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요약

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

초록

방광암은 특히 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)에서 과소 연구 된 영역입니다. 조직 특이적 Cre 및 loxP 부위를 갖는 교배 GEMMs는 조건부 또는 유도성 유전자 표적화를 위한 황금 표준이었다. 보다 빠르고 효율적인 실험 모델을 제공하기 위해, 종양 억제제 Trp53, Pten 및 Rb1의 다중 loxP 대립 유전자를 운반하는 아데노바이러스 Cre 및 정상 비뇨생식기 세포를 사용하여 생체외 오가노이드 배양 시스템이 개발된다. 정상적인 비뇨생식기 세포는 삼중 플록스 마우스의 네 개의 방광으로부터 효소적으로 분리된다(Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). 비뇨생식기 세포는 CMV 프로모터(Ad5CMVCre)에 의해 구동되는 아데노바이러스-Cre로 생체외로 형질도입된다. 형질도입된 방광 오가노이드는 배양되고, 전파되고, 시험관내 및 생체내에서 특성화된다. PCR은 Trp53, Pten 및 Rb1에서 유전자 결실을 확인하는 데 사용됩니다. 오가노이드의 면역형광(IF) 염색은 비뇨생식기 계통 마커(CK5 및 p63)의 양성 발현을 입증한다. 오가노이드는 종양 확장 및 연속 통과를 위해 숙주 마우스에 피하 주사된다. 이종이식편의 면역조직화학(IHC)은 CK7, CK5 및 p63의 양성 발현 및 CK8 및 우로플라킨 3의 음성 발현을 나타낸다. 요약하면, loxP 부위로 조작된 마우스 비뇨생식기 세포로부터의 아데노바이러스-매개 유전자 결실은 정의된 유전적 변경의 종양원성 잠재력을 신속하게 시험하는 효율적인 방법이다.

서문

방광암은 남성에서 네 번째로 흔한 암이며 미국에서 매년 80,000 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 백금 기반 화학 요법은 삼십 년 이상 진행성 방광암 환자를위한 치료의 표준이었습니다. 방광암 치료의 풍경은 최근 FDA (Food and Drug Administration)의 면역 요법 (항 PD-1 및 항 PD-L1 면역 체크포인트 억제제), 에르다 피티닙 (섬유 아세포 성장 인자 수용체 억제제) 및 엔포르투맙 베도틴 (항체 - 약물 접합체)2,3,4의 승인으로 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 화학요법 또는 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 승인된 바이오마커는 이용가능하지 않다. 방광암 진행을 유도하는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 다양한 치료 양식에 대한 예측 바이오마커를 개발할 수 있는 유익한 전임상 모델을 생성해야 할 절실한 필요성이 있습니다.

방광 번역 연구의 주요 장애물은 인간 방광암 발병기전과 치료 반응 5,6을 재검토하는 전임상 모델의 부족이다. 시험관내 2D 모델(세포주 또는 조건부로 재프로그램된 세포), 시험관내 3D 모델(오가노이드, 3D 프린팅) 및 생체내 모델(이종이식편, 발암물질-유도, 유전자 조작 모델 및 환자 유래 이종이식편)2,6을 포함하는 다수의 전임상 모델이 개발되었다. 유전자 조작된 마우스 모델(GEMMs)은 종양 표현형의 분석, 후보 유전자 및/또는 신호전달 경로의 기계론적 조사, 치료 반응의 전임상 평가6,7을 포함하여 방광암 생물학의 많은 응용에 유용하다. GEMMs는 하나 이상의 종양 억제 유전자에서 유전적 결실을 조절하기 위해 부위-특이적 재조합효소(Cre-loxP)를 이용할 수 있다. 여러 유전자 결실로 원하는 GEMM을 생성하는 과정은 시간이 많이 걸리고 힘들고 비용이 많이 듭니다5. 이 방법의 전반적인 목표는 삼중 플록스 대립 유전자 (Trp53, Pten, 및 Rb1)8을 운반하는 정상 마우스 비뇨 생식기 세포로부터 방광 삼중 녹아웃 (TKO) 모델을 확립하기위한 생체외 Cre 전달의 신속하고 효율적인 방법을 개발하는 것입니다. 생체 외 방법의 가장 큰 장점은 빠른 워크 플로 (수년간의 마우스 번식 대신 1-2 주)입니다. 이 글에서는 플록스 대립유전자, 생체외 아데노바이러스 형질도입, 오가노이드 배양, 면역적격 C57 BL/6J 마우스에서의 시험관내 및 생체내 특성화를 갖는 정상 비뇨생식기 세포를 수확하기 위한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 플록스 대립 유전자의 임의의 조합을 보유하는 면역적격 마우스에서 임상적으로 관련된 방광암 오가노이드를 생성하는데 추가로 사용될 수 있다.

