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요약

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

초록

용질 담체(SLC)는 이온, 영양소, 대사 산물, 신경 전달 물질 및 의약품을 포함한 다양한 내인성 및 외인성 기질을 수입 및 수출하는 막 수송체입니다. 매력적인 치료 표적 및 질병 표지자로 부상했음에도 불구하고 이 단백질 그룹은 여전히 현재 의약품에 비해 상대적으로 약이 부족합니다. 이러한 수송체에 대한 약물 발견 프로젝트는 제한된 구조적, 기능적, 생리학적 지식으로 인해 방해를 받으며, 궁극적으로 이러한 종류의 막에 내장된 단백질의 발현 및 정제의 어려움으로 인해 방해를 받습니다. 여기서는 코돈에 최적화된 유전자 염기서열을 사용하여 고순도 밀리그램 양의 인간 SLC 수송체 단백질을 얻는 방법을 보여줍니다. 구조 설계 및 고처리량 발현에 대한 체계적인 탐색과 함께 이러한 프로토콜은 표적 단백질의 구조적 무결성 및 생화학적 활성의 보존을 보장합니다. 또한 진핵생물 세포 발현, 친화성 정제 및 이러한 단백질의 크기 배제 크로마토그래피에서 중요한 단계를 강조합니다. 궁극적으로 이 워크플로우는 고분해능 구조 측정, 수송 연구, 저분자 관여 분석 및 고처리량 in vitro 스크리닝에 적합한 순수하고 기능적으로 활성화되며 안정적인 단백질 제제를 제공합니다.

서문

막 단백질은 오랫동안 연구자와 제약 산업 모두의 표적이 되어 왔습니다. 이 중 용질 운반체(SLC)는 인간 게놈1 내에 암호화된 400개 이상의 2차 수송체 유전자 계열입니다. 이러한 수송체는 이온2, 신경 전달 물질3, 지질 4,5,6,7, 아미노산8, 영양소 9,10,11 및 의약품 12을 포함한 수많은 분자의 수입 및 수출에 관여합니다. 이러한 광범위한 기질로 인해, 이들 단백질은 독소의 수송(13), 남용 약물(14,15)에 의한 운반 및 억제, 또는 해로운 돌연변이(16)의 운반을 통해 다양한 병태생리학에 관여한다. 박테리아 상동체는 여러 SLC 계열(17,18,19,20,21,22,23,24,25)의 기본 수송 메커니즘의 프로토타입 역할을 해왔다. 인간 단백질과는 대조적으로, 원핵생물 ortholog는 종종 잘 이해된 대장균 발현 시스템(26,27)에서 더 잘 발현되며, X선 결정학(28)을 위해 잘 정돈된 결정을 생성하는 더 작은 세제에서 더 안정적이다. 그러나, 순서와 기능적인 다름은 약 발견을 위한 이 먼 관련된 단백질의 사용을 복잡하게 한다29,30. 결과적으로, 인간 단백질의 직접적인 연구는 종종 SLC 31,32,33,34,35를 표적으로 하는 약물의 작용 메커니즘을 해독하는 데 필요합니다. 최근 Cryo-electron Microscopy(Cryo-EM)의 발전으로 보다 네이티브와 유사한 조건에서 SLC의 구조적 특성 분석이 가능해졌지만(36,37), 이러한 단백질을 발현하고 정제하는 데 어려움이 있어 표적 치료제 및 진단 개발에 있어 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.

이러한 문제를 완화하기 위해 RESOLUTE 컨소시엄(re-solute.eu)은 인간 SLC 계열 단백질의 대규모 발현 및 정제를 위한 리소스와 프로토콜을 개발했습니다38. 코돈에 최적화된 유전자를 시작으로 SLC 구조체의 고처리량 클로닝 및 스크리닝을 위한 방법을 개발했습니다. 이러한 방법은 SLC의 전체 패밀리에 체계적으로 적용되었고, 유전자는 BacMam 바이러스 발현 시스템으로 클로닝되었으며, 단백질 발현은 고처리량 클로닝 및 발현 테스트(40)를 위해 이전에 기술된 방법에 기초하여 인간 세포주(39)에서 테스트되었습니다. 요약하면, SLC 유전자는 pDONR221 플라스미드에서 pHTBV1.1 벡터로 클로닝됩니다. 이 작제물은 이어서 관심 유전자를 곤충 세포를 형질주입하기 위한 bacmid 벡터로 전치하는데 사용되며, 이는 포유류 세포에서의 발현을 위한 거대세포바이러스 프로모터 및 인핸서 요소를 포함한다. 생성된 바큘로바이러스는 표적 SLC 단백질의 발현을 위해 포유류 세포를 형질도입하는 데 사용할 수 있습니다.

