탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

요약

이 프로토콜은 토착 소 폐 조직에 적용되는 두 가지 뚜렷한 탈세포화 방법론을 설명하여 각각의 특성화에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다.

초록

조직 공학에서 세포외 기질(ECM) 유래 하이드로겔의 사용은 체외에서 세포의 자연 환경을 모방할 수 있기 때문에 점점 더 대중화되고 있습니다. 그러나 ECM의 기본 생화학적 함량을 유지하고, 기계적 안정성을 달성하고, 탈셀룰러화 공정이 ECM 하이드로겔의 기계적 특성에 미치는 영향을 이해하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서는 두 가지 프로토콜을 사용한 소 폐 조직의 탈세포화를 위한 파이프라인, 탈세포화 효과의 다운스트림 특성 분석, 재구성된 탈세포화된 폐 ECM 하이드로겔의 제조 및 기계적 및 세포 적합성 특성 평가에 대해 설명했습니다. 소 폐의 탈세포화는 물리적(동결-해동 주기) 또는 화학적(세제 기반) 방법을 사용하여 수행되었습니다. 주요 ECM 성분의 탈세포화 및 머무름을 검증하기 위해 Hematoxylin 및 Eosin 염색을 수행했습니다. 탈세포화된 샘플 내의 잔류 콜라겐 및 황산염 글리코사미노글리칸(sGAG) 함량을 평가하기 위해 각각 Sirius red 및 Alcian blue 염색 기법을 사용했습니다. 탈세포화된 폐 ECM 하이드로겔의 기계적 특성은 진동 유변학에 의해 특성화되었습니다. 그 결과, 탈세포화된 소 폐 하이드로겔은 대부분의 천연 ECM 성분을 유지함으로써 상용 ECM 제품에 대한 신뢰할 수 있는 유기형 대안을 제공할 수 있음을 시사합니다. 또한, 이러한 발견은 선택한 탈세포화 방법이 겔화 역학뿐만 아니라 생성된 하이드로겔의 강성 및 점탄성 특성에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.

서문

기존의 단층 배양 조건은 천연 조직 미세환경을 충실하게 표현하지 못하며, 세포-매트릭스 및 세포-세포 상호작용을 가능하게 하는 교육적 리간드가 있는 3차원(3D) 스캐폴드를 제공할 수 있는 능력이 부족하다¹. 세포외 기질(ECM) 조성 및 기계적 특성은 조직 특이적이고 시간 의존적이며 병리학적 조건에서 변화를 겪습니다. 따라서 이러한 특성의 조정 가능성, 세포 행동의 조절 및 원하는 조직 기능 달성을 허용하는 생체 모방 3D 조직 모델이 필요합니다. 네이티브 ECM 유래 생체 재료는 조직 특이적 ECM 1,2,3,4,5를 직접 사용할 수 있는 능력으로 조직 공학에서 많은 관심을 끌고 있습니다. ECM 기반 캐리어는 조직 재생에서 질병 모델 개발에 이르기까지 많은 응용 분야에서 사용되었습니다. 이들은 주사 또는 이식 가능한 생체 재료 스캐폴드(^4,5), 약물 ....

프로토콜

어린(1-2세) 소 기증자로부터 신선한 토종 폐를 지역 도축장에서 얻어 얼음 위에 밀봉된 플라스틱 용기에 담아 실험실로 운송했습니다. 동물 희생은 일반적인 육류 소비(폐는 폐기물로 버려짐)를 위해 수행되며 연구와 관련이 없거나 연구로 인한 것이 아닙니다. 우리는 도축장이 동물 희생에 관한 국가 법률 및 규정을 준수함을 확인합니다. 또한, 폐기물만 사용했으며, 연구 프로젝트는 희생된 동물의 수에 영향을 미치지 않았음을 확인합니다.

1. 장기 및 조직 적출 준비

1. 갓 얻은 소의 폐 조직은 실험이 끝날 때까지 -80°C에서 보관합니다.
2. 실험 당일에는 얼어붙은 폐 조직이 실온에서 해동될 때까지 기다립니다.
3. 멸균 메스와 가위로 조직을 해부하여 기관과 연골기도를 제거하고 작은 조각으로 더 잘게 썬다.
4. 2% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 3배 이상 함유한 초순수로 철저히 씻으십시오.

2. 조직의 탈세포화

참고: 천연 소의 폐 조직은 두 가지 별개의 프로토콜을 사용하여 탈세포화되었습니다.

토론

장기 유래 하이드로겔은 자연 조직 ECM을 재현하고 기관형 세포 기능을 모방하는 유망한 모델이 되었습니다. 탈세포화된 폐 ECM은 조직 공학에 자주 사용되어 왔지만, 생체 재료 조성 및 기계적 특성의 철저한 특성 분석은 항상성 또는 질병 중 생물학적 과정을 모델링하기 위해 세포-ECM 상호 작용이 어떻게 조절될 수 있는지 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. 특히, 강성 및 점탄성과 같은 재구성 하?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298