다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

요약

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

초록

순환 종양 세포(CTC)는 암 예후, 진단 및 항암 치료에 중요합니다. CTC 열거는 CTC가 드물고 이질적이기 때문에 환자 질병을 결정하는 데 중요합니다. CTC는 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환계로 들어가 잠재적으로 먼 부위에서 성장하여 종양을 전이시킵니다. CTC는 원발성 종양과 유사한 정보를 전달하기 때문에 CTC 분리 및 후속 특성화는 암을 모니터링하고 진단하는 데 중요할 수 있습니다. 희귀 CTC의 계수, 친화성 변형 및 임상 면역형광 염색은 필요한 요소에 높은 감도를 제공하기 때문에 CTC 분리를 위한 강력한 방법입니다. 미세유체 칩은 환자에게 통증이 없는 액체 생검 방법을 제공합니다. 이 작업에서 우리는 CTC 분리, 분석 및 조기 진단에 필요한 일련의 기능과 서비스를 통합하여 생체 분자 분석 및 암 치료를 용이하게 하는 다목적 CTC 분리 플랫폼인 임상 미세유체 칩에 대한 프로토콜 목록을 제시합니다. 이 프로그램에는 희귀 종양 세포 계수, 적혈구 용해를 포함하는 임상 환자 혈액 전처리, 미세 유체 칩에서 CTC의 현장 분리 및 인식이 포함됩니다. 이 프로그램을 통해 종양 세포 또는 CTC를 정확하게 열거할 수 있습니다. 또한 이 프로그램에는 CTC 분리와 다용도 미세유체 칩 및 칩의 현장 면역형광 식별, 생체 분자 분석을 통합하는 도구가 포함되어 있습니다.

서문

순환 종양 세포(CTC)는 암 예후, 진단 및 항암 치료에 중요합니다. CTC는 드물고 이질적이기 때문에 CTC 열거는 매우 중요합니다. 희귀 CTC의 계수, 친화성 변형 및 임상 면역형광 염색은 높은 민감도로 필요한 요소를 제공하기 때문에 CTC 분리를 위한 강력한 기술입니다¹. 실제 환자 혈액 2-3mL에는 CTC가 1-10개만 포함되어 있기 때문에 정상 혈액과 혼합된 희귀 종양 세포는 실제 환자 혈액과 거의 유사합니다. 중요한 실험 문제를 해결하기 위해 PBS에 도입되거나 정상 혈액과 혼합된 많은 수의 종양 세포를 사용하는 대신 희귀한 수의 종양 세포를 사용하면 적은 수의 혈액 세포를 얻을 수 있으며 이는 실험을 수행할 때 현실에 더 가깝습니다.

암은 세계 주요 사망 원인입니다². CTC는 혈액 및 림프 순환계를 순환하는 원래 종양에서 배출되는 종양 세포이다³. CTC가 새로운 생존 가능한 환경으로 이동하면 두 번째 종양으로 성장합니다. 이를 전이(metastasis)라고 하며, 암 환자 사망의 90%를 차지한다⁴. CTC는 예후, 조기 진단 및 암의 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나, CTC는 환자 혈액에서 극히 드물고 이질적이다 ^5,6.

