엘라스타제의 혈관주위 적용에 의해 유도된 마우스 복부 대동맥류 모델

요약

본 프로토콜은 마우스에서 적외선 복부 대동맥의 출현에 엘라스타제의 직접 적용을 통해 엘라스타아제 유도 AAA 모델에 대한 표준화된 수술 방법을 기술한다.

초록

복부 대동맥류 (AAA)는 주로 무증상이지만 AAA의 파열은 대개 치명적인 결과를 초래하기 때문에 잠재적으로 생명을 위협합니다. 현재, AAA의 몇 가지 뚜렷한 실험 모델이 있으며, 각각은 AAA의 발병기전에서 다른 측면을 강조합니다. 엘라스타아제-유도된 AAA 모델은 두 번째로 가장 많이 사용되는 설치류 AAA 모델이다. 이 모델은 돼지 췌장 엘라스타제 (PPE)를 대동맥의 적외선 세그먼트에 직접 주입하거나 적용하는 것을 포함합니다. 기술적 과제로 인해, 오늘날 대부분의 엘라스타아제-유도 AAA 모델은 PPE의 발광 내 주입이 아닌 외부 적용으로 수행된다. 엘라스타제의 침윤은 내측 층에서 탄성 라멜라의 분해를 일으켜 대동맥벽 완전성의 상실과 복부 대동맥의 후속 팽창을 초래합니다. 그러나, 엘라스타아제 유도 AAA 모델의 한 가지 단점은 수술이 수행되는 방법의 불가피한 변화이다. 구체적으로, 대동맥의 인프레레날 세그먼트를 분리하는 수술 기술, 대동맥 래핑 및 PPE 인큐베이션에 사용되는 물질, PPE의 효소 활성 및 PPE 적용의 시간 지속 기간은 모두 최종 AAA 형성 속도 및 동맥류 직경에 영향을 미치는 중요한 결정 요인이 될 수 있다. 특히, AAA에 대한 다른 연구에서 이러한 요인의 차이는 재현성 문제로 이어질 수 있습니다. 이 글에서는 마우스에서 내란성 복부 대동맥의 출현에 PPE를 직접 적용함으로써 엘라스타아제 유도 AAA 모델의 상세한 수술 과정을 설명한다. 이 절차에 따라, 수컷 및 암컷 마우스에서 약 80 %의 안정적인 AAA 형성률을 달성 할 수 있습니다. 엘라스타아제 유도 AAA 모델을 사용하는 AAA 연구의 일관성 및 재현성은 표준 수술 절차를 확립함으로써 상당히 향상될 수 있다.

서문

복부 대동맥류(AAA)는 혈관 직경¹의 적어도 50% 증가를 갖는 복부 대동맥의 분절 확장으로 정의된다. AAA는 파열로 인해 ^개입 2,3,4에서도 사망률이 매우 높아질 수 있으므로 잠재적으로 치명적입니다. AAA는 미국에서 매년 약 13,000 명의 사망자를 담당하고 있으며, 이는 10^번째 주요 사망 원인 ^1,5입니다.

AAA의 발병기전은 아직 완전히 이해되지 않았습니다 ^6,7,8. AAA의 분자 메카니즘을 조사하고 잠재적인 치료 표적을 시험하기 위해, 몇몇 실험적 AAA 모델이 ^9,10개 확립되었다. AAA의 설치류 모델은 엘라스타제, 염화칼슘, 안지오텐신 II 및 이종이식편 모델을 포함하며, 그 중 엘라스타제-유도된 AAA 모델은 두 번째로 가장 많이 사용되는 모델 10,11,12,13,14,15,16,17이다. 이 모델은 돼지 췌장 엘라스타제 (PPE)를 대동맥의 적외선 세그먼트에 직접 주입하거나 적용하는 것을 포함합니다. 대동맥의 내층으로의 엘라스타제의 침투는 탄성 라멜라의 분해와 염증 세포의 침윤을 일으켜 대동맥 완전성의 상실과 복부 대동맥 ^7,18의 후속 팽창을 초래합니다. 엘라스타제-유도된 AAA 모델은 1990년 래트를 사용하여 Anidjar et al.에 의해 처음 보고되었으며, 대동맥의 단리된 세그먼트가 엘라스타제¹⁷로 관류되었다. 2012년 후반에, PPE의 주위 모험적 적용을 이용한 수정된 모델이 Bhamidipati et ^al.19에 의해 보고되었다. 요즘 엘라스타아제 유발 AAA 모델에 대한 대부분의 수술은 Bhamidipati 그룹에서 영감을 얻었으며 PPE의 발광 내 관류가 아닌 외부 적용으로 수행됩니다. 외부 적용은 미세 수술 기술에 대한 요구 사항이 적지 만 AAA의 발생률은 상대적으로 낮고 크기는 발광 내 관류^11,19보다 다소 작습니다.

