태아 조직 유래 장내 투과성 테스트

요약

이 프로토콜은 태아의 장 조직에서 3 차원 장 모델 인 enteroids의 확립을 자세히 설명합니다. 상피 바이오마커의 면역형광 영상화를 모델 특성화에 사용하였다. 박테리아 내독소인 리포폴리사카라이드의 정점 노출은 미세주입 기술을 사용하여 형광 덱스트란의 누출에 의해 측정된 용량 의존적 방식으로 상피 투과성을 유도하였다.

초록

인간 태아 조직 유래 엔테로이드는 미숙아의 장 손상을 연구하기 위한 유망한 시험관 내 모델로 부상하고 있습니다. 엔테로이드는 정점 경계가있는 루멘, 단단한 접합부 및 성장 매체에 노출 된 기저 측 외층으로 구성된 극성을 나타냅니다. 장 손상의 결과에는 점막 염증과 투과성 증가가 포함됩니다. 취약한 조산사 피험자에서 장 투과성을 테스트하는 것은 종종 실현 가능하지 않습니다. 따라서 미숙아의 장 손상을 연구하기 위해서는 체외 태아 조직 유래 장 모델이 필요합니다. 엔테로이드는 단단한 접합 단백질에 의해 조절되는 상피 투과성의 변화를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 장내 줄기 세포는 모든 상피 세포 유형으로 분화되어 마우스 육종 세포가 분비하는 기저막 매트릭스에 3 차원 구조를 형성합니다. 이 기사에서는 태아 장 조직에서 엔테로이드를 확립하고, 면역 형광 영상으로 장내 팽대 접합 단백질을 특성화하고, 상피 투과성을 테스트하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 그람 음성 우성 세균성 dysbiosis는 장 손상의 알려진 위험 요소이므로 그람 음성 박테리아에 의해 생성되는 내독소인 지질다당류(LPS)를 사용하여 장내 투과성을 유도했습니다. 플루오레세인-표지된 덱스트란을 장내강에 미세주입하고, 배양 배지로 유출된 연속 덱스트란 농도를 측정하여 세포내 투과성의 변화를 정량화하였다. 실험은 LPS에 대한 정점 노출이 농도 의존적 방식으로 상피 투과성을 유도한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 발견은 그람 음성의 우성 dysbiosis가 미숙아의 장 손상 메커니즘에 기여한다는 가설을 뒷받침합니다.

서문

미숙아는 빈번하고 장기간의 염증에 노출되어 장 손상의 위험이 증가하여 장기적인 장애^{또는 사망을} 초래합니다1. 이 분야의 연구는 취약한 미숙아에 대한 실험을 수행 할 수있는 제한된 능력으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 또한, 적합한 모델의 부족은 조기 장 환경에 대한 포괄적 인 연구를 방해했다². 기존의 시험관 내 및 생체 내 모델은 조기 인간의 장 환경을 포괄적으로 나타내지 못했습니다. 구체적으로, 단일 상피 태아 세포주는 단단한 접합부를 형성하지 않을 수 있으며, 동물 모델은 인간 미숙아와 상이한 염증 및 면역학적 반응을 나타낸다. 장내 크립토 줄기 세포와 새로운 Lgr5⁺ 조직 줄기 세포의 증식 및 분화의 주요 경로인 Wnt 신호 전달의 발견으로 엔테로이드 및 콜로노이드와 같은 장 조직 유래 오가노이드가 시험관 내 모델 ^3,4,5로 확립되었습니다. 이 기술을 사용하면 장 환경에 대한 상피 반응을 연구하기 위해 전체 조직 또는 장의 생검에서 개발 된 3 차원 (3D) 장용 모델을 만들고 활용할 수 있습니다 ^6,7.

배양에서 성장한 전형적인 장 세포주와는 달리, 엔테로이드는 단단한 접합 단백질⁸에 의해 연결된 내강과 극성을 나타낸다. 이것은 성장 배지의 기저 측 경계에 노출 될뿐만 아니라 정점 경계를 평가하기위한 내강 미세 주입을 허용합니다. 또한, 엔테로이드는 인간 상피 ^9,10과 유사한 유전적, 생리적, 면역학적 특성을 나타낸다. 태아 조직 유래 엔테로이드는 상피 기능에 대한 미숙아의 역할을 검사 할 수 있습니다. 엔테로이드의 독특한 특성은 조기 장 환경과 더 유사 할 수 있습니다⁹. 조직 유래 엔테로이드는 단층 형태 또는 응고된 기저막 단백질 혼합물에 내장된 3D 구조로 단단한 접합 무결성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 정점 노출이 필요한 경우 후자의 형태에 미세 주입 기술이 필요합니다. 엔테로이드 모델에서 상피 반응의 측정에는 RNA 시퀀싱에 의한 유전자 발현, 효소 결합 면역 분석(ELISA)에 의한 바이오마커 또는 고급 이미징 기술이 포함됩니다. 여기에 제시된 기술은 형광 측정법으로 총 투과성을 측정하기위한 또 다른 실행 가능한 옵션을 제공합니다.