또한 선별된 SLC의 대규모 발현 및 안정적인 정제를 위한 표준화된 분석법을 개발했습니다(그림 1). 이 프로토콜에는 효과적인 문제 해결을 촉진하고 실험 간의 변동성을 최소화하기 위한 여러 체크포인트가 포함되어 있습니다. 특히, 단백질 발현 및 국소화의 일상적인 모니터링과 개별 표적에 대한 정제 조건의 소규모 최적화는 Strep 및 Green Fluorescent Protein(GFP) 태그41,42의 도움을 받았습니다.

궁극적으로, 화학적으로 순수하고 구조적으로 균질한 이러한 단백질 샘플은 X선 결정학 또는 초저온 전자 현미경(Cryo-EM)을 통한 구조 측정, 생화학적 표적 결합 분석, 바인더 생성을 위한 면역 및 화학적으로 정의된 리포좀으로의 재구성을 통한 무세포 기능 연구에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 모든 코돈에 최적화된 RESOLUTE SLC 유전자는 AddGene43에 증착되었으며, 이 링크는 RESOLUTE 공공 시약44 목록에서 확인할 수 있습니다. 이들 유전자는 pDONR221 플라스미드로 클로닝되어 재조합 클로닝(45)을 이용하여 유전자를 목적 벡터로 직접 클로닝할 수 있다. 병렬성을 극대화하기 위해 박테리아, 곤충 및 포유류 세포는 각각 bacmid 생산(섹션 3), baculovirus 증폭(섹션 5) 및 발현 테스트(섹션 6)를 위해 블록 형식으로 성장합니다. 이러한 단계에서는 충분한 혼합 및 폭기를 보장하기 위해 마이크로 발현 쉐이커가 필요합니다.

1. SLC를 pHTBV1.1 bacmid로 (고처리량) 클로닝

참고: 클로닝 단계는 효율적인 클로닝을 위해 재조합 클로닝 프로토콜을 사용하고 열충격 방법(46)을 사용하여 대장균(E. coli)으로 형질전환시킨다. 이 프로토콜은 여러 표적 또는 구조의 높은 처리량 및 병렬 클로닝을 위해 설계되었지만 더 작은 규모에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

  1. 96웰 플레이트에 pDONR221 SLC 클론 150ng와 pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW 벡터 100ng를 추가합니다. 10mM Tris pH 8.0으로 반응 부피를 8μL로 한 다음 재조합 효소 혼합물 2μL를 첨가합니다.
  2. 실온에서 1시간 동안 배양하고, 1μL의 Proteinase K를 추가하고, 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 4μL의 반응 혼합물을 사용하여 회수를 위해 열 충격 방법46 및 SOC 배지를 사용하여 화학적으로 적합한 대장균 MACH-1 세포 50μL를 형질전환시킵니다. 5% 자당 또는 SOC 한천을 함유하고 100μg/mL 암피실린을 보충한 LB-한천에 플레이트를 얹습니다.
  4. 적절한 프라이머(표 1 참조)와 콜로니 PCR47에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 SLC 유전자 삽입물로 pHTBV1.1 벡터가 있는 콜로니를 식별합니다.
  5. plasmid miniprep kit를 사용하여 관심 유전자가 있는 단일 콜로니에서 재조합 플라스미드를 정제합니다.

