In Vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법

요약

페놀 레드-프리/태아 무혈청 배지는 성별에 따른 차이 연구에서 결막 잔 세포의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 고급 RPMI보다 더 나은 옵션입니다.

초록

안구건조증은 안구 표면 건강에 영향을 미치는 여러 요인으로 인한 질환으로, 여성의 유병률이 매우 높습니다. 결막 잔 세포(CGC)가 안구 표면으로 분비하는 겔 형성 점액의 파괴는 여러 안구 표면 질환의 원인이 됩니다. 외인성 성 호르몬의 제거는 CGC의 성별 차이에 대한 시험관 내 연구 중에 일관된 결과를 얻는 데 필수적입니다. 이 논문은 생리적 기능을 유지하면서 CGC의 성별 차이 연구에서 외인성 호르몬의 존재를 최소화하는 방법을 설명합니다. 남녀 모두의 사후 인간 기증자로부터 얻은 CGC는 10% 소 태아 혈청(FBS)(완전 배지라고 함)이 있는 RPMI 배지의 결막 조각에서 합류할 때까지 배양되었습니다. 실험이 시작되기 거의 48시간 전에 CGC를 페놀 레드 또는 FBS가 없지만 1% BSA(페놀-레드-프리 배지라고 함)가 있는 RPMI 배지로 옮겼습니다. 정상적인 세포 기능은 fura 2/acetoxymethyl(AM) 현미경을 사용하여 카르바콜(Cch, 1 x ^10-4 M) 자극 후 세포 내 [Ca 2+]([Ca²⁺]_i)의 증가를 측정하여 연구되었습니다. 결과는 CGC가 48시간 후에도 페놀-적색-프리 배지에서 정상적인 기능을 유지했음을 보여줍니다. Cch 자극 시 페놀 적색이 없는 RPMI 배지와 완전 배지 간에 [Ca²⁺]_i 반응의 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서 성별 차이 연구에서 CGC의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 1% BSA가 함유된 페놀-레드 프리 RPMI 배지를 사용하는 것이 좋습니다.

서문

성별에 따른 차이는 안구 표면의 여러 과정에 영향을 미친다 ^1,2,3. 이러한 성별에 따른 차이의 임상적 양상은 안구건조증 및 결막염과 같은 남성과 여성의 많은 안구 표면 질환의 유병률 차이입니다 ^4,5,6. 증거에 따르면 성별에 따른 차이는 X 염색체와 Y 염색체7의 유전자 프로필의 상이한 프로필과 호르몬^{8의 영향을} 포함한 여러 생물학적 수준에서 발생한다. 성별에 따른 차이의 분자적 기초를 연구하면 질병에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있으며, 궁극적으로 맞춤형 의학을 개선할 수 있습니다.

안구 표면은 위에 놓인 눈물막, 각막 및 결막으로 구성됩니다. 눈물막^(tear film)^9,10, 각막(^cornea)11, 눈물샘(larimal gland)12,13^{, 눈물샘}(meibomian gland)¹²을 포함한 안구 표면의 여러 구성 요소에서 성별에 따른 차이가 관찰된다. 수많은 기계론적 연구에서 각막 및 관련 구성 요소에 대한 성 호르몬의 영향을 조사했습니다^14,15; 그러나 결막과 결막 세포의 성별에 따른 차이에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 결막은 공막과 눈꺼풀 안쪽 표면을 덮고 있는 점막입니다. 결막의 상피는 각질화되지 않고 다층으로 된 층화된 편평 세포로 구성되어 있다¹⁶.

결막의 층화된 편평 세포 중에는 상피의 정점 표면에 산재된 잔 세포(CGC)가 있습니다. 이들 잔 세포는 정점 극(¹⁷)에 위치한 많은 수의 분비 과립을 특징으로 한다. CGC는 겔 형성 뮤신 MUC5AC를 합성 및 분비하여 안구 표면에 수분을 공급하고 눈 깜빡임 동안 윤활합니다¹⁷. 뮤신 분비는 세포 내 [Ca 2+] ([Ca²⁺]i)와 Ras 의존성 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK1/2)의 활성화에 의해 엄격하게 조절됩니다 ¹⁸. 점액을 분비하지 못하면 안구 표면이 건조해지고 병리학적 이상이 후유증이 생깁니다. 그러나 염증이 있는 안구 표면에서는 염증 매개체에 의해 자극된 광범위한 점액 분비로 인해 눈의 끈적임과 가려움증이 유발된다¹⁹. 점액 분비가 방해를 받는 이러한 상태는 결국 안구 표면의 악화로 이어집니다.