프로토콜

모든 동물 절차는 뉴욕 버팔로의 Roswell Park Comprehensive Cancer Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (1395M, Biosafety 180501 및 180502)의 승인을 받았습니다.
참고: 같은 날에 1-3단계를 수행하십시오.

1. 마우스 방광의 해부

  1. 해부 준비
    1. 가위, 포셉, 멸균 DPBS를 포함한 모든 멸균 기구를 35mm 배양 접시, 70% 에탄올, 멸균 거즈 및 깨끗한 종이 타월에 준비하십시오. 해부 영역의 모든 표면을 청소하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 수컷 삼중 플록스 마우스 Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1f/f (4마리 마우스, 10주령)를 생성한다.
  2. 안락사와 절개
    1. 마우스를CO2 질식에 의해 2.0 L/min 유속을 사용하여 안락사시키고, 이어서 자궁경부 탈구를 가한다. 해부 부위를 70 % 에탄올로 청소하고 깨끗한 종이 타월로 덮으십시오.
    2. 마우스를 해부 부위의 거즈 위에 놓습니다. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 해부 가위를 사용하여 방광을 노출시키는 중간 선 복부 절개를 만듭니다.
  3. 방광 해부
    1. 포셉을 사용하여 방광을 잡고 부드럽게 당겨서 양측 요관 접합부가 확인되도록하십시오. 가위를 사용하여 두 요관 개구부 사이의 경계선을 따라 방광 안저부를 제거하십시오.
    2. 방광을 DPBS 2mL의 멸균 접시에 옮깁니다. 지방과 결합 조직을 제거하고 방광을 멸균 된 DPBS 2 mL로 새 접시에 넣으십시오. 이때 아데노바이러스를 -80°C에서 꺼내어 얼음 위에 보관한다.