2. 조옮김

참고: 다음 단계는 Sf9 세포에서 BacMam 바큘로바이러스 생성을 위해 pHTBV1.1 벡터의 SLC 유전자를 bacmid로 전치하는 데 사용됩니다. 열-충격법(46)을 이용하여, pHTBV1.1 벡터는 lacZ-mini-attTn7 융합을 갖는 모체 bacmid를 함유하는 DH10Bac 유능한 대장균 세포로 형질전환된다. 전위는 도우미 플라스미드(48)에 의해 제공되는 전위 단백질의 존재 하에서 pHTBV1.1 벡터의 요소와 모체 bacmid 사이에서 발생한다. 이 프로토콜에 사용되는 솔루션의 구성에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

  1. 3μL의 100-200ng/μL 정제된 pHTBV1.1 벡터 DNA를 사용하여 96웰 PCR 플레이트에서 열충격 방법을 사용하여 DH10Bac을 형질전환합니다. 세포를 회수 배지에서 37°C에서 4-5시간 동안 배양하면서 미세발현 셰이커에서 700rpm으로 흔들어 세포를 회수합니다.
  2. 50μL의 형질전환된 세포를 DH10Bac 선택 플레이트에 퍼뜨립니다. 플레이트를 호일로 덮은 37 °C에서 48 시간 동안 배양합니다.
  3. 단일 백색 콜로니(재조합 DNA 포함)를 선택하고 희석하기 위해 줄무늬를 만듭니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

3. 고처리량 bacmid 생산

알림: 이 프로토콜은 96웰 bacmid 정제 키트를 사용하여 bacmids를 추출하는 단계를 설명합니다.

  1. 개별 백색 콜로니(줄무늬에서 희석 플레이트로 분리됨)를 1mL의 2x LB 배지를 포함하는 96-딥 웰 블록의 웰에 접종합니다(표 2).
  2. 다공성 밀봉으로 덮고 37°C에서 700rpm으로 밤새 micro-expression shaker에서 배양합니다.
  3. 마이크로타이터 플레이트에 배양액 120μL와 60% 글리세롤 30μL를 혼합하여 세포의 글리세롤 스톡을 준비하고 -80°C에서 보관합니다.
  4. 깊은 우물 블록을 2,600× g 에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 오염 제거를 위한 적절한 용기에 디캔팅합니다. 블록을 뒤집고 종이 타월을 가볍게 두드립니다. 250μL의 용액 1을 다중 채널 피펫을 사용하여 블록의 각 웰에 추가합니다.
  5. 펠릿을 다시 현탁하십시오. 필요한 경우 다중 채널 피펫을 사용하십시오.
  6. 각 웰에 용액 2 250μL를 추가하고 실리콘 매트로 밀봉합니다. 부드럽게 5번 뒤집고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 아주 짧게 회전합니다.
  7. 300μL의 용액 3을 추가하고 실리콘 매트로 밀봉합니다. 부드럽지만 완전히 뒤집어 5번 뒤집습니다.
  8. 샘플을 얼음 위에 20분 동안 놓은 다음 2,600× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  9. 투명한 상층액을 새 96웰 블록으로 옮깁니다. 다시 2,600× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  10. 새로운 96-deep-well 블록에서 웰당 0.8mL의 100% 이소프로판올을 분주합니다. 해당 웰에서 0.8mL의 상층액을 추가합니다.
  11. 피펫을 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫팅한 다음 얼음 위에서 30분 동안 또는 4°C에서 밤새 배양하여 더 많은 바미드를 생성합니다.
  12. 2,600 × g 에서 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리기.
  13. 생물 안전 캐비닛 내부에서 블록 외부에 70% 에탄올을 분사하고 블록을 열고 상층액을 버립니다.
  14. 각 웰에 500μL의 70% 에탄올(v/v)을 추가하고 블록을 부드럽게 두드려 펠릿을 세척합니다. 접착 플라스틱 씰로 덮고 2,600× g 의 원심분리기를 4°C에서 30분 동안 가열합니다.
  15. 생물 안전 캐비닛 내부에서 블록을 열고 상층액을 버립니다. 에탄올을 제거하기 위해 종이 타월에 블록을 아주 부드럽게 두드립니다. 블록을 후드 내부에서 1-2시간 동안 또는 50°C 오븐에서 건조시킵니다.
  16. 50μL의 멸균 TE 완충액을 추가하여 bacmid DNA를 재현탁하고 접착 플라스틱 씰을 사용하여 밀봉합니다. 내용물을 V-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다. 테스트 정제가 완료될 때까지 bacmid DNA를 4°C에서 보관한 다음 -20°C에서 보관합니다.
    참고: 일상적으로 측정되지는 않지만 일반적으로 500 - 2,000 ng/μL bacmid DNA의 수율을 기대할 수 있습니다.
  17. 표준 콜로니 PCR 방법(47) 및 다음 벡터 프라이머를 사용하여 표적 유전자를 성공적으로 통합하는 bacmids를 스크리닝합니다.
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    참고: 앰플리콘은 표적 유전자보다 약 700bp 더 큽니다.