안구 점액의 주요 공급원으로서 잔 세포의 역할은 오랫동안 인식되어 왔지만²⁰ 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 점액 조절의 성별 차이는 발견되지 않은 상태로 남아 있습니다. 체외 시스템은 호르몬 영향 없이 또는 정밀하게 조절된 수준의 성 호르몬으로 잔 세포의 기능을 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 결막 상피 세포주가 발달했음에도 불구하고²¹ 기능성 점액 분비를 가진 잔 세포주는 없습니다. 따라서 개발된 1차 인간 CGC 배양을 수정하여 in vitro¹⁶에서 성별에 따른 차이를 분석하는 방법을 확립하고 아래와 같이 제시하였다.

프로토콜

모든 인체 조직은 과학 연구에 사용하기 위해 기증자의 사전 동의와 승인을 받아 안구 은행에 기증되었습니다. 인간 결막 조직의 사용은 매사추세츠 눈과 귀 인간 연구 위원회(Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee)에서 검토했으며 면제 대상이며 인간 피험자를 대상으로 한 연구의 정의에 부합하지 않는 것으로 결정되었습니다.

1. 1차 인간 잔 세포 배양

1. 안구 은행에서 인체 결막 조직¹⁶을 얻습니다.
2. 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM 글루타민, 2mM 비필수 아미노산(NEAA), 2mM 피루브산 나트륨, 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진술폰산(HEPES)이 보충된 배양 배지인 RPMI-1640 배양 배지를 준비합니다.
3. 아래 설명된 대로 1차 세포 배양을 수행합니다.
   1. 멸균 메스로 조직을 1mm³ 조각으로 다지고 배양 후드의 배양 플레이트에 씨를 뿌립니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 4개를 1mL의 완전한 RPMI 배지에 파종합니다. 조직 조각의 방향은 세포 성장에 영향을 미치지 않지만 메스 블레이드를 사용하여 세포가 성장할 수 있도록 조각이 배양 플레이트에 부착되도록 합니다.
   2. 37 ° C에서 95 % 공기와 5 % CO₂ 가 들어있는 인큐베이터에 조직 조각을 넣습니다. 약 14일 내에 잔 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 동일한 배양 배지를 이틀마다 새로 고칩니다. 씨를 뿌린 후 약 72시간 후에 티슈 플러그를 제거합니다.
      참고: 인간 결막 상피는 주로 층화된 편평 세포와 잔 세포를 포함합니다. RPMI는 잔 세포에 대한 선택적 매체입니다. 드물게 인간 CGC 배양에서 섬유아세포는 7일째 즈음에 자랄 수 있습니다. 배양물을 정화하는 방법은 이전 간행물 ²²에 기술되어 있다.
   3. ¹⁹에 설명된 표준 IFM 방법에 따라 사이토케라틴(CK)7 및 나선 포마티아 렉틴-1(HPA-1)²²을 표적으로 하는 면역형광 현미경(IFM)을 사용하여 GC 배양의 순도를 확인합니다. 대표 결과를 참조하십시오.

2. 인간 결막 잔 세포 통로 및 실험 준비

1. PBS(pH = 7.4)로 세포를 헹구고 1x EDTA에서 0.05% 트립신을 사용하여 트립신화로 세포를 분리합니다. 현미경으로 매분 세포를 관찰하십시오. 셀이 바닥에서 분리되면 완전한 RPMI 배지를 사용하여 트립신을 비활성화합니다.
2. 실온에서 150× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 전체 RPMI 배양 배지에 재현탁시키고 [Ca²⁺]_i 측정을 위해 유리 바닥 배양 접시에 다시 파종합니다. 배지의 총 부피는 접시당 300μL입니다. 미디어를 접시의 유리 부분 중앙에 두십시오.
3. 배양 배지에서 호르몬 제거: 배양 배지에는 성 호르몬, 특히 FBS가 포함될 수 있습니다. RPMI-1640에 함유된 페놀 레드는 에스트로겐 활성 ^23,24를 가지므로 RPMI 배지를 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 교체하고 완전한 배지를 준비한 후 pH 스트립을 사용하여 pH를 7.45로 조정합니다. 전체 배지에 포함된 HEPES는 pH를 비교적 작은 범위로 유지합니다.