미숙아의 장 손상은 장내 미생물 군집의 불균형을 포함하는 다인성 병인을 가지고 있습니다. Enteroids는 상피 기능을 수반하는 괴사 성 장염과 같은 조기 장 질환의 특정 측면을 연구하기위한 우수한 모델을 제공 할 수 있습니다¹¹. 엔테로이드는 인간 태아 장(¹⁰)과 유사한 특성을 나타낸다. 기저측 노출로 배양 배지에서 그람 음성 박테리아에 의해 생성되는 내독소인 지질다당류(LPS)에 엔테로이드를 노출하면 염증 및 장^{투과성을 증가시킬} 수 있는 유전자 발현이 유도됩니다7. 이 연구는 LPS와 같은 박테리아 제품에 정점 노출 후 총 상피 투과성의 변화를 평가하는 것을 목표로합니다. 결과는 장 손상의 발병 기전에 관여하는 미생물-상피 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 총 투과성을 테스트하도록 설계된 방법에는 미세 주입 설정과 기술이 필요합니다.

프로토콜

인체 조직 수집은 워싱턴 대학교 기관 검토 위원회(연구 ID: STUDY380 및 CR ID: CR3603)의 승인을 받았으며 선천적 결함 연구소에서 수행되었습니다. 선천적 결함 연구소는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소의 NIH 상 번호 5R24HD000836의 지원을 받았습니다. 표본은 동의한 참가자로부터 수집되어 건강 정보 없이 익명화된 것으로 보내졌습니다. 소장 표본은 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 보관하고 밤새 수령 실험실로 우편으로 보냈습니다.

1. 시약 준비

참고: 시약 및 카탈로그 번호 목록은 재료 표를 참조하십시오. 권장 용량은 달리 언급되지 않는 한 6웰 플레이트용입니다.

1. 50 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 50 mg의 BSA 분말을 100 μg/mL의 광범위 항생제 프리모신과 용해시켜 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비하여 조직 또는 장내 장구와 접촉하는 모든 플라스틱 제품 및 팁을 코팅합니다.
   1. BSA로 코팅하려면 여과되지 않은 피펫 팁을 팁을 덮기에 충분한 BSA가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣거나, 페트리 접시 표면을 덮기 위해 1-2mL의 BSA를 추가하거나, 사용하기 전에 실온에서 최소 20-30분 동안 BSA로 15mL 원뿔형 튜브를 채웁니다.
2. 50mL의 DPBS를 100μg/mL 프리모신 및 50μg/mL 겐타마이신과 혼합하여 DPBS 배지를 준비합니다. 이 배지는 2.5 μg/mL 암포테리신의 유무에 관계없이 준비합니다.
3. 2mL의 오가노이드 성장 배지, 100μg/mL 프리모신, 10μM Y27632 및 2.5μM CHIR99021을 혼합하여 장내 성장 배지를 준비합니다. 매일 신선한 배지를 만들고 37 ° C의 세포 배양 인큐베이터에서 따뜻하게합니다.
   참고: Y27632의 희석 계수는 1:250입니다. CHIR99021의 경우 CHIR 저장 용액을 따뜻한 배지에서 1:100으로 희석한 다음 장내 성장 배지에서 1:40으로 희석하여 1:4000 희석을 달성합니다.
4. 스톡 기저막 매트릭스 10 μM Y27632 및 2.5 μM CHIR99021을 첨가하여 기저막 매트릭스 믹스를 준비한다. 6웰 플레이트의 한 웰에 대해 8mg/mL 단백질 농도로 총 285μL의 최종 기저막 매트릭스 혼합물을 만듭니다.
   알림: 기저막 매트릭스는 액체 형태를 유지하기 위해 얼음처럼 차가워야 하며 더 따뜻한 온도에서 응고됩니다. 스톡 기저막 매트릭스의 단백질 농도는 다음 방정식을 사용하여 8mg/mL 최종 단백질 농도를 만드는 데 필요한 부피를 결정합니다.
   부피 1 × 농도 1 = 부피 2 × 농도 2
5. PBS의 32% 스톡 PFA를 1:8로 희석하여 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하고 실온에서 보관합니다. 고정할 엔터로이드의 각 웰에 대해 0.5mL를 만드십시오.
6. PBS에 5% 염소 혈청과 0.5% 트리톤 X-100을 첨가하여 블로킹 완충액을 준비합니다. 웰당 첫 번째 항체에 대해 1mL를 준비하고 웰당 추가 항체에 대해 0.5mL를 준비합니다.
   참고: 2차 항체의 숙주와 동일한 종의 혈청을 사용하십시오.
7. 각 항체에 대해 제조업체가 권장하는 농도로 차단 완충액에 희석 된 1 차 및 2 차 항체를 준비하십시오.
8. PBS의 1 mg / mL 스톡 용액에서 1 : 200으로 희석하여 5 μg / mL Dmidino-2- 페닐 인돌 (DAPI)을 준비하십시오. 염색 된 엔터 로이드의 웰 당 0.5mL를 만드십시오.
9. PBS에 70% 글리세롤을 준비하고 현미경 슬라이드에 엔테로이드를 장착하기 위해 0.5mL를 만듭니다.
10. PBS에서 25mg/mL 스톡 용액을 1:5 비율로 희석하여 5mg/mL 덱스트란-FITC(플루오레세인-이소티오시아네이트)를 준비합니다. 미세 주입을 위해 20 μL를 만드십시오.
11. PBS에서 LPS 분말을 5mg/mL 스톡 용액으로 재구성하여 지질다당류(LPS) 및 덱스트란-FITC를 제조합니다. PBS 중 LPS 및 덱스트란의 스톡 용액을 0.1 mg/mL 및 0.5 mg/mL LPS 및 5 mg/mL 덱스트란-FITC로 희석합니다. 미세 주입을 위해 20 μL를 만드십시오.
12. EGTA 분말을 증류수에 녹여 0.2M의 원액을 만들고 염산(HCl)을 사용하여 pH를 약 8로 조정하여 에틸렌글리콜비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)을 제조한다. 1:100 희석을 수행하여 배양 배지에 2 mM의 시험 농도를 준비한다.