4. 형질주입

참고: 이 단계는 생성된 bacmid로 Sf9 곤충 세포를 transfection하는 데 사용되며, 이로 인해 곤충 세포가 baculovirus 입자(P0)를 생성합니다.

  1. 무혈청 곤충 배지에서 Sf9 세포를 2.0-2.4 × 106 cells/mL의 밀도로 성장시킵니다. 세포를 무혈청 곤충 배지에서 2 × 105 cells/mL로 희석하고 희석된 세포 1mL를 24웰 조직 배양 플레이트 웰에 분주합니다. transfection-reagent-only-only와 cells-only 대조군을 포함합니다. 플레이트를 27°C의 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 세포가 부착될 수 있도록 합니다.
  2. 무혈청 곤충 배지 웰당 38μL를 형질주입 시약 웰당 2μL와 혼합합니다. 혼합물 40μL를 96웰 멸균 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트에 분주합니다. 0.5-2.0 μg/μL에서 2 μL의 재조합 bacmid DNA 2 μL를 추가하고, 플레이트를 덮고, 미생물 안전 캐비닛 내부에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 160μL의 무혈청 곤충 배지를 DNA-transfection 시약 혼합물이 들어 있는 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
  4. 4.1 단계의 세포에서 배지를 흡입합니다. 200μL의 bacmid-transfection 시약-배지 혼합물을 세포에 부드럽게 첨가하고 플레이트를 덮은 다음 27°C의 가습 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.
  5. 400μL의 무혈청 곤충 배지에 2% FBS가 보충된 각 웰을 추가합니다. 증발을 줄이려면 플레이트를 깨끗한 비닐 봉지에 옮기되 밀봉하지 마십시오. 가습 인큐베이터에서 27°C에서 72시간 동안 플레이트를 배양합니다.
  6. 3일 후 플레이트의 배지를 멸균 96-딥 웰 블록으로 옮기고 실온에서 20분 동안 1,500× g 의 원심분리기를 사용합니다. P0 바큘로바이러스가 함유된 정제된 상청액을 멸균된 96-딥 웰 블록에 옮기고 빛에서 떨어진 4°C에서 보관합니다.

5. BacMam 바큘로바이러스 증폭

참고: 다음 단계는 초기 P0 바큘로바이러스를 더 높은 역가 바이러스 스톡으로 증폭하는 데 사용됩니다. 즉, P1, P2 및 P3입니다. 최종 P3 역가는 transduction 및 단백질 발현에 적합합니다. 효율성과 병렬성을 위해 이 프로토콜은 경험적으로 최적화된 바이러스 증폭을 위해 고정된 체적 비율을 사용합니다. 그러나, 후속적으로 형질도입된 세포가 현미경에 의해 GFP 형광 및 증가된 세포 직경을 나타내지 않거나 단백질 발현이 실패하는 경우(섹션 6 및 8 참조), 바큘로바이러스 역가 49,50,51,52를 정량화한 후 각 단계에서 낮은 다중성 감염에 대해 바큘로바이러스 증폭을 다시 최적화해야 하며, GFP 형광 현미경 검사로 감염을 모니터링하고 세포 직경을 증가시켰다(53).

  1. 무혈청 곤충 배지에서 Sf9 세포를 2 × 106 cells/mL의 밀도로 성장시켜 P1 바이러스 스톡을 준비하고, 2% FBS를 추가하고, 웰당 3mL의 최종 부피로 24-deep-well 블록에 세포를 시드합니다. 세포에 120μL의 P0 바이러스 스톡을 추가합니다.
  2. 27°C에서 블록을 450rpm으로 66-72시간 동안 미세발현 셰이커에서 흔들면서 배양합니다. 실온에서 20분 동안 1,500× g 에서 블록을 원심분리하고 상층액을 96-딥 웰 블록으로 수확합니다. P1 바이러스 스톡은 4 °C에서 빛을 피해 보관하십시오.
  3. 2% FBS가 보충된 무혈청 곤충 배지에서 성장한 50mL의 Sf9 세포(2 ×10 6 cells/mL 세포 밀도)를 250μL의 P1 바이러스 스톡으로 감염시켜 P2 바이러스 스톡을 준비합니다. 27°C에서 110rpm으로 진탕하여 세포를 배양합니다.
  4. P2 바이러스 스톡은 66-72시간 후 1,500× g 에서 20분 동안 원심분리하여 수확하고 4°C에서 빛을 피해 보관합니다.
  5. 원하는 부피의 Sf9 세포(2 × 106 cells/mL 세포 밀도)를 1:200(v/v) P2 바이러스 스톡으로 감염시켜 P3 바이러스 스톡을 준비합니다. 27°C에서 110rpm으로 진탕하여 세포를 배양합니다.
  6. 66-72시간 후, 1,500 × g 에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 수집하여 P3 바이러스를 수확하고 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관합니다.