미세 유체 칩은 종양을 침범하지 않는 액체 생검을 제공합니다. 휴대가 간편하고 비용이 저렴하며 셀 매칭 스케일을 사용할 수 있다는 장점이 있습니다. 미세 유체 칩을 사용한 CTC의 분리는 주로 두 가지 유형으로 분류됩니다 : 친화성 기반, 항원-항체 결합 ^7,8,9에 의존하며 CTC 분리의 독창적이고 가장 널리 사용되는 방법입니다. 종양 세포와 혈액 세포^{(10,11,12,13,14,15}) 사이의 크기 및 변형 성 차이를 이용하는 물리적 기반 칩은 라벨이 없으며 작동하기 쉽습니다. 대체 기술에 비해 미세 유체 칩의 장점은 큰 타원 마이크로 필터의 물리적 기반 접근 방식이 높은 캡처 효율로 CTC를 확실하게 캡처한다는 것입니다. 그 이유는 타원 마이크로포스트가 라인 라인 간격의 슬림한 터널로 구성되어 있기 때문입니다. 라인 라인 갭은 마름모 마이크로 포스트와 같은 마이크로 포스트에 의해 형성된 전통적인 포인트 포인트 갭과 다릅니다. CTC의 웨이브 칩 기반 캡처는 물리적 특성 기반 분리와 친화성 기반 절연을 결합합니다. 웨이브 칩 기반 캡처에는 원형 마이크로포스트에 코팅된 anti-EpCAM 항체가 있는 30개의 웨이브 모양 어레이가 포함됩니다. CTC는 작은 갭에 의해 포착되고 큰 갭은 유속을 가속화하는 데 사용됩니다. 누락 된 CTC는 다음 어레이에서 작은 갭을 통과해야하며 칩⁽¹⁶) 내부에 통합 된 친화성 기반 격리에 의해 캡처됩니다.

이 프로토콜의 목표는 희귀 한 수의 종양 세포 계수와 미세 유체 칩을 사용한 CTC의 임상 분석을 입증하는 것입니다. 이 프로토콜은 CTC 분리 단계, 적은 수의 종양 세포를 얻는 방법, 작은 타원 필터, 큰 타원 필터 및 사다리꼴 필터의 임상적 물리적 분리, 친화성 변형 및 농축을 설명합니다¹⁷.

프로토콜

환자 혈액 샘플은 상하이 의과 대학 부속 Longhua 병원에서 제공했으며 프로토콜은 북경 대학 제 3 병원의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 연구 목적으로 샘플을 사용하는 것에 대해 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 배양된 종양세포로 포획 효율을 확인하기 위한 사전 실험

1. 포획 효율을 결정하기 위해 종양 세포 MCF-7, MDA-MB-231 및 HeLa를 배양하였다. 종양 세포 현탁액을 희석하고, 종양 세포의 수를 세고, PBS 1mL에서 원하는 세포 수가 얻어질 때까지 반복한다.
   1. 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 1 mL의 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 중 5개의 세포로 시작하는 세포 수를^{갖는 세포 배양} 플라스크에서 배양한다. 5%_CO2 분위기의 37°C에서 가습된 분위기에서 배양한다.
   2. 세포주가 95% 합류까지 부착성 단층으로 성장하면 Chen et ^al.16에 설명된 대로 2분 동안 0.25% 트립신 용액으로 배양 접시에서 세포를 분리합니다.
   3. 칼세인 AM으로 종양 세포를 염색하십시오. 배양 접시에 칼세인 AM 3μL를 넣고 접시를 인큐베이터에 30분 동안 보관합니다. 그런 다음 트립신으로 모든 세포를 소화하십시오.
   4. 세포 계수 챔버를 이용하여 PBS에서 배양된 종양 세포를 계수하고, PBS 1 mL 당 100개의 종양 세포가 얻어질 때까지 희석한다.
      참고: 세포 수를 정확하게 열거하기 위해 얻은 세포 현탁액 50μL를 취하여 현미경으로 종양 세포의 수가 5개인지 여부를 확인합니다. 50μL의 세포 현탁액에 있는 실제 종양 세포 수에 따라 100개의 종양 세포를 얻기 위해 취해야 하는 세포 현탁액의 부피를 결정합니다.
2. 0.5mL/h, 1mL/h, 2mL/h, 3mL/h, 4mL/h 및 5mL/h의 다양한 유속으로 주사기 펌프가 있는 주사기를 사용하여 PBS 1mL당 100개의 종양 세포를 포함하는 세포 현탁액을 미세유체 칩에 주입합니다. 다양한 유량에 대한 포집 효율을 구하고 최적의 유량을 결정합니다.
   1. 칩에 포획되어 배출구에서 흘러 나오는 종양 세포의 수를 세십시오. 아래와 같이 캡처 효율을 계산합니다.
      포획 효율 = 포획된 세포 수/(포획된 셀 수 + 유출되는 셀 수) × 100%
   2. 10 내지 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100)의 상이한 수의 종양 세포에 대한 포획 효율을 얻기 위해 반복한다.
3. 희귀 한 수의 종양 세포에 대해 미세 유체 칩을 테스트하고 검증합니다. 1mL의 PBS에 희석된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 종양 세포를 흡인하기 위해 마이크로피펫 풀러로 만든 중공 바늘을 사용하여 이 10개의 샘플 현탁액을 미세유체 칩에 주입합니다. 칩에 캡처한 후 각 샘플에 대한 종양 세포의 수를 감지하고 열거합니다.
   알림: 속이 빈 바늘의 길이는 약 3cm이고 외경은 1mm입니다.
4. 정상 혈액 샘플에 스파이크된 종양 세포에 대한 임상 실험 전 테스트를 수행합니다.
   1. 칼세인 AM으로 종양 세포를 염색한 다음 5μL의 PBS에 100개의 종양 세포를 열거합니다. 이 세포를 1mL의 전혈 샘플에 스파이크합니다. 이 세포를 칩에 도입하고 녹색 면역 형광으로 칩에 포획 된 종양 세포의 수를 열거합니다. 상기와 같이 칩에 대한 in vivo enumeration을 수행하고, 포획 후 포획 효율을 계산한다.
   2. 10 내지 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90)의 9 개의 추가 농도의 종양 세포 수에 대해 1.4.1 단계를 반복한다.
   3. 단계 1.3에 기술된 바와 같이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 종양 세포를 염색 없이 열거하고, 전정상 혈액 1mL에 스파이크하고, 이들 샘플을 미세유체 칩에 도입하고, 칩 상의 종양 세포를 포획한다.
   4. Hoechst, CK-FITC 및 CD45-PE로 칩에 얼룩을 묻히십시오. 3-5 μL의 형광 염료를 20-30 μL의 PBS에 넣은 다음 이 용액을 주사기로 미세유체 칩에 도입합니다. 칩에 포획된 종양 세포의 수를 청색 및 녹색 면역형광법으로 열거하여 포획 효율을 결정합니다.
5. anti-EpCAM의 친화성 기반 캡처를 위해 미세유체 칩의 변형을 수행합니다.
   참고: 웨이브 칩은 친화성 기반 및 물리적 특성 기반 절연을 모두 결합하므로 에이전트로 칩을 수정하십시오.
   1. 실온에서 45분 동안 에탄올에 4%(v/v) 3-메르캅토프로필 트리메톡시실란 100μL로 칩 표면을 수정합니다. 이 용액을 칩의 내부 구조, 특히 상단 표면과 기판 유리의 결합을 파괴할 경우를 대비하여 조심스럽게 천천히 칩에 주입하십시오.
      알림: 칩 표면은 메르캅토실란을 사용하여 수정됩니다. 칩에서 발생하는 상호 작용은 화학 결합에 의해 결정됩니다. 화학 결합은 항원으로 변형 된 항체의 결합을 실현하기 위해 확립됩니다. 칩 내부에서 다양한 시약이 변형되어 서로 연결되는 화학 결합을 형성합니다. 마지막으로 변형될 시약은 항-상피 접착 분자(anti-EpCAM)이다. EpCAM의 종양 세포 표면 항원은 칩 내부의 anti-EpCAM과 결합하여 CTC의 캡처를 실현합니다.
   2. 에탄올로 3 번 씻으십시오. 커플링제 N-y-말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르(GMBS, 1μM) 100μL를 칩에 넣고 30분 동안 상호 작용하도록 합니다.
   3. PBS 3x로 세척하십시오. 주사기를 사용하여 PBS 1mL를 칩에 주입하여 세척합니다.
   4. 실온에서 30분 동안 40μL의 10μg/mL 뉴트라비딘으로 칩을 처리하여 세포를 GMBS에 고정시킨 다음 PBS로 플러시하여 과량의 아비딘을 제거합니다.
   5. 1%(w/v) BSA가 포함된 PBS 100μL에 10μg/mL 농도의 항비오티닐화 EpCAM 항체 3μL로 칩을 수정합니다. 이것을 밤새도록 유지하십시오.

2. 순환 종양 세포(CTCs)를 열거하기 위한 칩에 대한 임상 실험

1. 적혈구 용해(RBCL) 용액을 사용하여 임상 암 환자 혈액 샘플을 전처리하거나 주사기를 사용하여 2-3mL의 혈액 샘플을 미세유체 칩에 직접 삽입합니다.
   1. 약 30분이 소요되는 전처리를 수행합니다. 항응고 튜브에서 전혈 샘플을 수집합니다. 6-9 mL의 RBS 용해 용액을 2-3 mL의 혈액에 넣는다. 실온에서 5-8분 동안 111 x g 로 원심분리하고 적색의 투명한 액체의 상층을 버립니다.
2. 아래에 설명된 대로 칩의 세포를 캡처, 염색, 인식 및 열거합니다.
   1. 단계 1.Hoechst, CK-FITC 및 CD45-PE를 사용하여 캡처된 CTC에 대해 칩을 염색하는 단계에 설명된 대로 칩 상의 세포를 캡처합니다. CK-FITC는 종양 세포에 대한 특이적 염색이고 CD45-PE는 백혈구에 대한 것입니다.
   2. 20 μL의 PBS에 3 μL의 CK-FITC를 추가합니다. 이것을 주사기에 넣고 희석된 CK-FITC를 칩에 펌핑합니다. 30분 동안 염색합니다. 300 μL의 PBS를 칩에 주입하여 칩을 세척합니다.
   3. 20 μL의 PBS에 3 μL의 CD45-PE를 추가합니다. 이것을 주사기에 넣고 희석된 CD45-PE를 칩에 펌핑합니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 300 μL의 PBS를 칩에 주입하여 칩을 세척합니다.
   4. 20x 또는 40x 배율에서 도립 형광 현미경으로 CTC를 식별합니다. CTC는 청색 형광과 녹색 형광을 모두 방출하고 백혈구(WBC)는 청색 형광과 적색 형광을 모두 방출합니다. 청색 및 녹색 형광이 모두 있는 CTC와 청색 및 적색 형광이 모두 있는 백혈구를 식별합니다.
   5. 면역형광 이미지에서 칩에 캡처된 CTC의 수를 열거합니다. CTC를 Hoechst+/CK-FITC+/CD45−로 열거하고 WBC를 Hoechst+/CK-FITC−/CD45+로 열거합니다.
3. 미세유체 칩 상에 역방향으로 주사기를 통해 PBS로 플러싱하여 포획된 CTC를 농축하여 칩에 포획된 CTC를 입구로부터 수집한다. PBS 1mL가 든 주사기를 사용하여 배출구에서 주입하여 2-3분 이내에 칩에 포착된 CTC를 농축하고 입구에서 수집합니다. 각 세척 단계마다 PBS 1mL를 사용하고 3회 반복합니다.
4. 아래에 설명된 대로 미세유체 칩에 포획된 종양 세포 또는 CTC를 염색합니다.
   1. 칼세인 AM을 사용하여 얼룩을 묻히십시오. 5 μL의 칼세인 AM을 20 μL의 PBS에 첨가하고, 세포를 30 분 동안 염색 한 다음, 실온에서 2 분 동안 111 x g 에서 원심 분리하여 종양 세포를 얻고, 1 mL의 PBS에 현탁시킨다.
   2. 세포핵을 식별하려면 큰 타원 마이크로필터의 경우 1mL/h, 사다리꼴 마이크로필터의 경우 1.5mL/h의 최적 유속으로 20μL의 DAPI 용액(PBS 20μL의 DAPI 시약 10μL)을 칩에 추가합니다. 20μL의 항-사이토케라틴 원액(20μL의 PBS에 3μL의 항-사이토케라틴 항체)을 통과시켜 30분 동안 칩과 반응시킵니다.
   3. 칩에 포착된 WBC를 얼룩지게 합니다. CTC가 칩에 포획된 후 25μL의 항-CD45 항체 용액(20μL의 PBS에 5μL의 항-CD45 용액)을 칩에 추가하고 30분 동안 염색합니다. PBS로 세척하고, 청색 및 녹색 형광 모두로 상피 세포를 확인한다.
5. 아래에 설명된 대로 형광 현미경으로 면역형광 식별을 수행합니다.
   1. 형광 현미경을 사용하여 청색 레이저로 샘플을 여기시킵니다. 핵 세포인 파란색 형광을 방출하는 세포를 찾으십시오. 10x, 20x 또는 40x 배율 중 하나를 사용합니다. 종양 세포에 대한 명확한 필드를 찾으십시오. 청색 레이저 소스의 경우 여기판 파장 420-485nm와 방출판 파장 515nm를 사용합니다.
   2. 샘플을 이동하지 않고 다른 레이저 소스를 사용하십시오. 형광 현미경을 회전시키고 녹색 레이저로 샘플을 여기시킵니다. 종양 세포를 나타내는 녹색 형광을 방출하는 세포를 찾으십시오. 이 녹색 레이저 소스로 동일한 배율로 동일한 필드의 이미지를 촬영하십시오. 청색과 녹색 형광을 모두 방출하는 세포는 종양 세포로 인식됩니다. 녹색 레이저 소스의 경우 460-550nm의 여기판 파장과 590nm의 방출판 파장을 사용합니다
   3. 샘플을 이동하지 않고 다른 레이저 소스를 사용하십시오. 형광 현미경을 회전시키고 적색 레이저로 샘플을 여기시킵니다. 적색 형광을 방출하는 세포를 찾으십시오. 이 적색 레이저 소스로 동일한 배율로 동일한 필드의 이미지를 촬영하십시오. 청색과 적색 형광을 모두 방출하는 세포는 백혈구로 인식됩니다.
   4. 위의 각 레이저 소스를 사용하여 얻은 이미지를 저장합니다. 다른 색상의 조명으로 같은 필드의 여러 이미지를 찍습니다.
   5. 여기판 파장이 330-400nm이고 방출판 파장이 425nm인 자외선을 사용하십시오. 여기판 파장이 395-415nm이고 방출판 파장이 455nm인 보라색 빛을 사용하십시오.
6. 1.2.1단계와 같이 캡처 효율을 계산합니다.

결과

전체 설정에는 주사기 펌프, 주사기 및 미세 유체 칩이 포함됩니다. 주사기의 세포 현탁액은 주사기 펌프에 연결되고 세포 현탁액은 미세 유체 칩에 도입되어 세포를 포획합니다. 사용된 모든 미세유체 칩에 대한 포획 효율은 약 90% 이상이었다. 웨이브 칩의 경우 다양한 간격을 가진 미세 구조를 설계했습니다. 작은 갭은 CTC를 포착하는 데 사용되며 큰 갭은 유속을 가속화하는 데 사용됩니다. 세포...

토론

암의 예후와 조기진단은 암 치료에 중요한 영향을 미친다¹. 미세 유체 칩을 사용한 CTC 분리는 침습 없이 액체 생검을 제공합니다. 그러나, CTC는 극히 드물고 혈액에서 이질적이다¹, CTCs를 분리하는 것은 어렵다. CTC는 CTC가 유래한 원래의 종양 발생원과 유사한 성질을 가지고 있다. 따라서 CTC는 암 전이에서 중요한 역할을 한다¹.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010