2. 비뇨생식기 세포의 해리

  1. 세포 해리를 위한 제조
    1. 포셉, 수술용 메스(손잡이가 달린 10개의 칼날), 35mm 배양 접시에 멸균 DPBS, CCM(-)으로 정의된 숯이 벗겨진 FBS가 없는 완전한 배양 배지, 콜라게나제/히알루로니다제 혼합물, 트립신 대체용 재조합 효소, 10μM 신선한 Y-27632가 있는 DPBS의 10% 숯 제거 FBS, 100μm 멸균 세포 스트레이너 및 15mL 원심분리 튜브를 포함한 모든 멸균 기구를 준비하십시오.
      참고: 완전 배양 배지(CCM)는 제공된 성장 인자 및 5% 숯 제거 FBS, 1% L-글루타민 대체물, 100μg/mL 프리모신 및 10μM 신선한 Y-27632로 보충된 유방 상피 세포 성장 배지로 구성됩니다.
  2. 방광을 다듬고 소화하는 것
    1. 방광을 옮기고 다시 2 mL의 멸균 DPBS로 생물 안전 캐비닛의 35mm 접시에 씻으십시오.
    2. 네 마리의 생쥐로부터 방광 조직을 1mL의 CCM(-)이 있는 접시에 모으고 수술용 블레이드를 사용하여 각 방광을 네 개의 동일한 조각으로 다듬습니다. 포셉을 사용하여 방광을 펼쳐 요로텔륨 표면을 매체에 노출시킵니다.
    3. 방광 조각과 배지를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 접시를 2 mL의 CCM(-) 2x로 세척하고 원심분리 튜브에서 총 부피 5 mL로 수집한다.
    4. 콜라게나제/히알루로니다아제 혼합물을 최종 농도 300 U/mL 콜라게나제 및 100 U/mL 히알루로니다아제에 첨가하고, 튜브를 37°C 오비탈 인큐베이팅 진탕기에 수평으로 놓고 200 rpm에서 30분 동안 진탕기에서 30분 동안 보관한다.
    5. 조직 소화 후, DPBS에 10% 숯이 벗겨진 FBS의 동량(5 mL)을 튜브에 첨가하고, 튜브를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
    6. 상층액을 제거하고 버립니다. 트립신 대체물 2 mL를 세포 펠릿에 넣고 잘 섞는다. 튜브를 4분 동안 37°C 및 5%CO2 에서 세포 인큐베이터에 넣었다.
    7. 인큐베이션 후, 표준 P1000 팁으로 10x 위아래로 피펫을 켭니다. DPBS에 10% 숯을 제거한 FBS 5mL를 첨가합니다.
    8. 분리된 세포를 100 μm 멸균 세포 스트레이너를 통해 변형시킨다. 세포 현탁액을 수집하고 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
  3. 셀 계수 및 재현탁
    1. 상층액을 제거하고 버립니다. 세포 펠릿을 1 mL의 CCM으로 재현탁시킨다.
    2. 혈구세포계를 사용하여 세포 수를 계수하고, 단지 0.5 x 106 세포를 0.5 mL의 신선한 CCM이 있는 24-웰 플레이트의 웰에 넣는다. 이때, 엥겔브레스-홀름-스웜 마우스 육종 세포의 매트릭스 추출물( 물질표 참조)을 꺼내어 -20°C에서 보관하고 얼음 위에서 해동시킨다. 6-웰 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에서 예열한다.
      참고: 나머지 세포는 원심분리 및 비바이러스 형질도입 조절을 위한 세포 펠릿으로서 동결될 수 있다.

3. 아데노바이러스 전달 및 도금 오가노이드

주의: 아데노바이러스를 처리할 때는 주의하시기 바랍니다. 실험실 직원은 생물 안전 수준 2 관행을 따르고 아데노 바이러스를 10 % 표백제로 소독해야합니다.

  1. 2μL의 아데노바이러스(Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL)를 24웰 플레이트에 넣습니다. 분리되지 않은 비뇨 생식기 세포와 잘 섞으십시오.
  2. 형질도입 효능을 향상시키려면, 24-웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 스핀오케이션을 수행한다. 24-웰 플레이트를 1시간 동안 37°C 및 5%CO2 의 세포 인큐베이터에 놓는다.
  3. 세포 및 배지를 웰로부터 15 mL 튜브로 옮기고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 버리고, 50 μL의 CCM을 추가하고, 하단의 세포와 잘 섞는다.
  4. 140 μL의 매트릭스 추출물을 첨가하고 기포를 피하기 위해 부드럽게 잘 섞으십시오. 용액을 50μL/돔에서 미리 예열된 6웰 플레이트에 빠르게 넣어 오가노이드용 돔을 만듭니다.
  5. 플레이트를 5%CO2 가 있는 37°C 인큐베이터로 부드럽게 옮기고 돔이 5분 동안 응고되도록 한다. 6웰 플레이트를 거꾸로 뒤집고 추가 25분 동안 응고를 계속합니다.
  6. 배양 후, 2.5 mL의 CCM을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오가노이드 배양을 위한 인큐베이터에 놓는다.