6. 발현 테스트를 위한 형질전환

참고: 다음 섹션에서는 소규모 표현식 테스트에 대해 설명하며 깊은 웰 블록을 사용하여 여러 구성의 병렬 테스트를 위해 수정할 수 있습니다.

  1. 200g의 PEG 10,000과 12g의 NaCl을 이중 증류된 H 2O의 600mL에 녹여20%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조합니다. 용액을 오토클레이브합니다.
  2. 채취한 P1 바이러스 300μL를 24-deep well 블록의 웰에 넣고 각 well에 75μL의 PEG 용액을 추가합니다. 300rpm에서 5분 동안 흔들면서 18°C의 micro-expression Shaker에서 블록을 배양하고 4°C에서 밤새 보관합니다.
  3. 18°C에서 30분 동안 300rpm으로 블록을 다시 흔들고 3,000× g 에서 45분 동안 블록을 원심분리합니다. 미생물 안전 캐비닛에서 피펫을 사용하여 상층액을 폐기합니다.
  4. HEK293 배지에서 2 × 106 cells/mL의 밀도로 현탁액 적응 HEK293 세포를 준비하고 바이러스 펠릿이 들어 있는 각 웰에 3mL를 파종하고 5mM 부티르산나트륨을 보충합니다.
  5. 30 ° C에서 8 % CO2 로 블록을 200-250 rpm에서 72 시간 동안 흔들면서 배양합니다.
    참고: 세포 배양 중 공급업체에서 권장하는CO2 농도는 현탁액 적응 및 조상 HEK293 세포주에 따라 각각 8% 및 5%로 다릅니다.
  6. 900× g 에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 각각 1mL의 PBS로 잘 세척합니다.
    참고: 10μL의 재현탁 세포를 흡인하고 GFP 호환 필터 큐브가 있는 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 단백질 발현 및 국소화를 평가합니다. 10-15 μL의 재현탁 세포를 흡인하고 겔 내 GFP 형광 검출을 위해 전체 세포 SDS-PAGE 겔을 실행합니다54.
  7. 900× g 에서 20분 동안 다시 원심분리합니다. 펠릿을 -80 °C에서 동결합니다.

7. 높 처리량 소규모 시험 정화

참고: 다음 단계에서는 개별 SLC의 발현 수준을 스크리닝하기 위한 24웰 블록 형식의 신속한 테스트 정제 워크플로우를 설명합니다. 이 프로토콜에 사용되는 솔루션의 구성에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

