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요약

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

초록

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간세포암의 중요한 위험 요소로 간주되어 왔습니다. 현재의 치료는 바이러스 부하를 줄일 수 있을 뿐 완전한 관해를 초래하지는 않습니다. HBV 감염에 대한 효율적인 간세포 모델은 치료제 스크리닝에 중요한 실제 바이러스 수명 주기를 제공할 것입니다. 대부분의 사용 가능한 항 HBV 제제는 바이러스 진입 후 수명주기 단계를 목표로하지만 바이러스 진입 전에는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 바이러스 진입 전 및 바이러스 진입 후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 치료제를 스크리닝할 수 있는 유능한 간세포 모델의 생성을 자세히 설명합니다. 여기에는 숙주 세포로서 imHC 또는 HepaRG를 기반으로 하는 나트륨 타우로콜레이트 공동 수송 폴리펩티드(NTCP) 결합, cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 조립의 표적화가 포함됩니다. 여기서, HBV 진입 억제 분석은 NTCP를 통한 HBV 결합 및 수송 기능을 억제하기 위해 커큐민을 사용하였다. 억제제는 열역학적 파라미터에 기초한 HBV 약물 스크리닝을 위한 범용 도구인 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 NTCP와의 결합 친화도(KD)에 대해 평가되었습니다.

서문

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 생명을 위협하는 질병으로 간주됩니다. 만성 HBV 감염은 간경변 및 간세포 암종1의 위험이 있습니다. 현재의 항 HBV 치료는 주로 핵 (t) ide 유사체 (NA) 및 인터페론 알파 (IFN-α)2,3를 사용한 바이러스 후 진입에 중점을 둡니다. HBV 진입 억제제 인 Myrcludex B의 발견은 항 HBV 제제4에 대한 새로운 표적을 확인했습니다. 만성 HBV에서 진입 억제제와 NA의 조합은 바이러스복제 단독을 표적으로 하는 것에 비해 바이러스 부하를 유의하게 감소시켰습니다5,6. 그러나, HBV 진입 억제제의 스크리닝을위한 고전적인 간세포 모델은 낮은 바이러스 수용체 수준 (나트륨 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드, NTCP)에 의해 제한된다. 간암 세포(즉, HepG2 및 Huh7)에서 hNTCP의 과발현은 HBV 감염성을 개선합니다 7,8. 그럼에도 불구하고, 이들 세포주는 낮은 수준의 I 및 II 상 약물 대사 효소를 발현하고 유전 적 불안정성을 나타낸다9. 전바이러스 진입, NTCP 결합 및 바이러스 진입과 같은 후보 항-HBV 화합물의 뚜렷한 메커니즘을 표적으로 하는 데 도움이 될 수 있는 간세포 모델은 효과적인 조합 요법의 식별 및 개발을 촉진할 것입니다. 커큐민의 항 HBV 활성에 대한 연구는 바이러스 진입 중단 후 새로운 메커니즘으로서 바이러스 진입 억제를 해명했습니다. 이 프로토콜은 항-HBV 진입 분자10의 스크리닝을 위한 숙주 모델을 상세히 설명한다.

이 방법의 목표는 바이러스 진입 억제, 특히 NTCP 결합 및 수송 차단을 위한 후보 항-HBV 화합물을 탐색하는 것입니다. NTCP 발현은 HBV 진입 및 감염에 중요한 요소이므로 NTCP 수준11을 최대화하기 위해 간세포 성숙 프로토콜을 최적화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 HBV 진입에 대한 억제 효과를 HBV 부착의 억제 대 내재화의 억제로서 구별할 수 있다. 타우로 콜산 (TCA) 흡수 분석은 또한 NTCP 수송12,13을 나타 내기 위해 방사성 동위 원소 대신 ELISA 기반 방법을 사용하여 변형되었습니다. 수용체와 리간드 상호작용은 이들의 3D 구조14,15에 의해 확인되었다. NTCP 기능의 억제는 TCA 흡수 활성(16)을 측정함으로써 평가할 수 있다. 그러나, 이 기술은 후보 억제제에 대한 NTCP 결합의 직접적인 증거를 제공하지 않았다. 따라서, 결합은 다양한 기술, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(17), ELISA, 형광-기반 열 이동 분석(FTSA)18, FRET19, 알파스크린(AlphaScreen) 및 다양한 다른 방법(20)을 사용하여 조사될 수 있다. 이들 기술 중에서, ITC는 거의 모든 반응에서 열 흡수 또는 방출을 관찰할 수 있기 때문에 결합 분석의 목표 표준이다(21). NTCP와 후보 화합물의 결합 친화도(KD)는 ITC를 사용하여 직접 평가되었습니다. 이들 친화도 값은 In Silico 예측 모델22를 사용하여 수득된 값보다 더 정확하였다.

이 프로토콜은 간세포 성숙, HBV 감염 및 HBV 진입 억제제 스크리닝 기술을 다룹니다. 간단히 말해서, 간세포 모델은 imHC 및 HepaRG 세포주를 기반으로 개발되었습니다. 배양된 세포는 2주 이내에 성숙한 간세포로 분화되었다. NTCP 수준의 상향 조절은 real-time PCR, 웨스턴 블롯 및 유세포분석11을 사용하여 검출하였다. B형 간염 비리온(HBVcc)을 생산하고 HepG2.2.15로부터 수집하였다. 분화된 imHC 또는 HepaRG (d-imHC, d-HepaRG)를 HBV 비리온으로 접종하기 2시간 전에 항-HBV 후보로 예방적으로 처리하였다. 실험의 예상 결과는 세포 HBV와 감염성을 감소시키는 약제의 확인이었습니다. 항-NTCP 활성은 TCA 흡수 분석을 사용하여 평가하였다. NTCP 활동은 NTCP를 구체적으로 바인딩한 에이전트에 의해 억제될 수 있습니다. ITC 기술은 억제제 및 그의 표적 단백질을 예측할 수 있는 상호작용적 결합의 타당성을 조사하기 위해 사용되었고, 생체분자 복합체23,24의 비공유 상호작용을 통해 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도(KD)를 결정하였다. 예를 들어, KD≥ 1 × 103 mM은 약한 결합을 나타내고, KD≥ 1 ×10 6 μM은 중간 결합을 나타내고, KD≤ 1 × 109 nM은 강한 결합을 나타낸다. ΔG는 결합 상호 작용과 직접적인 상관 관계가 있습니다. 특히, 음성 ΔG와의 반응은 exergonic 반응이며, 이는 결합이 자발적인 과정임을 나타낸다. 음의 ΔH를 갖는 반응은 결합 과정이 수소 결합과 반 데르 발스 힘에 의존한다는 것을 나타낸다. TCA 섭취 및 ITC 데이터 모두 항 HBV 진입 제제를 선별하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 결과는 항 HBV 스크리닝뿐만 아니라 결합 친화도 및 수송 기능을 통해 평가되는 NTCP와의 상호 작용을위한 기초를 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 숙주 세포 준비 및 특성화, 실험 설계 및 NTCP 결합 친화도와 함께 항 -HBV 항목의 평가에 대해 설명합니다.

프로토콜

알림: 다음 절차는 Class II 생물학적 위험 흐름 후드 또는 층류 후드에서 수행해야 합니다. HBV의 취급은 IRB (MURA2020/1545)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 용액, 시약, 장비 및 세포주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 숙주세포(성숙간세포) 준비

  1. 간세포(3.75 × 105 세포 HepaRG 또는 imHC)를 배양하고 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지 10mL가 있는 75cm2 배양 플라스크에서 유지합니다. 세포가 80%-90% 합류에 도달할 때까지 기다립니다(1주일 이내).
  2. 플라스크에서 오래된 배지를 버리고 4mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
  3. PBS를 흡인하고 0.05% 트립신-EDTA 4mL를 추가합니다.
  4. 플라스크를 37°C 인큐베이터에서 2-3분 동안 배양하고 10x 대물 렌즈가 있는 도립 현미경을 사용하여 부착 세포를 확인합니다. 단층이 배양 표면에서 분리되었는지 확인하십시오.
  5. 플라스크에 10% FBS가 보충된 배양액 4mL를 첨가하여 트립신을 억제하고 수확한 세포를 조심스럽게 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 300× g, 25°C에서 3분 동안 원심분리합니다.
  6. 세포 펠릿에서 상청액을 흡인하고 10% FBS와 항생제가 보충된 예열된 배양 배지 1-2mL로 재현탁합니다.
  7. 세포 현탁액 10 μL와 트립판 블루를 각각 혼합하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수한다. 다음 단계로 진행하기 전에 세포 생존율이 90 %보다 높은지 확인하십시오.
  8. 6웰 플레이트의 각 웰에 2mL당 1 ×10 개의 6개의 세포를 시드하고 세포가 100% 합류에 도달할 때까지 DME/F12 완전 배지에서 유지합니다.
  9. 간 성숙을 위해 간 성숙 배지(10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 5μg/mL 인슐린, 50μM 하이드로코르티손, 2mM L-글루타민 및 2% DMSO가 보충된 Williams' E 배지)를 준비합니다.
  10. 배양 배지를 일주일에 2번 교체하십시오.
  11. HBV 감염 준비가 된 성숙한 간세포를 얻기 위해 2 주 동안 성숙 배지에 간세포를 유지하십시오.

2. 세포 NTCP의 정량화

  1. 실시간 PCR을 사용한 NTCP 발현 측정
    1. 트립신 화를 통해 성숙한 간세포의 펠릿을 수집하십시오 (1.2-1.5 단계 참조).
    2. DNase I 처리가 포함된 RNA 추출 키트를 사용하여 세포 펠릿에서 총 RNA를 추출합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 oligo-dT 프라이머와 역전사 시스템을 사용하여 총 RNA 200ng에서 cDNA를 합성합니다.
    4. cDNA를 50ng/μL로 희석하여 PCR 반응을 위한 주형으로 사용합니다. 희석된 cDNA 2μL를 SYBR 녹색 qRT-PCR 키트 용액을 포함하는 PCR 마스터 믹스 시약과 5μM NTCP 특이적 프라이머(5'-GGACATGAACCCCCCCTGGAGTAGAT-3')와 혼합합니다.
    5. 정규화를 위해 GAPDH 를 특정 프라이머 (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3'및 5'-AAATGAGCCCCACCCTTCTC-3')가있는 하우스 키핑 유전자로 사용하십시오.
    6. 다음의 온도 조건 하에 열 순환기를 사용하여 cDNA 샘플을 증폭한다: 95°C에서 3분의 1 사이클 (초기 변성); 95 °C에서 30 초 (변성), 60 °C에서 65 °C (어닐링)에서 30 초, 72 °C (연장)에서 30 초의 40 사이클; 72°C에서 5분의 1 사이클(최종 연장).
    7. 2-ΔΔCT 방법에 기초한 보정 유전자로서 GAPDH를 사용하여 미분화 세포에 대한 성숙한 간세포의 NTCP 배 변화를 계산한다.
  2. 웨스턴 블롯 분석을 사용한 NTCP 정량화
    1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 간세포를 수확하고 이를 300 x g, 25°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수집한다.
    2. RIPA 완충액 제조업체의 지침에 따라 1x 프로테아제 억제제가 포함된 100μL의 RIPA 완충액으로 세포 단백질을 추출합니다.
    3. 비신코닌산(BCA) 방법을 사용하여 총 단백질 농도를 측정합니다.
    4. 12.5μL의 단백질과 2x 로딩 염료를 부피 기준으로 1:1 비율로 혼합합니다.
    5. 단백질 혼합물과 표준 사다리를 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
    6. 전기 영동 챔버에 1x 실행 버퍼를 추가합니다.
    7. 5 μL의 단백질 표준 사다리 또는 20 μL의 끓인 단백질 혼합물을 10%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔에 넣습니다.
    8. 겔 전기 영동 수행 : 30 분 동안 50V, 실온에서 1 시간 동안 90V.
    9. 메탄올에 30초 동안 담가 PVDF 멤브레인을 준비하고, 이중 증류수로 1-2분 동안 세척하고, 여과지 2장과 함께 전사 버퍼에 10분 동안 또는 사용할 때까지 담근다.
    10. 여과지를 반건식 이송 셀의 양극 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 PVDF 멤브레인, 젤 및 여과지를 순서대로 위에 놓습니다.
    11. 실온에서 25 분 동안 10V에서 단백질을 PVDF 막으로 옮깁니다.
    12. 실온에서 1시간 동안 WB 차단 용액으로 멤브레인을 차단합니다.
    13. 멤브레인을 항-나트륨 타우로콜레이트 공동 수송 폴리펩티드 (항-NTCP) (1:100 희석)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
    14. TBST로 멤브레인을 3 x 10 분 세척하십시오.
    15. 양 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 접합 염소 항 토끼 항체 (1 : 10,000 희석)로 막을 실온에서 1 시간 동안 배양합니다.
    16. TBST로 멤브레인을 3 x 10 분, TBS로 1 x 5 분 세척하십시오.
    17. HRP 기판을 사용하여 NTCP를 검출합니다( 재료 표 참조).
    18. 멤브레인의 최소 0.1mL의 HRP 기질 용액/cm2 를 추가하고 멤브레인을 어두운 곳에서 3-5분 동안 배양합니다.
    19. 화학 발광 모드에서 젤 문서화 시스템을 사용하여 NTCP를 시각화하고, 멤브레인의 마커 옵션을 선택하고, 1분마다 누적 모드로 노출 시간을 조정하고, 5분 동안 다양한 노출 시간으로 사진을 촬영합니다.
    20. 마우스 항-GAPDH 항체(1:200,000 희석) 및 HRP-접합 염소 항-마우스 2차 항체(1:10,000 희석)로 블롯을 스트립하고 프로브합니다.
  3. 유세포분석을 사용한 NTCP 수준 측정
    1. 세포를 8mM EDTA로 15분 동안 배양하여 성숙한 간세포의 세포 펠릿을 수집합니다.
      알림: 트립신 또는 세포 표면 수용체를 방해할 수 있는 다른 프로테아제의 사용을 피하십시오. NTCP는 세포 표면 수용체 단백질이므로 트립신 화로 인한 손상은 부정적인 결과를 초래할 수 있습니다.
    2. 간세포를 1x PBS에서 3.7 % 파라 포름 알데히드 300 μL로 15 분 동안 고정합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮기고 300 × g, 25°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    3. 세포를 1% FBS(v/v)가 있는 1x PBS 700μL로 2x 세척하고, 300× g, 25°C에서 10분 동안 원심분리하고, PBS에 0.05% Triton X-100 300μL를 세포 펠릿에 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 배양하여 투과화시킨다.
    4. 300 × g, 25 °C에서 10 분 동안 원심 분리하고, 1 % FBS (v / v)를 함유 한 700 μL의 PBS로 3 x 1 분 동안 셀 펠릿을 세척합니다. NTCP(1:100 희석)에 대한 1차 항체와 함께 세포를 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 Perm/Wash 버퍼로 3 x 1분 동안 세척하고 300× g, 25°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    5. Alexa Fluor 488에 접합된 2차 항체로 세포를 4°C에서 30분 동안 염색합니다. 세포를 Perm/Wash 완충액으로 3 x 1분 세척하고 300 × g, 25°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 1% FBS(v/v)가 있는 200μL의 PBS로 재현탁합니다.
    6. 유세포 분석기를 켜고 레이저를 15 분 동안 예열 한 다음 일상적인 청소를 수행하십시오.
    7. 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE)을 포함한 측정 파라미터를 선택하고 소프트웨어로 자동 보정 조정을 설정합니다. 보상 대조 샘플을 포함합니다: 염색되지 않은 대조군, FITC 염색된 대조군 및 PE 염색된 대조군.
      참고: FSC 및 SSC 매개 변수는 게이팅 분석을 위한 세포 집단을 선택하기 위해 개별 셀의 크기와 세분성을 결정하는 데 사용됩니다. 형광 채널 검출기에는 FITC 및 PE 채널이 있습니다. 이 프로토콜의 경우 FITC 채널을 선택하여 Alexa Fluor 488을 탐지합니다.
    8. 염색되지 않은 샘플을 중간 유체 유속(60μL/min)으로 실행하고 FSC 및 SSC가 관심 세포 집단을 덮을 때까지 임계값을 조정하고 이 영역의 게이트 영역을 표시하고 모든 보정 제어에 적용합니다.
    9. 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 형광 광전자 증배관(PMT)을 설정하고 음의 사분면에서 FITC 또는 PE의 PMT 전압을 조정합니다. 양성 염색 샘플을 실행하고 양성 사분면 척도에서 FITC 또는 PE를 조정합니다. 염색되지 않은, FITC로 염색된 컨트롤 또는 PE 염색된 컨트롤을 실행하고 보정을 계산하여 샘플 설정에 적용합니다. 간세포 샘플을 실행하여 NTCP 수준을 측정합니다.
    10. 유세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 염색 된 간세포를 분석합니다 ( 재료 표 참조).
      1. BD FACSuite 창에서 데이터 소스 탭의 컨트롤 튜브를 클릭하고 원시 데이터가 나타날 때까지 기다립니다.
      2. 오른쪽의 워크 시트 탭에서 타원 게이트 버튼을 클릭하고 마우스 커서를 사용하여 SSC와 FSC 도트 플롯 에서 셀 모집단을 선택한 다음 원 P1이 나타날 때까지 기다립니다.
      3. 인터벌 게이트 버튼을 클릭하고 FITC 히스토그램에서 가장 높은 형광 강도 값부터 오른쪽까지 영역을 표시합니다. 나타나는 P2 줄을 관찰하십시오.
      4. 실험 튜브를 클릭하고 워크시트 탭의 데이터가 변경되는 것을 관찰합니다. 통계 단추를 클릭한 다음 워크시트의 빈 공간을 클릭합니다. 나타나는 NTCP 모집단의 통계 값을 관찰하십시오.

3. 세포 배양 유래 HBV 입자(HBVcc)의 제조

  1. HepG2.2.15를 10cm 페트리 접시에 완전 배지(DMEM에 10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충됨)에서 24시간 동안 배양합니다.
  2. HepG380이 418%-60% 합류에 도달하면 2.2.15μg/mL 제네티신(G60)이 보충된 전체 배지를 교체하십시오. 2 일마다 조절 된 배지를 수확하십시오. HBV를 함유하는 배지를 4°C에서 보관한다.
  3. 상청액을 5,000 × g, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 20mL 주사기를 사용하여 컨디셔닝 된 배지를 수집하고 0.45μm 저 단백질 결합 필터를 통해 필터링하여 세포 파편을 제거합니다.
  4. HBV를 농축하려면 원추형 원심 분리 튜브에서 3.3 단계의 여과 된 상청액 3 부피로 농축기 1 부피를 희석하고 튜브 반전으로 용액을 조심스럽게 혼합합니다. 혼합물을 4°C에서 1시간 동안 두십시오. 1,500 × g, 4 ° C에서 1 시간 동안 용액을 원심 분리하고 회백색 펠릿이 보이는지 확인하십시오.
    알림: 3.3단계에서 여과된 상청액 30mL마다 농축기 10mL를 추가하여 총 부피 40mL에 도달합니다.
  5. HBV 1.3-mer WT 플리콘을 사용한 HBV 역가(게놈 등가물)를 앞서 기술된 바와 같이 절대 실시간 PCR을 사용하여 1 × 102 내지 1 × 10 범위의 표준 곡선으로 평가한다 11.
  6. FBS에서 펠릿을 부드럽게 재구성하고 일회용 분취량으로 -80 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.

4. 항 HBV 진입 분석

  1. 성숙 배지(Williams' E 배지의 2% DMSO, 10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 5μg/mL 인슐린, 5μM 하이드로코르티손 및 2mM L-글루타민)의 6웰 플레이트에서 100% 합류 imHC 또는 HepaRG를 유지하고 배지를 주당 2회 변경합니다.
  2. 배지를 흡인 한 다음 윌리엄 E 배지로 희석 한 커큐민 (10-30 μM) 또는 4 μM 사이클로스포린 A (CsA)를 2 시간 동안 첨가합니다. 후보 HBV 진입 억제제를 흡인하고 4 % 폴리에틸렌 글리콜을 함유 한 윌리엄 E 배지 1mL로 대체하십시오.
  3. HBV 입자를 웰당 100의 감염 다중성(MOI)으로 배양 배지에 추가하고 37°C에서 18시간 동안 배양합니다. 상청액을 버리고 차가운 PBS 2mL를 넣고 부드럽게 소용돌이 치면서 결합되지 않은 HBV로 기존 배지를 헹굽니다.
  4. 완전한 윌리엄 E 배지 2mL를 추가하고 7일 동안 배양합니다. 배지를 흡인하고, 세포를 1x PBS로 세척하고, 실온에서 15분 동안 PBS 중 3.7% 파라포름알데히드로 세포를 고정한다. 감염된 세포를 IF 차단 용액(PBS 중 0.2% Triton X-100 및 3% 소 혈청 알부민)으로 투과 및 차단하고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
  5. 1차 항체(항-HBV 코어 항원)를 블로킹 용액에 1:200 희석하여 첨가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 세포를 세척 용액 (PBS 중 0.5% 트윈 20)으로 3 x 1 분 세척한다.
  6. IF 차단 용액에 2차 항체(1:500 희석)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하고, 세척 용액으로 세포를 3 x 1분 세척한다.
  7. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이 있는 페이드 방지 장착 매체로 샘플을 장착하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 20x 대물 렌즈와 함께 DAPI 필터(Ex 352-402 nM 및 Em 417-477) 및 PE 필터(Ex 542-582 및 Em 604-644)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 형광 신호를 검출하고 후보 화합물의 항-HBV 진입 활성을 확인합니다.

5. HBV 세포 결합 분석

  1. 성숙 배지(Williams' E 배지의 2% DMSO, 10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 5μg/mL 인슐린, 5μM 하이드로코르티손 및 2mM L-글루타민)의 6웰 플레이트에서 100% 합류 imHC 또는 HepaRG를 유지하고 배지를 주당 2회 변경합니다.
  2. 배지를 흡인 한 다음 윌리엄의 E 배지에 희석 된 커큐민 (10-30 μM) 또는 사이클로스포린 A (4 μM)를 2 시간 동안 첨가하십시오. HBV 진입 억제제를 흡인하고 4 % 폴리에틸렌 글리콜을 함유 한 윌리엄 E 배지 1mL로 교체하십시오.
  3. HBV 입자를 웰당 100의 MOI로 배양 배지에 첨가하고 4°C에서 2시간 동안 배양하여 HBV가 간세포에 결합할 수 있도록 합니다. 결합되지 않은 HBV가 포함된 배지를 버리고 차가운 PBS 2mL를 추가한 다음 부드럽게 소용돌이쳐 사용한 배지의 흔적을 제거합니다.
  4. 세포 스크레이퍼를 사용하여 감염된 세포를 수확하고 용해 완충액으로 세포를 파괴합니다. 파쇄물을 수집 튜브로 옮기고 총 DNA를 추출하여 HBV에 대한 특이적 프라이머(정방향 프라이머: 5'-GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3' 및 역방향 프라이머: 5'-GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3')를 사용하여 PBV에 특이적인 프라이머(정방향 프라이머: 5'-GACCAATTTATGCCTACAGC-3', 역방향 프라이머: 5'-TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') 를 사용하여 HBV DNA를 평가하였다.
  5. 단계 2.1에 설명된 온도 조건을 사용하여 열 순환기에서 PCR 산물을 증폭합니다.
  6. 2-ΔΔCT 방법을 기반으로 PRNP를 캘리브레이터 유전자로 사용하여 치료 대 대조군에서 상대적인 HBV DNA 수준/1 × 106 세포를 계산합니다.

6. 타우로콜산(TCA) 섭취 분석

  1. 14일 동안 성숙 배지에서 100% 합류 imHC 및 HepaRG 세포를 유지합니다.
  2. 배지를 흡인하고 1x PBS로 간세포를 세척하십시오. 윌리엄의 E 배지에 희석 된 커큐민 또는 사이클로스포린 A (10-50 μM)를 2 시간 동안 첨가하십시오. 배지를 나트륨 타우로 콜산 용액 (1x HEPES의 0.5M 나트륨 타우로 콜레이트 수화물)으로 교체하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다.
  3. 나트륨 타우로 콜산 용액을 흡인하고 차가운 1x hepes로 3x를 씻으십시오. 300-500 μL의 차가운 1x hepes를 추가하고 얼음 위의 세포 스크레이퍼로 세포를 수확합니다.
  4. 20 초 동안 20 kHz의 주파수에서 초음파로 세포를 균질화하고 5 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 용해물을 10,000×g에서 20 분 동안 원 심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다. 상청액을 수집하고 TCA ELISA 분석 키트를 사용하여 세포 내 타우로콜산 농도를 평가합니다( 재료 표 참조).