4. 오가노이드 배양 및 패시징

  1. 3-4 일마다 배지를 교체하십시오. Lee et al.9에 보고된 바와 같이 오가노이드 배양, 통과 및 동결을 수행한다. Fujii et al.10에 기재된 바와 같이 시편 처리 겔을 사용하여 오가노이드의 임베딩을 수행한다.
  2. 배지를 제거하고 각 웰에 디스파제 1mL를 첨가한다. 부드럽게 돔을 부수고 P1000 피펫 팁과 잘 섞으십시오.
  3. 플레이트를 30분 동안 5%CO2 가 있는 37°C 인큐베이터에 놓는다. 이어서, 모든 세포를 15 mL 원심분리 튜브에 수집하고, DPBS 중의 10% 숯-벗겨진 FBS 4 mL로 웰을 세척하였다. 오가노이드 세포가 큰 군집으로 나타나면 2.2.6단계를 수행하십시오. 및 2.2.7 단계. 연결이 끊어진 세포를 얻습니다.
  4. 튜브를 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 1 mL의 CCM으로 세척한다.
  5. 세포를 70% 매트릭스 추출물에 재현탁시키고 단계 3.4.-3.6을 따른다. 배양을 위해. 대안적으로, 90% 숯 벗겨진 FBS 및 10 μM 신선한 Y-27632로 보충된 10% DMSO에서 재현탁함으로써 세포를 동결보존한다.

5. C57BL/6J 마우스에 피하 이식 오가노이드 세포

  1. 이식 준비
    1. 바늘에 25G 1.5, 1 mL 주사기, 1 mg/mL 디스파제, 매트릭스 추출물, 10 μM 신선한 Y-27632 및 15 mL 원심분리 튜브로 DPBS에 10% 숯을 벗긴 FBS를 준비하십시오.
  2. 오가노이드 세포 수집
    1. 적어도 5 계대 동안 안정한 배양을 달성한 후, 생체내 주사를 위해 확장된 오가노이드 세포를 수집한다. 단계 4.2.-4.4를 따르십시오. 세포를 1 mL의 CCM에 재현탁시킨다.
  3. 세포 계수 및 피하 주사
    1. 혈구세포계를 사용하여 세포 수를 계산하십시오. 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 2 x 106 세포를 DPBS의 50% 매트릭스 추출물 100 μL에 재현탁시켰다. 서스펜션을 얼음 위에 놓고 동물 시술실의 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오.
    2. 2마리의 수컷 C57BL/6J 마우스(10주령)를 4% 이소플루란과 1L/minO2 흐름으로 챔버 내에서 약 4분 동안 마취시킨다. 마우스가 오른쪽 반사를 잃고 호흡 패턴이 더 깊고 느려지면 마우스를 2 % 이소플루란과 1 L /min O2 흐름으로 비 재호흡 회로로 옮깁니다. 외상성 부상으로부터 동물의 눈을 보호하기 위해 수의사 연고를 바르십시오.
    3. 마우스의 오른쪽 옆구리에서 주사 부위 주변의 한 영역을 면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 클렌징 한 다음 25G 바늘을 사용하여 마취하에 오른쪽 측면에 100 μL 세포 현탁액을 직접 주입하십시오.
    4. 주사 후, 흡입 마취를 제거하고 마우스를 열 램프 아래의 케이지에 넣고 완전히 동원 할 때까지 가열합니다. 마우스를 하우징으로 돌려 보내고 종양 형성을 모니터링하십시오.

