의 항문에 삽입하여 가열 패드의 도움으로 37°C의 원하는 온도를 유지한다.
9. 이제 수술 중 활력 징후를 검사하기 위해 컴퓨터 시스템에 연결된 오른쪽 뒷다리에 센서를 설치하십시오.
10. 얼굴 마스크로 쥐의 코와 입을 가리십시오. 장기간의 마취가 필요한 경우, 이소플루란을 시작하십시오 (1.0-2.0 % 적정하여 100 %_O2에서 효과).
11. 포비돈 요오드 또는 교대 소독제로 수술 현장을 소독하고 멸균 방식으로 수술 현장을 드레이프하십시오.
12. 주변 마취 치료를 위해 멸균 안과 윤활제를 눈에 바르고 불투명 한 호일 마스크로 덮어 수술 램프의 건조 및 손상을 방지하십시오.
13. 수술 전반에 걸쳐 안면 마스크를 통해 지속적으로 산소를 공급하고 체온을 모니터링하며 가열 패드를 사용하여 열을 공급하여 정상 온체를 유지합니다.
14. 다른 활력 징후를 지속적으로 모니터링합니다 (맥박 및 호흡 긴장, 심장 및 호흡 속도, 산소 포화도).

2. 수술 단계 - 세포 추적기 주입

참고: 헬싱키 쥐 미세외과 측벽 동맥류 모델⁹의 상세한 외과적 접근법 및 코일 및 스텐트-이식을 위한 기술은 다른 곳에서 기술된다 8,10,11.

1. 형광 친유성 세포-트레이서를 항상 ≤-20°C에서 보관하고, 빛으로부터 보호한다.
2. 쥐 대동맥 및 기병 정맥을 준비하여 수술을 수행하고, 대동맥의 근위 및 원위 임시 클램핑뿐만 아니라 둘 다의 분리를 수행한다.
   참고: 이 기술은 이전에⁹에 설명되어 있습니다.
   1. 대동맥의 근위 및 원위 부분을 두 개의 임시 타이탄 클립으로 고정하십시오.
3. 동맥의 더 나은 시각화를 위해 대동맥의 근위 및 원위 부분 아래에 각각 보라색 패딩이있는 하나의 미세 면봉을 넣으십시오.
4. 이제 젖은 거즈로 복부를 보호하십시오.
5. 조작 당일에, 1 mL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 피펫팅함으로써 2 μL의 세포-트레이서를 용해시킨다.
6. 혼합물을 27-1/2 G (0.4 x 13 mm) 멸균 캐뉼라가 장착된 1 mL 주사기로 옮긴다.
   참고: 2.5 및 2.6단계를 수행하는 동안 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오.
7. 수술실의 조명을 끕니다. 현미경으로 보면서 마이크로 포셉을 사용하여 대동맥의 중간 복부 부분에 원 포인트 주사를 수행하고 헤파린화 된 0.9 % 식염수 1 mL를 조심스럽게 주입하십시오.
8. 세포 추적기를 조심스럽게 주입하고 (비디오 1) 즉시 작동 현미경을 끕니다. 다시 젖은 거즈로 복부를 보호하십시오.
9. 염료를 적어도 15 분 동안 인큐베이트하게하십시오. 잠복기가 끝나면 현미경과 수술실 조명을 켭니다.
10. 동맥류의 종동맥 절제술 및 봉합을 수행하며, 다른 곳에서 설명된 바와 같이(¹¹).
    1. 마이크로 포셉과 미세 가위를 사용하여 동맥 절제술을 수행하여 길이가 수확 된 동맥류의 직경을 평균화하도록하십시오 (단계 1.3). 정확한 길이를 보장하려면 동맥 절제술을 수행하기 전에 대동맥류를 대동맥 옆에 두십시오. 흡수되지 않는 10-0 봉합사를 사용하여 8-10 개의 단일 스티치로 동맥류를 봉합하고, 헤파린화 된 식염수로 연속 관개 하에서 원위 적으로 시작하는 임시 클램프를 조심스럽게 제거하십시오. 상처를 겹겹이 겹쳐서 닫으십시오. 참고로, 1cm의 코일 패킹 밀도를 사용하십시오.
       참고 : 코일 또는 스텐트 이식 기술은 다른 곳에서 설명되었습니다 ^8,10.

3. 수술 후 단계 모니터링 및 진통제 치료

1. 수술이 끝나면 부프레노르핀 0.05 mg/kg, 아티파메졸 0.75 mg/kg 및 플루마제닐 0.2 mg/kg의 SC 주사 혼합물로 마취를 역전시킵니다. 필요에 따라 가열 램프로 완전히 깨어나고 따뜻해질 때까지 각 조작 된 동물이 깨끗한 새장에서 회복되도록하십시오.
2. 3 일 동안 1 mg / kg meloxicam (하루에 1 회 주사 또는 경구 투여) 및 buprenorphine (매일 0.05 mg / kg) SC. 밤새 동일한 용량으로 음용수에 부프레노르핀을 지속적으로 제공하십시오 : 6 mL 부프레노르핀 0.3 mg / mL, 360 mL 식수, 10 mL 5 % 포도당.
3. 즉각적인 수술 후 단계에서는 보호를 위해 각 동물을 단일 케이지에 보관하십시오. 24 시간 후에 동물을 재편성하십시오.
4. SC 주사 후 어떤 쥐가 괴로워하거나 공격적인 행동을 보이면 하루 동안 식수에 부프레노르핀을 투여하십시오.
5. 케이지 바닥에 부드러운 사료를 제공하여 수술 후 먹이와 회복을 지원하십시오.
6. 웰빙 및 통증 점수 시트에 따라 모든 동물을 관찰하고 돌보십시오.
7. 필요한 경우 구조 진통 SC (멜록시캄 1 mg / kg 및 0.05 mg / kg 부프레 노르 핀)를 투여하십시오.

결과

총 31마리의 동물이 실험실 환경에 포함되었다: 27마리의 래트가 최종 통계 분석에 포함되었다; 4 마리의 쥐가 조기에 사망했습니다 (사망률 12.9 %). 수술내에서, 호흡 팽만감은 코일 처리된(13.5 μm ± 0.6) 래트에 비해 스텐트-(12.9 μm ± 0.7)에서 유의하게 감소하였다(p=0.03). 형광 혈관조영술은 최종 FU의 말기에 모든 래트에 대해 수행되었다. 재관류는 코일 처리된 6마리의 동물 모두에서 나타났지...

토론

이 연구는 신생내막 형성이 동맥류 복합체의 모 동맥에서 기원 한 내피 세포를 통해 매개되지만 중요한 동맥류의 동맥류 벽에서 유래 된 세포의 모집에 의해 뒷받침된다는 것을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고, 동맥류 치유에서 순환 전구 세포의 역할은 논란의 여지가있는^12,13 가지로 남아 있습니다. 전반적으로, 31마리의 수컷 루이스 래트가 이 조사에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary