쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

요약

우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.

초록

췌장의 생리학과 병태생리학은 복잡합니다. 췌장염 및 췌장 선암(PDAC)과 같은 췌장 질환은 이환율과 사망률이 높습니다. 생체 내 영상(IVI)은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 조직의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 강력한 기술로, 세포 역학을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 쥐 췌장의 IVI는 장기의 깊은 내장 및 순응적 특성으로 인해 손상과 움직임 인공물이 발생하기 쉽기 때문에 심각한 문제를 안고 있습니다.

여기에 설명된 것은 쥐 P안장(SWIP)의 Intravital 이미징을 위한 Stabilized Window의 이식 과정입니다. SWIP는 건강한 췌장에서 세룰레인에 의해 유발된 급성 췌장염으로 변하는 동안, 그리고 췌장 종양과 같은 악성 상태에서 쥐 췌장의 IVI를 허용합니다. SWIP는 유전적으로 표지된 세포 또는 형광 염료 투여와 함께 단일 세포 및 세포 내 역학(단일 세포 및 집단 이동 포함)을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 여러 날에 걸쳐 동일한 관심 영역의 연속 이미징을 가능하게 합니다.

PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담이기 때문에 종양 세포 이동을 포착하는 능력이 특히 중요합니다. PDAC에서 전이의 생리학적 역학을 이해하는 것은 중요한 미충족 요구이며 환자 예후를 개선하는 데 매우 중요합니다. 전반적으로 SWIP는 향상된 영상 안정성을 제공하고 건강한 췌장 및 악성 췌장 질환에서 IVI의 적용을 확대합니다.

서문

양성 및 악성 췌장 질환은 잠재적으로 생명을 위협할 수 있으며, 병태생리학에 대한 이해에 상당한 격차가 있습니다. 췌장염(췌장 염증)은 미국에서 위장 질환 관련 입원 및 재입원의 세 번째 주요 원인이며 상당한 이환율, 사망률 및 사회경제적 부담과 관련이 있다¹. 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인으로 꼽히는^췌관 선암(PDAC)은 대부분의 췌관 악성 종양3을^{차지하며3} 5년 생존율이 11^%에 불과하다2. PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담입니다. 불행히도 대부분의 환자는 전이성 질환을 가지고 있습니다. 따라서 PDAC에서 전이의 역학을 이해하는 것은 암 연구 분야에서 중요한 미충족 요구입니다.

염증과 췌장의 전이성 연쇄 작용을 뒷받침하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식 격차의 주요 원인은 생체 내에서 췌장 세포 역학을 관찰할 수 없다는 것입니다. 이러한 세포 역학을 직접 관찰하면 췌장 질환 환자의 진단 및 치료를 활용하고 개선할 수 있는 중요한 표적을 밝힐 수 있습니다.

생체 내 영상(IVI)은 연구원들이 살아있는 동물의 생물학적 과정을 실시간으로 시각화하고 연구할 수 있는 현미경 기술입니다. IVI는 생체 내 및 해당 생물학적 과정의 기본 환경 내에서 세포 내 및 미세환경 역학을 고해상도로 직접 시각화할 수 있습니다. 따라서 IVI는 건강한 과정과 병리학적 과정에 대한 생체 내 관찰을 허용한다.

MRI, PET, CT와 같은 현대의 전신 영상 기법은 전체 장기를 잘 볼 수 있으며 임상 증상이 나타나기 전에도 병리를 밝힐 수 있다⁴. 그러나 그들은 단일 세포 분해능을 얻거나 질병-췌장염 또는 악성 종양의 초기 단계를 밝힐 수 없습니다.

이전 연구에서는 단세포 분해능 IVI를 사용하여 피부 ^5,6, 유방7, 폐⁸, 간 9, 뇌¹⁰, 췌장 종양¹¹의 양성 및 악성 질환을 관찰하여 질병 진행 기전을 규명했다¹². 그러나 쥐 췌장은 IVI를 사용하여 단세포 분해능을 달성하는 데 상당한 장애물이 되는데, 이는 주로 깊은 내장 위치와 높은 순응도로 인해 발생합니다. 더욱이 장간막은 장간막 내에서 비장, 소장, 위와 연결되는 분지화되어 확산되어 분포된 기관으로 접근하기 어렵습니다. 조직은 또한 인접한 연동 운동과 호흡으로 인한 움직임에 매우 민감합니다. 췌장의 움직임을 최소화하는 것은 단일 세포 해상도 현미경 검사에 필수적인데, 몇 미크론의 움직임 아티팩트도 이미지를 흐리게 하고 왜곡할 수 있어 개별 세포의 역학을 추적하는 것이 불가능하기 때문입니다¹³.

IVI를 시행하기 위해서는 복부 영상창(AIW)을 외과적으로 이식해야 한다 ^9,11. AIW를 외과적으로 이식하기 위해 금속 창틀을 복벽에 봉합합니다. 그 후, 관심 기관은 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 프레임에 부착됩니다. 일부 경직된 내부 장기(예: 간, 비장, 경직 종양)에는 이것으로 충분하지만, 건강한 쥐 췌장을 이미징하려는 시도는 조직의 순응적인 질감과 복잡한 구조로 인해 차선의 측면 및 축 안정성으로 인해 손상됩니다¹⁴. 이러한 한계를 해결하기 위해 Park 등[¹⁴]은 건강한 췌장을 위해 특별히 설계된 이미징 창을 개발했습니다. 이 췌장 영상 창(PIW)은 커버슬립 바로 아래의 창틀 내에 수평 금속 선반을 통합하여 조직을 안정화하고 커버 유리와의 접촉을 유지함으로써 장 운동과 호흡의 영향을 최소화합니다. PIW는 향상된 측면 안정성을 제공하지만, 이 창은 여전히 축 방향 드리프트를 나타내며 금속 선반과 커버슬립 사이의 좁은 간격으로 인해 큰 고형 종양의 이미징을 추가로 방지한다는 것을 발견했습니다¹⁵.

이러한 한계를 해결하기 위해 건강한 췌장과 병든 췌장 모두에 대한 안정적인 장기 이미징을 달성할 수 있는 이식형 이미징 창인 SWIP( Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas)를 개발했습니다(그림 1)¹⁵. 여기에서는 SWIP를 이식하는 데 사용되는 수술 절차에 대한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 주요 목적은 전이와 관련된 동적 메커니즘을 연구하는 것이었지만 이 방법은 췌장 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 탐구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 창문의 패시베이션

알림: 스테인리스강의 패시베이션은 금속의 오염 물질을 청소하고 얇은 산화물 층을 생성하여 티타늄¹⁶을 능가하는 연조직과의 금속의 생체 적합성을 크게 증가시킵니다.

1. 광학 창틀을 1%(w/v) 효소 활성 세제 용액으로 세척하여 패시베이션 과정을 시작합니다.
2. 유리병 안에 70°C의 5%(w/v) 수산화나트륨 용액에 프레임을 30분 동안 담그십시오.
3. 프레임을 꺼내 탈이온수로 헹굽니다.
4. 프레임을 55°C의 7%(w/v) 구연산 용액에 새 유리병 안에 10분 동안 담그십시오.
5. 프레임을 제거하고 탈이온수로 다시 헹굽니다.
6. 1.2단계를 반복하고 마지막으로 마지막으로 탈이온수로 창틀을 헹굽니다.

2. 종양 이식 또는 창문 수술을 위한 준비

참고: 췌장 종양 연구의 경우 종양 세포를 이식하고 명백한 종양으로 자라도록 해야 합니다. 생체 내에서 종양 세포를 시각화하려면 Dendra2와 같은 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 밝은 형광 단백질 라벨을 사용하면 조직 자가형광과 관련된 잠재적인 문제를 완화할 수 있습니다. 사용될 수 있는 다른 잠재적인 형광 단백질, 염료, 및 유전적으로 인코딩된 형광 마우스 모델은 다른 곳에서 논의되었다^17,18. 수술 부위의 오염을 방지하려면 후드 또는 층류 캐비닛에서 수술 절차를 수행하고 준비, 수술 및 회복을 위해 별도의 영역이 사용되는지 확인하십시오.

1. 수술 전에 모든 수술 기구를 오토클레이브에서 멸균하고 필요한 경우 후속 절차를 위해 핫 비드 멸균기를 사용하십시오. 수술이 팁만 사용하는 기술을 사용하는지 확인하십시오.
2. 가열된 수술용 패드와 비드 멸균기의 전원을 켜고 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 가열 패드 온도는 잠재적인 화상을 방지하기 위해 표면 온도계로 모니터링해야 합니다. 온도를 적절하게 제어할 수 없는 경우 가열 패드 위에 멸균 천을 놓습니다.
   알림: 종양 및 창문 이식과 같은 짧은 절차(≤20분) 중 체온은 가열된 수술 패드를 사용하는 동안 최소한의 영향을 받습니다. 그러나 장시간 타임랩스 이미징과 같이 더 오랜 기간 동안 마취하려면 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열된 챔버에 넣어야 합니다.
3. 마취실에서 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
4. 중요 단계: 마우스가 의식을 잃으면 마취를 2%로 낮춥니다. 마취 수준과 쥐의 바이탈을 주의 깊게 모니터링합니다(예: 맥박 산소 측정기 사용)¹⁹.
5. 각막 건조를 방지하기 위해 쥐의 각 눈에 눈 윤활제를 소량 떨어뜨립니다.
6. 수술 전 왼쪽 상복부에 제모 크림을 넉넉하게 발라 제모를 제거합니다. 20초 후 물에 적신 티슈를 사용하여 모발과 제모 크림을 단단히 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락이 제거될 때까지 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.
7. 수술 전 진통을 위해 PBS 90μL에 희석한 부프레노르핀 10μL(0.1mg/kg)를 피하 주사합니다.

3. 췌장 종양 이식

1. 원하는 농도로 종양 세포의 부분 표본을 준비합니다(종양 세포 배가시간 기준). 세포 현탁액을 인슐린 주사기에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 이 프로토콜을 따르기 위해, Erstad et al.21에서 채택된 orthotopic 주입 프로토콜에 따라 최대 50μL의 PBS에 현탁된 10⁶개의 syngeneic KPC 종양 세포²⁰을 사용합니다
   참고: 이 농도로 주입된 이 세포주는 10-14일까지 만져질 수 있거나 적절하게 큰 종양을 일상적으로 생성했습니다. 이 세포주 및 다른 췌장 세포주의 서브클론은 적절한 크기의 종양을 생성하기 위해 적절한 농도와 타임라인에 대해 평가되어야 합니다.
2. 소독 비누를 사용하여 손을 씻으십시오.
3. 새로운 수술을 받기 전에 새로운 멸균 장갑을 착용하십시오.
4. 마우스를 멸균 수술 후드로 옮기고 부분적인 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
5. 종이 테이프로 팔다리를 고정합니다.
   알림: 절차 전반에 걸쳐 기기를 올바르게 사용하는 것이 중요합니다. 집게, Castroviejo 가위 및 진공 픽업 도구를 잡는 방법의 파일은 그림 2A-C에 나와 있습니다.
6. 소독제로 복부를 소독합니다(그림 2D).
7. 발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
8. 집게와 Castroviejo 가위를 사용하여 피부에 10-15mm의 왼쪽 늑골 밑 절개를 만듭니다(그림 2E).
9. 필요하다고 판단되는 경우 면봉이나 소작 펜을 사용하여 지혈을 조절합니다.
10. 집게와 Castroviejo 가위로 아래 근육을 조심스럽게 나누어 복막에 들어갑니다(그림 2F).
11. 멸균 면봉을 사용하여 췌장과 비장을 비외상적으로 외부화합니다.
12. 주름이 생기지 않도록 췌장을 벌립니다(그림 2G).
13. 췌장의 몸 또는 꼬리(혈관에서 멀어짐)에서 원하는 종양 주사 부위를 식별합니다.
14. 중요한 단계: 췌장을 조심스럽게 배치한 후 겸자를 사용하여 조직에 장력을 가하고 경사가 위쪽을 향하도록 인슐린 주사기 팁을 췌장의 원하는 부위에 4-5mm 깊이로 삽입합니다(그림 2H).
15. 종양 세포 용액을 천천히 주입합니다. 성공적인 주입을 확인하는 작은 기포를 찾습니다(그림 2I).
16. 종양 세포 주입 기포를 건드리지 않고 조심스럽게 췌장을 복부로 되돌립니다(그림 2J).
17. 흡수성 5-0 폴리디옥사논 봉합사를 사용하여 먼저 근육층을 닫은 다음 단속된 봉합사로 피부를 닫습니다(그림 2K-N).
18. 절개 부위를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮은 다음(그림 2O) 회복을 위해 가열 램프 아래의 깨끗한 케이지에 마우스를 다시 넣습니다. 감염을 예방하기 위해 식수에 항생제를 투여하십시오. 쥐를 모니터링하고 수술 후 완전히 회복할 수 있도록 합니다.
    알림: 항생제는 IACUC 프로토콜에서 요구하는 대로 투여됩니다. 모든 동물은 개별적으로 수용됩니다.
19. 종양이 복벽을 통해 만져질 수 있을 때까지 10-14일 동안 종양이 자라도록 두십시오.

4. 췌장 창 수술

1. 동물이 이미징할 준비가 되면 창문 이식 수술을 시작합니다. 먼저 소독 비누로 손을 씻으십시오.
2. 새로운 수술을 받기 전에 새 멸균 장갑을 착용하십시오.
3. 가열된 수술용 스탠드에서 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓아 왼쪽 복부를 노출시킵니다.
4. 종이 테이프를 사용하여 쥐의 앞다리와 뒷다리를 가열된 수술 단계에 두개골과 꼬리로 고정합니다. 비장(피부 아래)이 수술 필드 내에서 보이는지 확인합니다(그림 3A).
5. 멸균 상태를 유지하려면 후드에 있는 모든 수술 기구의 포장을 풉니다.
6. 소독약을 넉넉하게 바르고 쥐의 피부를 면봉으로 닦아 수술 부위를 소독합니다.
7. 발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
8. 임계 단계: 집게로 복부 왼쪽 상부 사분면의 피부를 들어 올리고 Castroviejo 가위를 사용하여 피부와 근육계를 ~10mm 원형으로 절개합니다(그림 3B,C).
9. 출혈을 조절하고 필요한 경우 면봉이나 소작기를 사용하여 지혈을 유지합니다.
10. 비장에 부착된 췌장의 위치를 파악하고 절개 부위 내에서 췌장이 놓여 있는 방향을 식별하여 지지 십자수를 배치해야 하는 위치를 결정합니다.
11. 5-0 실크 봉합사를 사용하여 첫 번째 스티치를 근육층의 원하는 위치에 놓습니다. 이 끝을 3-5 노트로 묶습니다. (그림 3D,E)
12. 절개 부위를 직접 꿰매십시오. ~ 5cm의 꼬리를 자르고 남겨 둡니다 (그림 3F).
13. 첫 번째 스티치에 수직으로 4.11 및 4.12 단계를 반복합니다 (그림 3G, H).
14. 중요 단계: 췌장을 부드럽게 들어 올려 십자수 위에 놓습니다(그림 3I,J). 조작 중에 췌장이 손상되지 않도록 주의하십시오.
15. 중요한 단계: 5-0 실크 봉합사를 사용하여 구멍에서 ~1mm 떨어진 곳에서 피부와 근육층을 원주형으로 꿰매는 지갑 끈 스티치를 수행합니다(그림 3K).
16. 원형 절개의 가장자리가 창의 홈 안에 안착되도록 창틀을 배치합니다(그림 3L).
17. 이식 된 창을 5-0 실크로 단단히 묶어 고정하십시오.
18. 100μL의 액체 시아노아크릴레이트 접착제를 1mL 주사기에 넣습니다.
19. ~10초 동안 섬세한 압축 공기 흐름을 적용하여 조직을 건조시킵니다.
20. 창틀의 바깥쪽 가장자리를 집게로 잡고 부드럽게 들어 올려 창틀 밑면에서 췌장이 분리되도록 합니다.
21. 중요한 단계: 창의 홈을 따라 액체 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 디스펜싱합니다(그림 3M). 췌장 조직에 접착제가 묻지 않도록 하십시오.
22. 진공 픽업을 사용하여 5mm 커버슬립을 들어 올립니다.
23. 광학 창틀 중앙의 홈에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다. 시아노아크릴레이트 접착제가 굳을 수 있도록 가벼운 압력으로 유지합니다(~25초).
24. 집게를 사용하여 진공 픽업에서 커버슬립을 분리합니다.
25. 십자수 봉합사를 조여 췌장을 커버슬립에 꼭 맞게 고정합니다(그림 3N,O). 참고 : 십자수는 췌장에 손상과 허혈을 일으킬 수 있으므로 너무 세게 조이지 마십시오.
26. 봉합사의 끝을 자릅니다.
27. 마우스에서 테이프를 벗겨냅니다.
28. 이소플루란 기화기를 끕니다.
29. 마우스를 깨끗한 케이지로 옮기거나 생체 내 현미경으로 직접 옮깁니다.
30. 창문 수술 후 동물을 개별적으로 수용하고 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.
31. 그런 다음 이미징은 이전에 설명한 대로 22,23,24 긴 이미징 세션의 경우 마우스를 가열된 챔버에 넣어 체온을 유지하고 IACUC 표준에 따라 보조 유체를 제공합니다.