  1. 채취한 세포의 각 웰에 1mL의 HT 용해 완충액을 추가하고 24헤드 프로브를 사용하여 24웰 블록에서 총 4분 동안 얼음에서 초음파 처리를 진행합니다(3초 켜기/15초 끄기에서 순환).
  2. 내용물을 96 깊이의 웰 블록으로 옮기고 125μL의 세제 스톡을 추가하고 실리콘 씰로 밀봉합니다. 블록을 4°C에서 1시간 동안 부드럽게 회전합니다. 또는 도데실말토사이드(DDM)와 콜레스테롤 헤미숙시네이트(CHS)를 24웰 블록에 직접 넣고 4°C의 로커 셰이커에 놓습니다.
  3. 블록을 2600× g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 96-딥 웰 블록으로 옮깁니다.
  4. 용해 완충액으로 사전 평형을 이룬 고용량 Strep-Tactin 수지의 50% 재고를 준비합니다.
  5. 각 웰에 100μL의 재현탁 수지 스톡을 추가합니다.
  6. 블록을 실리콘 씰로 덮고 4°C에서 2시간 동안 회전한 다음 매우 짧게(최대 200× g) 원심분리하여 덮개에 달라붙은 액체를 제거합니다.
  7. 빈 블록 위에 96웰 필터 플레이트를 놓고 수지/상층액 혼합물을 필터 플레이트로 옮깁니다. 800μL의 HT 세척 버퍼로 깊은 우물 블록의 웰을 헹구고 필터 블록으로 옮겨 최대량의 수지를 수집합니다.
  8. 버퍼를 200× g 에서 잠깐 동안 떨어뜨리거나 원심분리하여 플로우스루를 수집합니다. 새 세척 블록 위에 필터 플레이트를 놓고 800μL의 HT 세척 완충액으로 수지를 세척하여 완충액이 떨어지도록(또는 잠깐 원심분리기). 세척 단계를 두 번 더 반복하고 블록을 500× g 에서 3분 동안 원심분리하여 잔류 HT 세척 버퍼를 제거합니다.
  9. 필터 플레이트를 96웰 마이크로타이터 플레이트 위에 놓습니다. 50μL의 HT 용출 완충액을 추가하고 실온에서 10분 동안 진탕하여 배양합니다. 500× g 에서 3분 동안 원심분리하여 시료를 용리합니다.
  10. 용출된 시료 15μL를 Coomassie 염색 SDS-PAGE 겔에 올려 단백질 발현을 확인합니다. 나머지 용리액 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피(FSEC) 시스템에 로드하여 DDM/CHS에서 단백질 단분산성을 평가합니다.

8. 대규모 표현을 위한 변환

참고: 다음 단계는 SLC 표현식을 위한 표준 RESOLUTE 프로토콜입니다. 개별 표적은 발현 시간, 배양 온도 및 부티르산나트륨의 농도에 대한 추가 최적화가 필요합니다. 또한, 소규모 실험에서 현탁액에 적응된 HEK293 세포를 감염시키는 데 사용되는 P3 바이러스의 다양한 부피 비율을 테스트하여 바큘로바이러스 감염의 다양성을 일상적으로 최적화합니다. 이는 시간 효율적이고, 이미 사용 중인 기술과 장비를 사용하며, 원하는 실험 결과를 직접 평가합니다. 그러나, 이러한 경험적 방법은 P3 바이러스의 각 증폭에 대한 재최적화를 필요로 하며, 바큘로바이러스 입자 49,50,51,52를 정량화하기 위해 다른 방법들을 이용할 수 있다.

  1. HEK293 배지에서 현탁액 적응 HEK293 세포의 필요한 부피를 확대합니다.
  2. 현탁액 적응 HEK293 세포를 1 × 106 cells/mL로 희석하고 24시간 동안 성장시킵니다(2L 롤러 병의 경우 170rpm, 3L 롤러 병의 경우 105rpm).
  3. 세포 1리터당 30mL의 P3 바이러스를 추가하고 5mM 부티르산나트륨을 추가합니다. 37°C에서 48시간 또는 30°C에서 72시간 동안 세포를 배양합니다.
  4. 배양 기간 동안과 그 후에 중요한 단계는 명시야 현미경을 사용하여 세포를 검사하여 미생물 오염 및 세포 생존율을 확인하는 것입니다. GFP 호환 필터 큐브와 함께 형광 현미경을 사용하여 단백질 발현 및 국소화를 평가합니다.
  5. 900× g 에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.
  6. 세포 배양 리터당 10-15mL의 PBS에 재현탁하여 세포 펠릿을 세척하고 펠릿을 다시 900× g 에서 20분 동안 세척합니다.
  7. 세포 펠릿을 액체 질소에 스냅 얼린 후 -80°C에서 보관합니다.

9. 단백질 정제

NOTE: 다음은 5L 세포 배양을 위한 SLC 정제를 위한 표준 RESOLUTE 분석법입니다. 각 SLC 대상에 대해 최적의 세제는 경험적으로 결정되어야 합니다. 기본 완충액, 세제 원액, 세척, 용출 및 SEC 완충액을 미리 준비합니다(표 2). 테스트된 표준 세제 목록은 표 3을 참조하십시오. 세척 완충액의 ATP 및 MgCl2 는 열 충격 단백질에 의한 오염을 줄입니다.