3. [Ca²⁺]_i 측정을 위한 Fura-2/acetoxymethyl(AM) 분석

1. 아래 설명에 따라 Fura-2/AM 로딩을 수행합니다.
   1. 37°C, 주변 대기에서 1시간 동안 유리 바닥 접시에 세포를 배양하고 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(KRB, 119mM NaCl, 4.8mM KCl, 1.0mM CaCl2, 1.2mM MgSO4 및 25mM NaHCO3 함유)과 0.5% HEPES(표 1) 및 0.5% BSA, 0.5μM fura-2/_AM, 8 μM 플루론산 F127 및 250 μM 설핀피라존.
   2. 사용하기 전에 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.45로 조정하십시오. fura-2/AM으로 로딩 한 후 [Ca^{2 +}] _i 측정 직전에 250 μM 술핀피라존을 함유 한 KRB로 세포를 세척하십시오.
2. 아래 설명에 따라 [Ca²⁺]_i 측정을 수행합니다.
   1. fura-2가 로드된 세포가 들어 있는 접시를 현미경 아래에 놓고 20x 배율로 20개에서 50개 사이의 세포가 포함된 대표 필드를 찾은 다음 Freehand 기능을 사용하여 각 세포 주위에 윤곽선을 그려 배경 형광과 배경 형광이 아닌 것을 소프트웨어에 표시합니다.
   2. 소프트웨어가 측정에서 배경 형광을 자동으로 뺄 때까지 기다렸다가 실험 시작 버튼을 클릭합니다.
   3. 그런 다음 8초에서 15초 사이에 기다렸다가 세포의 기초 칼슘 수치를 확인한 후 관심 작용제를 조심스럽게 피펫팅합니다. 작용제를 추가한 후 또는 칼슘 수치가 기준선으로 돌아올 때까지 최소 120초 동안 계속 측정하십시오.
3. 아래 설명에 따라 데이터 분석을 수행합니다.
   1. 피크 [Ca²⁺]_i 의 변화를 사용하여 자극의 작용을 나타냅니다. 측정의 처음 8-15초에서 각 셀의 평균 기초 칼슘 수준을 계산합니다. 해당 숫자가 500nM 이상이면 세포 사멸 또는 괴사가 진행 중이므로 데이터 세트에서 해당 셀을 제거합니다.
   2. 각 셀의 기초 수준이 계산되면 동일한 셀에 대해 측정된 최대 [Ca²⁺]_i 에서 해당 양을 뺍니다. 주어진 접시의 모든 세포에 대한 피크 [Ca²⁺]_I 의 변화를 평균화합니다.
   3. 일관성을 보장하기 위해 각 자극의 반응을 중복으로 기록하고 복제본에서 얻은 피크 [Ca²⁺]_i 변화의 평균값을 개별 인간 샘플의 하나의 데이터 포인트로 계산합니다. 연구 설계에 따라 적절한 데이터 분석 방법을 사용하여 여러 그룹의 데이터를 비교합니다.

결과

1차 배양에서 인간 CGC는 약 14일 만에 80%의 밀도로 성장합니다. 세포 유형은 잔 세포 마커 CK7 및 HPA-1²⁵ 에 대한 항체로 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다(그림 1). 배지에서 FBS를 제거하면 성 호르몬을 제거할 수 있지만, FBS가 부족하면 세포 반응에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 호르몬 제거 방법을 검증하기 위해, 콜린성 작용제(carbachol, Cch 1 ×

토론

안구 조직의 성별에 따른 차이를 조사하는 것은 질병, 특히 안구건조증과 알레르기성 결막염의 진행 과정을 이해하는 데 도움이 되며, 이는 한쪽 성별에 불균형적으로 영향을 미친다 ^4,5,6. 이러한 연구에는 동물 모델을 사용할 수 있지만 생체 내 인간 세포와의 유사성이 가장 높기 때문에 인간 조직에서 직접 얻은 데이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144.86
Fetal Bovin Serum	R&D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Human conjunctival tissue	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
inorganic salt for KRB buffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Any brand will work
L-glutamine	Lonza Group (Basel, Switzerland)	17-605F
non-essential amino acids	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
penicillin/streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenol red-free RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronic acid F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 culture medium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
scalpel	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
sulfinpyrazone	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G