2. 검체 채취

1. 샘플이 수신되면 샘플 수집 후 24시간 이내에 상피 세포 분리 및 도금을 수행합니다.

3. 전체 표본의 기저막 매트릭스의 장 상피 세포 도금

참고 :이 절차는 미시간 대학교^12,13,14의 번역 조직 모델링 실험실에서 수정 된 프로토콜을 따릅니다. Wnt 인자 중 성장 배지를 사용하면 장내 형성에 대해 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 엔테로이드가 설정되면 Wnt 계수가 높은 동일한 매체를 사용하여 엔테로이드를 미세 주입을 위해 구형으로 구동합니다.

1. 장 부분을 암포테리신이 함유된 얼음처럼 차가운 DPBS가 있는 60mm x 15mm 페트리 접시에 옮기고 얼음에 20분 동안 담근다. 조직이 흡수되는 동안 소장의 영역 (십이지장, 공장 또는 회장)을 확인하고 집게와 가위로 결합 조직과 혈관을 제거하십시오. 상피를 방해하지 않고 작은 23-25G 바늘과 3mL 주사기를 사용하여 필요에 따라 루멘 함량을 씻어냅니다.
2. 메스를 사용하여 장 세그먼트를 3-5mm 조각으로 자르고 얼음에 0.5-1mL의 오가노이드 성장 배지가 들어있는 35mm x 15mm 페트리 접시에 1-2 개 (6 웰 플레이트의 한 웰에 도금 용)를 놓습니다.
3. 해부 마이크로 가위와 집게를 사용하여 장 튜브를 세로로 자릅니다. 집게 팁을 사용하여 10x 실체 현미경으로 근막에서 상피 세포를 긁어냅니다. 근막을 제거하고 접시를 소용돌이 치면 세포 덩어리가 부서집니다.
4. 20μL 피펫 절단 팁을 사용하여 5-10μL 단위로 세포와 배지를 기저막 매트릭스 믹스로 옮겨 8mg/mL 매트릭스 단백질 농도에서 285μL 용액을 만듭니다. 200μL 절단 팁을 사용하여 얼음 위의 기저막 매트릭스에서 세포를 혼합하기 위해 천천히 위아래로 피펫합니다.
5. 5개의 50μL 스트립의 세포 기저막 매트릭스 믹스를 따뜻한 발포 벽돌 위에 보관된 예열된 6-웰 플레이트의 한 웰에 놓습니다. 플레이트를 37°C 및 5%_CO2 의 세포 배양 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션하여 기저막 매트릭스가 중합되고 경화되도록 한다.
6. 2mL의 장내 성장 배지를 응고된 기저막 매트릭스 스트립의 웰에 추가하고 세포 배양 인큐베이터 내부에 다시 넣습니다. 장내 성장을 촉진하기 위해 매일 배지를 교체하십시오. 매일 10x 도립 현미경으로 장 줄기 세포 분화를 확인하십시오.
7. 10-14일 후, 엔테로이드 밀도에 따라 엔테로이드를 12웰 또는 6웰 플레이트의 한 웰에 통과시킵니다. 격일로 미디어를 교체하기 시작하고 엔테로이드가 번성하기 시작하면 5-7일마다 1:2 비율로 통과하십시오.
   1. 계대 동안 기저막 매트릭스 층을 가진 장내로 분화하지 않는 세포를 제거하십시오. 필요한 경우 80% 성장 배지, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 냉동하여 통로가 낮은 냉동 엔테로이드 재고를 만듭니다.

4. 장내 면역형광염색

알림: 고정 및 염색 과정은 3 일이 걸립니다. 이 프로토콜에서는 변형된 프로토콜¹⁵를 사용하여 핵(DAPI), 상피 마커(융모, CDX2), 리소자임, 뮤신 및 단단한 접합 단백질(클라우딘 2, 클라우딘 3, 오클루딘, 조눌라 오클루덴-1)에 대해 고정 및 염색했습니다. 형광 이미지는 컨포칼 현미경으로 촬영하였다.