7. 등온 적정 열량측정을 사용한 단백질-리간드 상호작용 측정

참고: 이 분석 시스템은 MicroCal PEAQ-ITC(ITC 소프트웨어)를 기반으로 개발되었습니다.

  1. 완충액(50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0)을 준비한다.
  2. 완충액에 15μM의 NTCP를 준비합니다.
  3. 완충액에 150 μM 후보 HBV 진입 억제제 용액을 준비한다.
  4. 샘플 셀, 기준 셀, 및 주사기를 완충액을 사용하여 ITC 기기에서 세척한다(단계 7.1).
    1. Windows 시스템에서 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 ITC 소프트웨어를 실행합니다. 실험 실행 하이라이트 탭에서 19 Injection.itcm에 대한 microCal 방법을 선택하고 열기를 클릭합니다. 새 창이 열리면 청소 탭을 클릭하고 청소 방법 창에서 셀 세척 방법에 대한 세척 버튼과 주사기 세척 방법에 대한 헹굼 버튼을 선택합니다. 다음을 클릭하고 화면의 지시를 따릅니다.
      알림: 세척 단계를 완료하는 데 1.4시간이 걸릴 수 있습니다.
  5. 샘플을 ITC에 로드합니다. 실험 실행 탭에서 로드 버튼을 클릭하고 화면의 지침을 읽습니다. 다음을 클릭하고이 로딩 단계가 완료 될 때까지 비디오 지침을 따르십시오.
    1. 주사기를 사용하여 기준 셀을 용액 버퍼로 채 웁니다. 주사기를 사용하여 버퍼 중 샘플 셀을 15μM NTCP로 채우고 샘플 셀 위에서 과량의 NTCP 용액을 제거합니다. 주사기에 커큐민 (리간드)의 150μM 용액을 채우고 주사기의 기포를 피하십시오.
  6. 샘플을 실행하고 실험 실행 탭에서 실행 단추를 클릭합니다. 실험 정보와 실험 설정을 보여주는 왼쪽의 창을 관찰하십시오. 리간드와 단백질 농도를 [Syr]에서 150μM, [Cell]에서 15μM, 온도에서 25°C로 입력합니다.
  7. 소프트웨어에서 시작을 클릭하여 주입 프로세스를 수행하고 단백질-리간드 상호 작용이 완료될 때까지 1.4시간 동안 기다립니다.
    참고: 희미한 분석 버튼이 소프트웨어 창 아래에 나타납니다.
  8. 주입이 완료된 후 분석 버튼이 밝아지는 것을 관찰하십시오. 제어 소프트웨어에서 분석 버튼을 클릭하면 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 분석 할 수 있습니다. 개요를 클릭하여 원시 데이터를 표시하고 피팅 모델을 결합 사이트의 한 세트로 선택합니다.
  9. 바인딩 상태에 실험 데이터(바인딩, 바인딩 없음, 제어 또는 검사 데이터)가 표시되고 실험 값(KD, ΔG, ΔH, TΔS 및 N)이 소프트웨어 패널에 표시되는지 확인합니다.
  10. 수소 결합, 반 데르 발스 결합 및 소수성 상호 작용을 포함한 상호 작용 결합을 예측하는 열역학적 매개 변수를 tif 또는 jpeg 형식으로 내보냅니다.
  11. 실험이 완료된 후 단계 7.4에 따라 샘플 셀을 세척합니다.

8. 통계 분석

  1. 모든 실험을 세 번의 독립 반복실험(n = 3)으로 수행합니다.
  2. 실험 데이터를 SD± 수단으로 제시하고, 원하는 통계 분석 소프트웨어를 이용하여 통계 분석을 수행한다.
  3. 양측 비쌍체 연구생 t-검정을 사용하여 두 평균값을 비교하거나 Dunnett을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 적용하여 여러 값을 대조군 값과 다중 비교합니다. 유의 수준을 p ≤ 0.05로 설정합니다.