5. 췌장염 유도를 위한 세룰레인 치료

1. 췌장염의 발병을 조사하려면 SWIP를 이식한 후 건강한 쥐에게 세룰레인을 투여합니다. 쥐가 14-18 시간 동안 금식되고 세룰레인 투여 전에 ad libitum 물을 주는지 확인하십시오.
2. 멸균 1x DPBS 100μL에 세룰레인 50μg/kg을 1시간 간격으로 복강내로 최대 8회 주입합니다. 동일한 부피의 1x DPBS만 투여하고 복강내로 주사하여 대조군 마우스에 투여합니다.
3. 이미징 후 IACUC 표준에 따라 자궁 경부 탈구에 의한 첫 번째 주사 후 24시간 후에 마우스를 희생합니다.
4. 앞서 설명한 대로 22,23,24에서 2레이저 다광자 현미경에서 이미징을 수행합니다. 긴 이미징 세션의 경우 마우스를 가열된 챔버에 넣어 체온을 유지하고 IACUC 표준에 따라 보조 유체를 제공합니다.

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결과

그림 1은 Du et ^al.15에서 발췌한 것으로, 쥐 췌장의 IVI 타임랩스 동영상의 이미지 스틸을 보여줍니다. 일부 조직 움직임은 초기 안정화 기간(이미징 첫 시간, 그림 1A) 내에 관찰할 수 있습니다. 그러나 이 안정화 기간(>75분) 이후에도 이미징을 계속하면 측면 및 축 안정성이 증가하는 것을 관찰할 수 있습니다(그림 1B

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토론

여기에 설명된 SWIP 프로토콜은 십자수 바스켓 기술을 활용하여 췌장 조직 안정화의 개선된 방법을 제공합니다. 초기 복부 영상 창(AIW)은 복부 내부 장기의 생체 내 영상(IVI)을 가능하게 했지만 췌장과 같은 연조직의 움직임을 적절하게 제한하지 못했습니다. 이에 대응하여 Park et al.은 수평 금속 선반을 통합하고 유리 커버슬립과의 접촉을 유지하면서 췌장 조직의 안정화를 개선할 수 있는 췌장 이?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].