1. 설정
   알림: 이 과정은 일반적으로 장내 통과 또는 동결 절차와 동시에 수행됩니다.
   1. 엔터 로이드 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 성장 배지를 제거하고 차가운 DPBS로 2x 부드럽게 씻으십시오.
   2. 고정되고 염색 될 엔터 로이드를 확인하십시오. 200μL 절단 팁으로 조심스럽게 피펫팅하거나 1μL 접종 루프를 사용하여 12웰 플레이트로 옮깁니다. 다른 항체로 염색해야 하는 경우 엔테로이드를 별도의 웰에 놓습니다.
   3. 엔테로이드를 방해하지 않고 200μL 팁으로 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 0.5mL의 4% PFA를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 기저막 매트릭스에서 엔테로이드의 분리를 용이하게하기 위해 때때로 플레이트를 소용돌이 치십시오.
   4. 기저막 매트릭스에서 엔터 로이드의 분리를 결정하기 위해 총체적으로 검사하십시오. 엔테로이드를 방해하지 않고 액체 PFA를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오. PBS 3x로 세척하여 PFA 및 잔류 기저막 매트릭스를 제거합니다.
      알림: 실체 현미경으로 액체를 흡입하면 장형을 피하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고정 엔테로이드는 PBS에서 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 블로킹
   1. 엔테로이드를 방해하지 않고 200μL 피펫으로 잔류 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 0.5mL의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   2. 엔테로이드가 손상되지 않도록 주의하면서 200μL 피펫으로 블로킹 버퍼를 제거하고 폐기합니다.
3. 항체 염색
   1. 엔테로이드가 있는 각 웰에 블로킹 버퍼에 500μL의 1차 항체를 추가합니다. 1차 항체 및 리소자임의 경우 희석 계수는 1:100, CDX2의 경우 희석 계수는 1:100, 빌린의 경우 희석 계수는 1:50입니다. 4°C에서 밤새 배양합니다.
   2. 다음날, 항체 용액을 제거하고 PBS로 3x 세척한다. 각 세척에 대해 10-15분의 배양 시간을 허용합니다.
   3. 4.3.1.-4.3.2단계를 반복합니다. 희석 계수가 1:400인 2차 항체의 경우.
   4. PBS에 5μg/mL의 DAPI 500μL를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 PBS로 3회 세척하고 각 세척에 대해 10-15분의 배양 시간을 허용합니다.
4. 장착
   1. 가능한 한 많은 PBS를 제거하십시오. 염색 된 엔터 로이드를 70 % 글리세롤 1x로 씻으십시오.
   2. 1 μL 접종 루프 또는 절단된 200 μL 팁을 사용하여 플레이트에서 엔테로이드를 들어 올리고 70% 글리세롤로 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
   3. 엔터로이드의 3D 구조를 유지하려면 하단 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 0.5-1mm의 공간을 확보하십시오. 얇은 실리콘 고무 시트 또는 유리 커버 슬립의 컷 아웃을 사용하여 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 공간을 만듭니다. 엔테로이드는 이제 컨포칼 현미경으로 이미지화할 수 있습니다.

5. 장내 미세 주사 준비

참고 : 미세 주입 프로토콜은 리소스 및 설정에 맞게 Hill et ^al.16 에서 수정 된 프로토콜입니다. 일부 준비 단계는 며칠 전에 완료해야합니다.