  1. 1일차
    1. 냉동 세포 펠릿을 실온으로 설정된 수조에서 해동합니다.
    2. 135mL의 염기 완충액과 3개의 프로테아제 억제제 칵테일 정제로 가용화 완충액을 준비합니다. 정제를 녹이십시오.
    3. 해동된 펠릿을 가용화 완충액으로 재현탁시킵니다. 세포 펠릿 10-15g당 27mL의 가용화 완충액을 사용하고 DNase를 첨가한 다음 얼음처럼 차가운 Dounce 균질화기에 붓습니다. 플런저를 약 20배 위아래로 움직여 용액을 균질화하고 균질기를 얼음 위에 유지합니다.
      참고: 재현탁 부피는 표적 단백질과 세포 펠릿 질량에 따라 최적화되어야 하며, 이는 수확 시 세포 밀도에 따라 달라집니다. 상업용 DNase는 제조업체의 지침에 따라 추가할 수 있습니다. DNase는 또한 확립된 프로토콜(55)을 사용하여 사내에서 발현되고 정제될 수 있다.
    4. 세제 원액을 1% 최종 농도로 추가합니다.
      참고: 단백질 정제를 최적화하기 위한 핵심 단계는 SLC 가용화 및 정제를 위한 최적의 세제를 식별하는 것이며, 이는 경험적으로 식별되어야 합니다. 우리는 정기적으로 다양한 세제를 사용했습니다. 각각 단독으로 그리고 콜레스테릴 헤미 숙시 네이트와 결합하여 세제 대 CHS 질량 비율을 10 : 1로 유지합니다.
    5. 가용화 혼합물을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 1°C에서 4시간 동안 천천히 회전합니다.
    6. 용액을 50,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 수집합니다.
    7. 4-6mL의 베드 부피의 Strep-Tactin 수지를 염기 완충액과 평형화합니다.
    8. 가용화된 상층액에 평형 수지를 첨가하고 4°C에서 2시간 동안 회전합니다.
    9. 용액을 중력 흐름 컬럼에 붓고 용액이 흐르도록 합니다.
    10. Strep 세척 완충액의 베드 부피의 30배로 레진을 3회 동일한 부피 단계로 세척합니다.
    11. 용출 완충액 3-5mL를 넣고 15분 동안 배양한 후 용출액을 채취합니다. 이 단계를 4번 더 반복하여 각 용리 분획을 개별적으로 수집합니다.
      참고: 핵심 단계는 Strep-Tactin 수지에서 단백질을 용출하는 것으로, 용출 완충액을 첨가할 때마다 15분 동안 배양하는 것이 중요합니다. 전형적으로, 제1 용리액 분획물은 잔류 세척 완충액에 의한 용출 완충액의 희석으로 인해 더 낮은 농도의 단백질을 함유한다. 그러므로, 더 높은 최종 단백질 농도가 필요한 경우 제1 용리액 분획물을 폐기할 수 있다. 또는 모든 연속 용리액의 단백질 농도를 SDS-PAGE를 사용하여 분석하여 프로토콜을 최적화할 수도 있습니다.
    12. UV 흡광도 분광법으로 단백질 농도를 측정하고, 원하는 용리 분획을 결합하고, 1:5(w/w) 및 1:10(w/w)의 비율로 3C 프로테아제를 추가합니다.
    13. 4 °C에서 밤새 천천히 회전시킵니다.
      참고: 9.1.12 및 9.1.13 단계는 GFP 태그를 제거해야 하는 경우에만 필요합니다. 태그 제거가 필요하지 않은 경우 9.2.4단계로 직접 진행하십시오. 또는 단백질을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하여 다음날 계속할 수 있습니다. 또한, 안정성이 감소된 SLC의 경우 프로테아제 농도, 배양 기간 및 온도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 3C 프로테아제는 광범위한 온도에서 활성을 보이며 다양한 SLC에 가장 적합한 최적화를 가능하게 합니다.
  2. 2일차
    1. 코발트 금속 친화성 수지의 베드 부피 2-4mL를 SEC 완충액과 평형화합니다.
    2. 평형 코발트 금속 친화성 수지를 하룻밤 3C 반응 혼합물에 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 회전합니다.
    3. 용액을 중력 흐름 컬럼에 붓고 플로우 스루를 수집합니다.
    4. 4°C에서 3,000× g 으로 회전하여 100kDa 컷오프 원심 필터에 플로우스루를 농축하고 원하는 SEC 주입 부피에 도달할 때까지 5분마다 샘플을 부드럽게 혼합합니다.
    5. SEC 버퍼를 사용하여 덱스트란-아가로스 기반 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 평형화합니다. SEC 절차는 4°C(냉각실 또는 냉장실)에서 수행해야 합니다.
      참고: 주요 단계: SLC의 올리고머 상태에 따라 아가로스 기반 크기 배제 크로마토그래피 컬럼과 같은 다른 컬럼을 사용하여 SEC를 수행할 수 있습니다.
    6. 샘플을 샘플 루프에 주입하고 컬럼 압력이 컬럼 제조업체의 사양보다 낮도록 유속으로 SEC 프로그램을 실행합니다. 분획 분취기를 사용하여 전체 SEC 실행에 걸쳐 0.3mL 분획을 자동으로 수집합니다.
    7. 피크 분율을 풀링하고, UV 흡광도를 측정하고, 4°C에서 3,000 ×g 으로 회전하여 100kDa 차단 원심 농축기에서 필요한 부피/농도로 농축합니다.