결과

특히 imHC의 분화 단계에서 이핵 세포와 다각형 형태 (그림 1)를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다 (그림 1A). NTCP 발현의 큰 증가는 d-HepaRG 및 d-imHC에서 각각 7배 및 40배로 측정되었습니다(그림 1B). HBV 진입에 대한 감수성을 부여하는 것으로 가정 된 NTCP의 고도로 글리코 실화 된 형태는 d-HepaRG보다 d-imHC에서 더 많이 검출되었다 (...

토론

HBV 감염은 간세포25 상의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPGs)에 대한 낮은 친화도 결합을 통해 시작되고, 이어서 엔도 사이토 시스26을 통한 후속 내재화와 함께 NTCP에 결합한다. NTCP는 HBV 진입에 중요한 수용체이기 때문에 HBV 진입을 표적으로 하는 것은 임상적으로 번역되어 de novo 감염, 모자 간 전염(MTCT) 및 간 이식 후 재발을 감소시킬 수 있습니다. ?...

공개

저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구 프로젝트는 Mahidol University와 태국 과학 연구 및 혁신 (TSRI)이 A. Wongkajornsilp 및 K. Sa-ngiamsuntorn에게 별도로 수여합니다. 이 작업은 경쟁력을위한 프로그램 관리 단위 (보조금 번호 C10F630093)를 통해 국가 고등 교육 과학 연구 및 혁신 정책위원회 사무국에서 재정적으로 지원했습니다. A. Wongkajornsilp는 Mahidol University의 Faculty of Medicine Siriraj Hospital의 Chalermprakiat 보조금을 받았습니다. 저자는 ITC 기술에 대한 그녀의 도움에 대해 Sawinee Seemakhan (Mahidol University 과학 학부 약물 발견 우수 센터)에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell lines
HepaRG Cells, CryopreservedThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell LineMerckSCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer SolutionFUJIFLIM Wako chemical163-20145
BD Perm/Wash bufferBD Biosciences554723Perm/Wash buffer
Cyclosporin Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 disulfate saltMerck108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kitsGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation KitGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription SystemPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X ConcentratorTakara bioPT4421-2concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrateMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
Nucleospin DNA extraction kitmacherey-nagel1806/003
Phosphate buffered salineMerckP3813
Polyethylene glycol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Recombinant NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibodyAbcamab1310841:100 dilution
    Anti-GAPDH antibodyThermo Fisher ScientificAM43001:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibodyAbcamab2057181:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibodyAbcamab970231:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     Sodium azideSigma199931Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12Gibco12400-024
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E mediumSigma AldrichW4125-1L
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
      5 µg/mL  InsulinSigma Aldrich91077C-100MG
      50 µM hydrocotisoneSigma AldrichH0888-1g
     2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBSGibco21300-058
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     0.2% Triton X-100SigmaT8787Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer SolutionMerck20-188Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific78425Final concentration: 1X
       Na3VO4Final concentration: 1 mM
       PMSFFinal concentration: 1 mM
       NaFFinal concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     Tween 20Merck9005-64-5
     1x TBST0.1% Tween 20
     1x PBSGibco21300-058
     Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA53225
     Polyacrylamide gelBio-Rad161-0183
     Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad161-0700Final concentration: 0.05%
    TEMEDBio-Rad161-0800Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk)Bio-Rad170-6404Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG889814.4 g
     SDSMerck7910Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG88987.2 g
     MethanolMerck106009100 mL
Mild stripping solution 1 LAdjust pH to 2.2
    GlycineSigmaG889815 g
     SDSMerck79101 g
     Tween 20Merck9005-64-510 mL
Equipments
15 mL centrifuge tubeCorning430052
50 mL centrifuge tubeCorning430291
Airstream Class IIEsco2010621Biological safety cabinet
CelCulture CO2 IncubatorEsco2170002Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR DetectorBio-Rad1855196
FACSVerse Flow CytometerBD Biosciences651154
Graduated pipettes (10 mL)Jet BiofilGSP010010
Graduated pipettes (5 mL)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernIsothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paperBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
Pipette controllerEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Power supply
PVDF membraneMerckIPVH00010
T-75 cell culture flaskCorning431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad1703940Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated CentrifugeEscoT1000RCentrifuge with swinging bucket rotar

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