1. 미세 주입 설정 설정
   1. 실험의 목적에 따라 다음과 같이 생물 안전 캐비닛 내부 또는 깨끗한 카운터에 마이크로 인젝터 장치를 설치하십시오 : 볼 수있는 실체 현미경, 현미경 옆의 무거운 스탠드에 장착 된 X-, Y 및 Z 축 제어 nob가있는 마이크로 매니퓰레이터, 마이크로 매니퓰레이터 암에 장착 된 마이크로 피펫 홀더, 마이크로 피펫 홀더와 3 방향 스톱 콕이있는 주사기를 연결하는 마이크로 인젝터 튜브, 그런 다음 공압 펌프와 펌프에 연결된 벽 공기 공급원에 연결합니다(그림 1).
   2. 실험 사용 전과 후에 70 % 에탄올로 미세 주입 장치를 소독하십시오. 마이크로피펫이 대상 표본에 도달할 수 있도록 축 손잡이를 이동하는 것을 포함하여 원하는 물리적 사양에 맞게 현미경과 마이크로 매니퓰레이터의 위치를 테스트합니다.
2. 마이크로 피펫의 제조
   참고: 다음 단계를 미리 수행하십시오.
   1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 마이크로피펫으로 당깁니다.
   2. 실체 현미경에서 마이크로피펫을 수평 마이크로피펫 홀더(그림 2)에 놓고 팁에 초점을 맞춘 다음 현미경 접안렌즈를 통해 보면서 마이크로 가위를 사용하여 팁을 자릅니다. 각 실험에 대해 비슷한 팁 크기로 약 10-15 개의 마이크로 피펫을 준비하십시오.
   3. 0.5-1 μL의 액체를 끌어 올려 팁 크기를 테스트하고 볼륨을 비우는 데 필요한 펌프 수를 세십시오. 여러 팁 크기를 테스트하여 실험에 적합한 크기를 찾습니다. 적절한 팁 크기는 펌프당 약 10-30nL 부피를 배출합니다.
   4. 절단된 유리 마이크로피펫을 팁을 손상시키지 않고 깨끗한 상자나 튜브에 보관하십시오.
      알림: 사전 절단 된 마이크로 피펫은 상업적으로 이용 가능합니다.
3. 장내 준비
   1. 대부분 크고 구형의 엔테로이드 접시를 얼음 위에 놓습니다. 오래된 성장 배지를 새 배지로 교체하십시오.
   2. 세포 리프터를 사용하여 플레이트에서 기저막 매트릭스 도트를 부드럽게 분리합니다. 얼음 위에서 젤 점을 좌우로 소용돌이 치면 엔터 로이드를 방해하지 않고 기저막 매트릭스가 분해됩니다.
   3. 실체 현미경으로 20μL 피펫 팁을 절단하여 약 10-15개의 구형 엔테로이드를 선택하고 기저막 매트릭스에 추가하여 285μL의 8mg/mL 단백질 농도 혼합물을 만듭니다.
   4. 절단된 200μL 팁으로 부드럽게 위아래로 피펫하여 엔테로이드를 깨뜨리지 않고 혼합합니다. 둥근 35mm x 10mm 세포 배양 페트리 접시 또는 유사한 치수의 접시 중앙에 5개의 50μL 젤 도트를 플레이팅합니다.
   5. 엔테로이드 겔 도트를 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하여 고형화시킨다. 그런 다음 접시에 신선한 성장 배지 1mL를 추가합니다. 안정화를 위해 그리고 엔테로이드가 0.5-1 μL의 적절한 크기에 도달할 때까지 최소 2-3일 동안 엔테로이드를 배양합니다.
      알림: 엔테로이드에 쉽게 접근할 수 있도록 벽이 낮은 접시와 적은 양의 성장 배지를 위해 작은 직경을 갖는 것이 중요합니다.
4. 덱스트란-FITC 및 시험된 물질의 미세주입
   1. 공압 펌프의 3방향 스톱콕을 끕니다. 주입 된 물질 (이 경우 LPS가 있거나없는 덱스 트란 -FITC)로 마이크로 피펫을 채 웁니다.
   2. 투명 필름 스트립으로 덮인 페트리 접시를 준비하십시오. 주입된 물질의 1μL 도트 2-4개를 필름에 놓습니다.
   3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫의 끝을 액체 내부로 구동하지만 실체 현미경의 시각화하에 필름 위로 구동합니다. 주사기를 부드럽게 당겨 주입 된 물질을 마이크로 피펫으로 빼냅니다.
   4. 마이크로피펫에 2-4μL의 주입된 물질을 채우고 주사기를 밀어 마이크로피펫 끝의 공기를 제거합니다. 마이크로피펫에 주입된 물질 컬럼을 검사하여 공기 주머니가 없는지 확인합니다. 마이크로 피펫 내부에서 철수 한 주입 된 물질의 양을 기록하십시오.
      알림: 액체는 덱스트란-FITC로 인해 녹색으로 보입니다.
   5. 약 60psi의 공기 압력을 제공하는 공압 펌프에 연결된 공기 공급원을 켭니다. 펌프를 켜고 펌프 지속 시간을 10-15ms로 설정하십시오. 주사기의 스톱 콕을 돌려 펌프에서 마이크로 피펫까지의 라인을 엽니 다.
      알림: 펌프 지속 시간이 길수록 펌프당 더 많은 재료가 방출될 수 있습니다. 주입 된 부피를 추정하기 위해 전체 실험에 대해 동일한 펌프 지속 시간과 팁 크기가 유사한 마이크로 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
   6. 세포 배양 인큐베이터에서 엔테로이드를 제거하고 미세 주입 후 빛 노출을 제한하기 위해 덮인 용기에 담긴 따뜻한 거품 벽돌 위에 접시를 놓습니다.
   7. 엔테로이드가 있는 페트리 접시를 실체 현미경 아래에 놓고 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 움직여 마이크로피펫 끝을 수평 표면에 대해 약 35°-45° 각도로 놓습니다(그림 3). 이것은 사전에 약간의 연습이 필요합니다.
   8. 현미경으로 각 페트리 접시의 엔테로이드를 시각화하고 매핑하여 접시당 약 3-5개의 구형 엔테로이드를 주입할 계획을 세웁니다.
   9. 마이크로피펫의 끝이 액체 표면에 가까워지면 현미경 접안렌즈를 들여다보고 팁을 표적 엔테로이드 쪽으로 전진시킵니다.
   10. 정확한 느린 움직임을 사용하여 z축 손잡이를 전진시켜 마이크로피펫 팁으로 엔터로이드에 구멍을 뚫습니다. 엔터로이드 벽은 팁이 엔터로이드 표면을 통과하면 눌리고 다시 튀어나오며, 이 시점에서 전진이 멈춰야 합니다.
   11. 한 발로 펌프 페달을 두드리고 약간 팽창 할 때까지 녹색 덱스트란 -FITC 용액으로 엔터 로이드를 채 웁니다. 펌핑 된 부피와 덱스 트란 농도를 계산하기 위해 펌프 수를 기록하십시오.
   12. 미세 주입을 마친 후 마이크로 피펫의 끝을 빼고 다음 엔터 로이드로 이동하십시오. 연습을 통해 프로세스가 원활하게 진행될 수 있습니다.
       1. 팁이 파손되면 팁 크기가 비슷한 다른 마이크로 피펫으로 교체하십시오. 동일한 노출 그룹의 모든 엔테로이드에 대해 충분한 양의 주입된 재료를 당기고 교차 오염을 방지하기 위해 주입된 재료 간에 마이크로피펫을 교체합니다.
   13. 빛에 노출되지 않도록 주입된 장용 접시를 덮개 아래에 놓습니다.
5. 덱스트란-FITC 수집 및 측정
   1. 미세 주입 절차 후 즉시 배양 배지를 제거하십시오. 신선한 성장 배지로 2x 세척하여 잔류 덱스트란-FITC를 제거합니다. 새 배지를 추가하고 미세 주입 후 시간 0으로 시간을 기록합니다.
      알림: 미세 주입 과정을 방해하지 않고 이 단계를 수행하려면 두 번째 사람이 필요할 수 있습니다.
   2. 불투명한 0.5mL 미세원심분리 튜브에 200μL의 배양 배지를 수집한 다음 제거된 배양 배지를 미세 주입 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간 및 12시간에 동일한 부피의 신선한 성장 배지로 교체합니다.
      참고: 시간 간격은 실험에 따라 다를 수 있습니다. 기저측 노출의 경우 교체 매체에는 동일한 농도의 노출이 포함되어야 합니다.
   3. 수집된 배양 배지를 4°C에 보관하고 24시간 이내에 덱스트란 농도를 측정합니다. 다른 분석을 위해 남은 배지를 -80°C에 보관하십시오. 배양 배지 수집이 끝나면 필요한 경우 RNA 추출 또는 이미징을 위해 엔테로이드를 수확합니다.
   4. 형광 마이크로플레이트 리더로 덱스트란-FITC 농도를 측정합니다. 직렬 희석을 사용하고 그림 4와 같이 선형 회귀선을 피팅하여 각 플레이트에 대한 표준 곡선을 구성합니다.
   5. 덱스트란이 없는 신선한 성장 배지로 대체된 덱스트란을 함유하는 배양 배지의 제거된 부피에 대한 흡광도를 다음과 같이 보정한다: 배양 배지 2 mL 중에서 200 μL의 제거는 10 부피%이다.
      2h에서의 보정된 흡광도 = (1h에서의 흡광도 x 10%) + 2h에서의 측정된 흡광도
      제1 보정된 배지의 흡광도는 보정이 필요하지 않습니다. 그런 다음 표준 곡선 방정식을 사용하여 보정된 흡광도 값으로부터 덱스트란 농도를 계산합니다.
   6. 정규화를 위해 덱스트란 농도를 각 페트리 접시의 총 펌프 수로 나눈 다음 접시당 최대 총 펌프 수를 곱합니다.
      알림: 모든 노출은 3 배로 수행됩니다 (노출 당 3 개의 페트리 접시와 접시 당 3-5 개의 미세 주입 엔테로이드). 삼중 평균값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 노출 간에 비교됩니다.