AAA 연구에서 널리 사용되지만, 엘라스타아제-유도된 AAA 모델은 특정 한계를 갖는다. 이 모델의 한 가지주의 사항은 수술이 수행되는 방법의 필연적 인 변형이며, 이는 재현성 문제로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 대동맥의 내막 세그먼트가 어떻게 분리되는지, 그리고 세그먼트의 어느 부분이 다른 실험실들 사이에서 PPE 적용을 위해 선택되는지에 관한 외과 적 절차에서 차이가 존재할 수 있습니다. PPE의 효소 활성 및 PPE 인큐베이션의 시간 지속 기간도 달라질 수 있습니다. 그러나 이들은 모두 최종 AAA 형성 속도 및 동맥류 직경에 영향을 미치는 필수 결정 요인입니다. 이러한 중요한 결정 요인의 변화는이 모델을 사용하는 다른 그룹의 AAA 연구의 데이터 비교를 매우 어렵게 만듭니다. 따라서 표준화 된 외과 적 절차는 다양한 기관에서 비교 가능한 결과를 얻는 도구로 필요합니다.

이 글에서는 마우스에서 인프레레날 복부 대동맥의 출현에 PPE를 직접 적용함으로써 엘라스타아제 유도 AAA 모델에 대한 표준화된 수술 프로토콜을 설명한다. 이 모델을 사용하는 마우스에서 AAA의 성공적이고 견고한 생성에 필수적인 수술 재료 및 절차에 대한 세부 사항도 논의 될 것입니다.

프로토콜

동물 프로토콜은 미시간 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (PRO00010092)의 승인을 받았습니다. 수컷과 암컷 C57BL/6J 야생형(WT) 마우스, ∼7주령을 실험에 사용하였다.

1. 동물 준비

1. 수술 전후에 표준 차우 다이어트 ( 자료 표 참조)로 마우스에게 먹이를주십시오.
   참고 : 마우스의 다른 균주와 나이를 사용할 수 있습니다. 그러나 최대 발병률을 달성하기 위해 5.5-12 주 사이의 연령이 권장됩니다.
2. 각 마우스에 대해 마취 유도 30 분 전에 5 mg / kg의 Carprofen을 피하 투여하십시오.
3. 30 분 후, 마취를 유도하기 위해 복강 내 주사 를 통해 케타민 100 mg / kg과 자일라진 5mg / kg을 투여하십시오.

2. 수술 준비

1. 수술 용 재료를 준비하십시오.
   1. 니트릴 장갑을 4cm x 4mm의 스트립으로 자릅니다. 면봉을 3cm x 2mm 조각으로 자릅니다. 외과 용 가위, 조직 포셉 및 Halsted-Mosquito 지혈제를 포함한 다른 수술 도구로 이들을 오토클레이브하십시오 ( 자료 표 참조).
2. 마우스를 멸균 흡수성 드레싱 패드 상의 수핀 위치에 놓는다. 수술용 테이프로 앞발과 뒷발을 고정시킵니다.
3. 면이 달린 어플리케이터 ( 재료 표 참조)를 사용하여 중간 및 하부 복부 부위에 헤어 리무버 로션을 닦은 다음 수술 거즈로 면봉하여 머리카락을 제거하십시오.
4. 70 % 알코올과 요오드 계 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 번갈아 가며 원형 운동으로 수술 부위를 적어도 세 번 소독하십시오. 말리십시오.