결과

포유류 발현을 위해 SLC 유전자를 RESOLUTE pDONR 플라스미드에서 BacMam 벡터로 클로닝할 수 있습니다.
클로닝, 발현 및 정제를 위해 설명된 프로토콜은 여러 단백질 접힘에 걸쳐 많은 SLC 수송체에 대해 성공적인 것으로 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 이 절차에는 진행 상황을 모니터링하기 위한 몇 가지 체크포인트가 포함되어 있어 발현, 단백질 접힘, 지질 및 세제 의존적 안정성, ...

토론

SLC 표적 치료제의 개발은 수송체 기능의 체계적인 특성 분석의 부재로 인해 방해를 받고 있습니다. 이로 인해 정상 및 병태생리학적 과정에서의 수많은 역할에도 불구하고 GPCR 및 이온 채널63에 비해 이 단백질 클래스를 표적으로 하는 약물이 불균형적으로 적어졌습니다. RESOLUTE는 현재 SLC 연구를 가속화하고 개선하기 위한 최첨단 연구 기법과 도구를 개발하는 것을 목표로 하는 ...

공개

저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 RESOLUTE 프로젝트의 일환으로 수행되었습니다. RESOLUTE는 보조금 계약 No 777372에 따라 Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking으로부터 자금을 지원받았습니다. 이 공동 사업은 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램과 EFPIA의 지원을 받습니다. 이 기사는 저자의 견해만을 반영하며, IMI나 유럽연합 및 EFPIA는 이 글에 포함된 정보의 사용에 대해 책임을 지지 않습니다. pHTBV 플라스미드는 Frederick Boyce 교수(하버드)가 친절하게 제공하였습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
3C proteaseProduced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentratorsSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96-well bacmid purification kitMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)Greiner Bio-One780271
Adhesive plastic sealsQiagen19570Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography columnCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAseProduced in-house
BisTrisSigma AldrichB9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris saltAnatraceCH210CHS
Cobalt metal affinity resinTakara Bio635653TALON Metal Affinity Resin
D(+)-BiotinSigma Aldrich851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography columnCytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)DWK Life Sciences357546
EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma Aldrich4693132001cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycerolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgeninAnatraceGDN101GDN
Gravity flow columnsCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 mediumThermo Fisher12338018FreeStyle 293 medium
HEPESApollo ScientificBI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC columnSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4.6 x 150
ImidazoleSigma Aldrich56750
Insect transfection reagentSigma Aldrich71259Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Magnesium Chloride HexahydrateSigma AldrichM2670
Micro-expression shakerGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-β-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17-β-D-GlucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl EtherAnatraceAP1210C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl EtherAnatraceAPO129C12E9
Porous seal for tissue culture platesVWR60941-084Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Recombination enzyme mixThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Serum-free insect mediaGibco10902088Sf-900 II serum-free media
Sodium ButyrateSigma Aldrich303410
Sonicator 24-head probeSonics630-0579
Sonicator power unitSonicsVCX 750
Strep-Tactin resinIBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
SucroseSigma AldrichS7903
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350DDS
Suspension-adapted HEK293 cellsThermo FisherA14527Expi293F
Transfection reagentSigma Aldrich70967GeneJuice Transfection Reagent

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