결과

우리는 미시간 대학교 번역 조직 모델링 실험실¹²의 공동 연구자들이 제공한 수정된 프로토콜에 따라 기증된 회장 태아 조직에서 장내 세포주를 확립했습니다. 장내 세포주는 마이코플라스마 감염에 대해 음성 판정을 받았습니다. 엔테로이드는 융모, CDX2, 리소자임, 뮤신, 클로딘, 오클루딘 및 조눌라-폐색 1(그림 5)에 대해 양성으로 염색되어 소장 상피 기원을 확인했습니다. 엔테로이드는 PBS에서 5mg/mL로 4kDa 덱스트란-FITC로 미세 주입되었습니다(그림 6). 시험 노출은 정점 노출을 위해 덱스트란-FITC와 혼합된 0.1mg/mL 및 0.5mg/mL의 다양한 농도의 LPS였습니다. 양성 대조군으로 2mM EGTA를 사용하고 덱스트란 미세주입 후 4시간에 배양 배지에 추가했습니다. EGTA는 단단한 접합부의 투과성을 증가시키는 칼슘 킬레이터입니다. 음성 대조군을 PBS 단독에 덱스트란-FITC로 미세주입하였다. 기저측 노출의 경우, 연속 배양 배지 수집을 위한 대체 배지는 동일한 농도의 노출(즉, 2 mM EGTA)을 가졌다. 결과는 음성 대조군인 PBS와 비교하여 EGTA를 첨가한 후 배양 배지에서 덱스트란 농도의 명확한 증가를 보여줍니다. LPS의 정점 노출은 농도 의존적 방식으로 노출 후 약 8 시간 후에 시작되는 덱스 트란의 더 높은 투과성을 유도했습니다 (그림 7).