6. 종양 수집 및 생체내 전파

  1. 준비 단계 2.1.1을 따르십시오. 마우스를CO2 질식에 의해 2.0 L/min 유속을 사용하여 안락사시킨 다음, ~2.0 cm 직경의 종양(거의 2-3주)이 형성된 후 자궁경부 탈구가 뒤따른다. 마우스를 깨끗한 해부 영역으로 옮기고 마우스 옆구리 종양 부위에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 해부 가위와 포셉을 사용하여 종양을 분리하기 위해 절개를하십시오.
  2. 종양을 DPBS 5mL로 60mm 접시에 씻고 가위를 사용하여 결합 조직을 제거하십시오. 신선한 종양의 한 조각을 자르고 48 시간 동안 DPBS에 4 % 파라포름 알데히드로 가라 앉히고 조직학 분석을 위해 파라핀 임베딩 및 절편을 위해 보냅니다.
  3. 세포 분리를 위해 신선한 종양의 나머지 절반을 처리한다. 간단히 말해서, 신선한 종양을 1mm3 조각으로 다듬어 5 mL의 CCM(-)이 있는 60 mm 접시에서 해리시킨다. 이어서, 단계 2.2.4.-2.2.8.에 이어서, 분리된 세포를 새로운 C57BL/6J 마우스에 주입하여 단계 5.3 에 이어 생체내 패시징한다. 또는 단계 3.4.-3.6. 에 따라 시험관내 오가노이드 배양물로서 유지하거나, 10 μM 신선한 Y-27632로 90% 숯 벗겨진 FBS 및 10% DMSO를 사용하여 액체 질소에서 직접 동결시킨다.
  4. 필요한 경우, 동결된 세포를 37°C 수조에서 빠르게 해동하고 CCM(-)으로 세척하여 회수한다. 그 후, 이를 DPBS의 50% 매트릭스 추출물 100 μL에 재현탁시켜 생체내 종양 형성을 위해 마우스에 직접 주사한다. 하나 생체내 주사를 위해 적어도 2 x 106 해동된 세포를 사용한다.

결과

마우스 비뇨생식기 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 워크플로우를 도 1A에 나타내었다. 수반되는 비디오는 비뇨생식기 세포가 방광의 안저로부터 어떻게 분리되는지, 그리고 삼중 플록싱된 세포가 Ad5CMVCre로 생체외 에서 어떻게 형질도입되는지를 보여준다. 도 1A는 효소 소화 후 최소 점막하 및 근육 세포가 분리되었음을 보여주?...

토론

GEMM은 정상 세포에서 시작된 암 모델링의 황금 표준이었으며, 잠재적 인 종양원성 교란 (종양 유전자 활성화 및 / 또는 종양 억제제의 손실)의 결과를 엄격하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 관심 유전자에 플록스된 대립유전자를 운반하는 정상 마우스 비뇨생식기 세포의 생체외 유전자 편집을 통해 방광암 오가노이드를 생성시키기 위한 신속하고 효율적인 프로토콜이 제공된다. H&E 및 IH...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구 작업은 NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 및 R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation 및 Friends of Urology Foundation이 부분적으로 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Marisa Blask와 Mila Pakhomova에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 μm sterile cell strainerCorning431752
1 mL syringeBD309659
25G 1.5 inches needleEXELINT International26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)UI Viral Vector CoreVVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6JJackson Lab000664
Charcoal-stripped FBSGibcoA3382101
Collagenase/hyaluronidaseStemcell Technologies07912
DispaseStemcell Technologies07913
DPBS, 1xCorning21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)Gibco35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth mediumLonzaCC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)CorningCB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20DAKOM7019IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7Santa Cruz BiotechnologySC-23876IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63Abcamab735IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3Fitzgerald10R-U103AIHC 1:50
Monoclonal mouse anti-VimentinSanta Cruz BiotechnologySC-6260IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-I-sIF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubatorThermo Fisher51033557
Polyclonal chicken anti-CK5Biolegend905901IF 1:500
PrimocinInvivoGenant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)Thermo Fisher12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575VWR35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)Thermo FisherHG-4000-012
Surgical blade size 10Integra Miltex4-110
Sorvall Legend RTThermo Fisher75004377
Sorvall T1 centrifugeThermo Fisher75002383
Y-27632SelleckchemS1049

참고문헌

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