3. 수술 절차

1. 복강에 접근하려면 다음 단계를 수행하십시오.
   1. 피부 절개 전에 발가락 핀치 반응의 부족에 대해 마우스를 테스트하십시오.
   2. 외과 용 가위를 사용하여 중복부와 하복부의 중간 선을 따라 피부에 2.5cm 세로 절개를하십시오.
   3. 부드럽게 하부 근육을 당기고 복강에 접근하기 위해 linea alba를 따라 2.5cm 세로 절개를하십시오.
2. 복부 대동맥을 노출하십시오.
   1. 젖은 면봉 팁이 달린 어플리케이터를 사용하여 창자와 위를 마우스의 오른쪽으로 옮깁니다.
      참고 : 이상적으로, 이것은 대동맥의 주름 세그먼트를 노출시킵니다. 대동맥을 찾기가 어려운 경우 오른쪽 신장과 오른쪽 신장 동맥이 대동맥을 식별 할 수 있습니다 (오른쪽 신장은 왼쪽 신장보다 해부학 적 위치가 약간 낮기 때문에).
   2. 포셉을 사용하여 복부 대동맥과 열등한 정맥 카바 (IVC)를 덮고있는 결합 조직을 부드럽게 제거하십시오.
      참고 : 복부 대동맥과 IVC는 동일한 혈관 외피 내에 포함되어 있습니다. 완전한 제거는이 두 혈관을 손상시킬 위험을 증가시킬 수 있으므로 모든 결합 조직을 제거 할 필요가 없습니다.
   3. 포셉을 사용하여 복부 대동맥의 뒷면과 IVC를 기본 근육에서 부드럽게 해부하십시오.
      참고 : 포셉의 팁은 칼집의 뒷면으로 횡단으로 들어가 칼집을 기본 근육에 연결하는 근막에 구멍을 만들어야합니다. 구멍이 만들어지면 포셉을 천천히 풀어 크기를 확장하십시오.
   4. 복부 대동맥과 IVC의 뒷면을 통해 4cm x 4mm 장갑 줄무늬 (앞에서 언급 한 바와 같이, 2.1.1 단계)를 놓은 다음 줄무늬를 곧게 펴십시오. 줄무늬를 오른쪽 신장 동맥에서 ~ 0.5cm 떨어진 곳에 놓습니다.
      참고 : 주변 근막이 줄무늬를 비틀지 않도록 구멍이 충분히 큰지 확인하십시오.
   5. 줄무늬 위에 복부 대동맥과 IVC의 뒷면을 통해 3cm x 2mm면화 패드 조각을 놓은 다음 면봉을 곧게 펴십시오.
3. 엘라스타제를 인큐베이션한다.
   1. 피펫을 사용하여 30 μL의 돼지 췌장 엘라스타제 (1.8 단위의 총 효소 활성, 재료 표 참조)를 면봉 위의 대동맥 세그먼트에 떨어 뜨린 다음 면봉을 감싸고 대동맥 및 IVC 주위에 줄무늬를 감싼다. 멸균 된 0.9 % 식염수로 10cm x 10cm 거즈 조각을 헹구고 복부에 놓습니다.
      참고 : 거즈는 과용하면 아래의 엘라 스타아제를 희석 할 위험이 있으므로 부분 헹굼 만 있으면됩니다.
   2. 30 분 후에 포셉으로 줄무늬와 면봉을 제거하십시오.
4. 아래 단계에 따라 복강을 닫으십시오.
   1. 500 μL의 멸균 0.9 % 식염수로 대동맥과 복강을 관개하십시오. 10cm x 10cm 거즈를 사용하여 나머지 식염수를 흡수하십시오.
   2. 6-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사로 근육층을 재근사화합니다.
   3. 3-4 중단 된 6-0 개의 비 흡수성 모노 필라멘트 봉합사로 피부를 닫습니다.

4. 수술 후 관리

1. 수술 후 1 일째에 5mg / kg의 Carprofen을 피하 투여하십시오.
2. 수술 후 10 일째에 피부 봉합사를 제거하십시오.

5. 복부대동맥류 직경의 측정

1. 마우스를 수술 후 14일째에_CO2 과용투여에 의해 안락사시킨다. 이것은 최대 팽창의 시점을 나타냅니다.
2. 단계 3.1에 설명된 대로 복강에 접근한다.
3. 좌심실을 통해 순환계에 0.9 % 생리 식염수 10 mL를 주입하여 혈관 관류를 수행하십시오.
4. 단계 3.1-3.2에 기재된 바와 같이 복부 대동맥의 내막 세그먼트를 노출시킨다. 조심스럽게 주변 결합 조직을 제거하고 IVC에서 복부 대동맥을 분리하십시오.
5. 캘리퍼로 복부 대동맥의 직경을 측정하십시오.

결과

암컷 12마리와 수컷 11마리를 포함한 총 스물세 마리의 7주령 야생형(WT) 마우스가 제시된 프로토콜에 따라 조작되었다. 생존율은 100%였다(외과적 사망률 제외). 최대 복부 대동맥 직경은 캘리퍼에 의해 측정되었다.

AAA는 50% 혈관 직경 증가로 복부 대동맥을 팽창시키는 것으로 정의되었다. 따라서, 최대 복부 대동맥 직경의 50% 증가가 성공적인 AAA 유도를 위한 컷오프 포인트로서 ...

토론

엘라스타제-유도된 AAA 모델은 1990년¹⁷년에 래트를 사용하여 Anidjar et al.에 의해 처음 보고되었다. 지난 삼십 년 동안 다양한 수정 버전이 도입되었으며, 수술 기술^19,20,21,22의 상당한 개선이 ^{이루어졌습니다.} 수백 개의 연구소는 AAA 연구¹²에서 두 번째로 가장 많이 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20