그림 1: 마이크로 인젝터 설정. 설정에는 실체 현미경, 무거운 강철 베이스 플레이트의 마그네틱 스탠드에 장착된 마이크로 매니퓰레이터, 3방향 스톱콕이 있는 주사기에 연결된 마이크로피펫 홀더 및 공압 펌프가 포함됩니다. 벽 공기 공급 장치는 일정한 펌프 볼륨을 생성하기 위해 펌프에 의해 조절되는 공기 압력을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 수평 마이크로피펫 홀더. 이 플라스틱 플랫폼은 팁을 절단하기 위해 유리 모세관을 당긴 후 마이크로 피펫을 고정하도록 설계되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마이크로피펫 위치. 35°-45°의 각도는 페트리 접시 중앙에 위치한 엔테로이드를 주입하는 데 이상적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 덱스트란 표준 곡선. 상기 곡선은 덱스트란의 10 연속 희석물의 형광 흡광도를 이중으로 구성하였다. 회귀 방정식을 생성하기 위해 선형 회귀선이 장착되었습니다. 오차 막대는 SEM입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 엔테로이드의 형광 바이오마커. 핵 염색에 대한 DAPI는 파란색입니다. 다음의 바이오마커가 제시된다: (A) 융모, (B) CDX2, (C) 리소자임, (D) 뮤신, (E) 클로딘, (F) 폐색, 및 (G) 조눌라-폐색 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 여러 단계의 엔테로이드 . (A) 생후 7-10 일의 장내 장구는 작고 두꺼운 벽이 있습니다. (B) 큰 크기, 내강 및 씽크 월을 갖는 미세 주사를 위해 준비된 엔터 로이드, 및 (C) 미세 주사 후 2 일 후에 엔터 로이드 내부의 형광 덱스 트란 -FITC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 덱스트란-FITC 미세주입 후 투과성. (A) 배지에서 측정된 덱스트란 수준은 PBS에 비해 EGTA 첨가 후 더 높았다. (B) 미세 주입 된 0.5 mg / mL LPS는 주사 후 8 시간에 시작하는 미세 주입 0.1 mg / mL LPS보다 장내 내강에서 배지로 덱스 트란의 더 큰 누출을 유도했습니다. *p-값은 0.05<, 오차 막대는 SEM, n = 3, 유의성을 계산하기 위해 스튜던트 t-검정을 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 태아 장 조직으로부터의 장내 형성뿐만 아니라 면역 형광 염색 및 상피 투과성 테스트를 통한 모델 특성화에 대해 자세히 설명합니다. 엔테로이드의 투과성은 미세주입 기술 및 배양 배지에서 누출된 덱스트란-FITC 농도의 연속 시간 과정 측정을 사용하여 테스트되었습니다. 이 프로토콜의 참신함은 배양 배지⁷의 기저측 노출과 비교하여 인간의 장 생리학에 더 가깝게 유사한 정점 노출입니다. 이전 연구에서 Hill et al.은 시간¹⁶에 따른 형광 강도의 연속 이미징 및 계산을 활용했습니다. Ares et al. 상피 모델의 기저측막을 LPS에 노출시킨 다음, 세포 유전자 발현 패턴⁷을 비교하였다. 비교하여, 우리는 테스트 된 시약의 정점 노출을 사용하고 배양 배지에서 누출 된 덱스트란의 연속 농도를 측정하여 총 투과성의 잠재적 변화를 조사합니다. 우리의 방법은 또한 배양 배지에서 상피 세포에 의해 생성 된 사이토 카인과 세포 mRNA를 수집하여 유전자 발현에 대한 연속 비교 분석을 가능하게합니다. LPS는 투과성 및 염증을 유도하는 능력 때문에 동물 및 시험관 내 모델에서 장 손상을 연구하는 데 일반적으로 사용되었습니다 ^7,17. LPS가이 모델에서 테스트되었을 때, 상피 투과성은 노출 농도에 의해 구별되었다. 이 프로토콜은 다른 미세 주입 물질 및 결과 측정을 사용하여 다른 질병 병리를 연구하도록 확장 될 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계에는 태아 장 조직에서 장내 설정, 장내 특성화 및 미세 주입 기술이 포함됩니다. 이 연구의 무결성은 정확한 세포 샘플링에 달려 있습니다. 해부학적 랜드마크와 혈관을 사용하면 소장 세포를 선택하는 데 도움이 됩니다. 태아 장 줄기 세포의 강력한 성장과 분화로 인해 줄기 세포를 다른 상피 세포에서 분리하는 광범위한 절차가 필요하지 않습니다. 엔테로이드가 확립된 후에는 단백질과 세포 마커를 염색하여 모델의 특성을 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 장형은 빌린과 CDX2를 사용하여 장세포, 리소자임을 사용하는 Paneth 세포, 뮤신을 사용하여 잔 세포, 소장 상피^18,19,20 내에서 발견되는 모든 세포에 대해 염색되었습니다. 하나의 세포 유형을 표시하는 전통적인 단일 세포주와 달리, 엔테로이드는 장 전구 줄기 세포로부터 모든 세포 유형을 확립합니다⁸. 이 프로토콜의 염색 부분은 관심있는 특정 세포 마커에 대해 변형될 수 있다. 이 프로토콜의 신뢰성에 중요한 것은 미세 주입 기술입니다. 마이크로피펫 팁의 일관성은 dextran-FITC 용액을 사용하여 펌프당 부피를 측정하고 현미경으로 팁의 직경을 시각화하여 확인할 수 있습니다. 오염의 위험으로 인해 동일한 마이크로 피펫을 두 번 이상 노출 할 수 없습니다. 또한, 엔테로이드의 모양과 성장은 성장 배지의 내용물에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 우리는 콜리플라워 모양의 엔테로이드가 미세 주입을 위한 더 나은 모델을 제공한다는 것을 발견했습니다. 구형은 매체(²¹)에서 더 큰 Wnt 인자에 의해 유도될 수 있다.

이 프로토콜은 특히 시간에 민감한 측정에서 변동을 줄이기 위해 미세 주입에 대한 수행자의 기술에 크게 의존합니다. 일관된 기술을 가진 동일한 숙련 된 수행자를 보유하고, 유전 적 변이를 피하기 위해 동일한 세포 기원을 사용하고, 성숙도 편향을 제거하기 위해 동일한 계대에서 테스트하고, 유사한 세포 분화를 위해 동일한 유형의 배지에서 세포를 성장시킴으로써 변이를 최소화 할 수 있습니다. 성장 배지의 성분은 생체 내 환경이 아닌 시험관 내에서 줄기 세포의 다양한 분화를 유도 할 수 있습니다. 예를 들어, 생체 내에서 리소자임은 Paneth 세포가 형성되어 기능적으로 될 때 임신 발달 22-24 주까지 발현되지 않습니다²². 그러나 우리는 10 주 태아 장에서 확립 된 장내 로이드에서 리소자임을 검출 할 수있었습니다. 이 방법은 미세 주입에 필요한 높은 기술력으로 인해 한 번에 테스트 된 노출 횟수를 제한 할 수 있습니다. 미세 주입 천자 구멍에서 덱스트란 누출은 투과성 평가에 영향을 줄 수 있습니다. 이 효과를 없애기 위해 미세 주사 직후 삼중 세척을 통해 절차에서 잔류 덱스 트란을 제거하는 것이 좋습니다. 배지의 덱스트란 농도는 미세 주사 후 4-6시간 동안 매시간 측정해야 합니다. 주입 후 2-4 시간 내에 덱스 트란 농도가 크게 상승한 실험은 최종 분석에서 제외해야합니다.

이 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. Transwell의 엔테로이드 유래 단층에 비해 더 낮은 비용과 더 적은 자원이 필요합니다. 또한 장내 미생물과 상피 사이의 초기 상호 작용을 연구하기 위해 살아있는 박테리아 또는 바이러스와 같은 다른 노출로 확장 할 수 있습니다. 엔테로이드의 밀폐된 내강은 성장 배지(¹³)의 오염 없이 미세주입된 살아있는 박테리아의 안정한 성장을 유지할 수 있다. 단층이 성장 배지 및 배양 산소에 노출되는 것과 달리 밀폐된 루멘은 좁고 격리된 공간입니다. 밀폐 된 루멘은 성장 배지와의 통신을 허용하지 않으며 살아있는 박테리아 성장과 함께 시간이 지남에 따라 낮아지는 내강 산소 함량¹³.

태아 장 조직의 사용은 성인 장 줄기 세포 또는 동물 모델에 비해 미숙아의 장 상피를보다 정확하게 묘사한다⁷. 또한, 엔테로이드의 극성은 정점 및 기저측 노출 및 측정(²³) 모두를 허용한다. 엔테로이드는 더 낮은 산소화 농도를 갖는 밀폐된 내강을 형성하며, 이는 장(²⁴)의 산소화 농도를 보다 가깝게 모방한다. 기술적으로 더 진보된 프로토콜⁽¹⁶)과는 대조적으로, 총 매체 측정의 사용은 이 기술의 더 큰 접근성을 허용한다. 실험은 LPS에 대한 정점 노출에 의해 상피 누출이 유발 될 수 있으며 농도에 의존적이라는 것을 입증했습니다. 이 방법은 덱스트란의 누출 농도 변화를 검사하기 때문에 단단한 접합부의 총 기능적 변화를 감지하는 데 유용합니다. 메신저 RNA 수집 및 노출된 엔테로이드의 시퀀싱 및 웨스턴 블롯 분석은 전체 기능 변화의 분석을 보완할 수 있습니다. 이 모델은 조산 환경과 매우 유사한 시스템에서 장 상피 무결성을 연구하므로 조기 장 손상 및 기타 질병 병리를 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin 250 uL/mL	Gibco	15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal	Biogenex	MU392A-5UC
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032)	abcam	ab53032
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102)	abcam	ab15102
Anti-LYZ antibody produced in rabbit	Millipore Sigma	HPA066182-100UL
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032	Santa Cruz	sc-515032
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal	Biogenex	NUA42-5UC
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore Sigma	A8806
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates	USA Scientific Inc	50-754-1395
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates	USA Scientific Inc	50-754-1560
Centrifuge with 15 mL tube buckets	Eppendorf	05-413-110
CHIR 99021	Tocris Bioscience	4423
Confocal microscope	Olympus FV1200	N/A	Or a similar microscope
Conical centrifuge tubes, 15 ml	Falcon	05-527-90
Cover glass for microscope slides	Fisher Scientific	12-544-DP
Disposable scalpels	Mopec	22-444-272
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL)	Fisher Scientific	62248
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X)	Fisher Scientific	AAJ67802K2
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Millipore Sigma	E8145-10G
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa	Millipore Sigma	46944
Fuorescence microplate reader	Agilent BioTek	Synergy HTX
Gentamicin 50 mg/mL	Gibco	15-750-060
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling)	A-M systems	626500
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	Fisher Scientific	A32742
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Fisher Scientific	A32731
Goat Serum	Fisher Scientific	16210064
ImageJ software	NIH	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stem Cell  Technologies	06010
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Millipore Sigma	L4391-1MG
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354234	protein concentration > 9 mg/mL preferably
Micro forceps	Fisher Scientific	13-820-078
Micro scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette puller	World Precision Instruments	SU-P1000	Or a similar equipment
Microscope slides	Fisher Scientific	22-034486
Occludin Polyclonal Antibody	Fisher Scientific	71-1500
Paraformaldehyde 32% aqueous solution	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	RT 15714
Petri Dishes, 35x10 mm	Fisher Scientific	150318
Petri Dishes, 60x15 mm	Fisher Scientific	12-565-94
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	10010031
PicoPump foot switch	World Precision Instruments	3260
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL	Fisher Scientific	21-402-47
Pipette tips, non-filtered, 20 uL	Fisher Scientific	21-402-41
Pipette tips, non-filtered, 200 uL	Fisher Scientific	21-236-54
Pneumatic PicoPump system	World Precision Instruments	SYS-PV820	or a similar picopump system
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial	InvivoGen	ant-pm-1
Steel base plate	World Precision Instruments	5052
Stereo microscope	Zeiss stemi 350		Or a similar microscope
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks	Sonoco	03-531-53
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Wall air supply	N/A	N/A
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254
ZO-1 Polyclonal Antibody	Fisher Scientific	61-7300