인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 최적 단계에서 동결 보존

요약

이 연구는 인간 줄기세포 유래 망막 색소 상피 세포의 효율적인 동결 보존을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 유래한 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 퇴행성 질환이 있는 개인의 세포 교체 요법을 위한 우수한 세포 공급원입니다. 그러나 이러한 치료 세포의 안정적이고 안전한 뱅킹에 대한 연구는 드뭅니다. 동결 보존 후 RPE 세포의 매우 가변적인 세포 생존율과 기능적 회복은 가장 일반적으로 발생하는 문제입니다. 본 프로토콜에서는 원래의 실험 조건을 기반으로 최적의 동결 세포상을 선정하여 해동 후 최고의 세포 회수율을 달성하는 것을 목표로 했습니다. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine 라벨링 분석을 사용하여 결정된 지수 단계에서 세포를 동결하여 해동 후 세포 생존율과 회수율을 개선했습니다. 안정적이고 기능적인 세포는 긴 분화 과정과 무관하게 해동 직후에 얻어졌습니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 hESC 유래 RPE 세포의 간단하고 효율적이며 저렴한 보존 및 해동이 가능합니다. 이 프로토콜은 RPE 셀에 초점을 맞추지만, 이 동결 전략은 다른 많은 유형의 분화된 셀에 적용될 수 있습니다.

서문

망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)는 망막의 적절한 기능을 유지하는 데 필요한 세포의 색소 단층이다¹. RPE 기능 장애 및 사망은 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 Stargardt 질병을 포함한 많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다 ^2,3. RPE 대체 요법은 이러한 질병에 대한 가장 유망한 치료 요법 중 하나입니다 4,5,6,7. 공여체 RPE 세포의 안정적인 공급은 세포 치료에 필수적입니다. 인간 배아 줄기 세포(hESC) 유래 RPE 세포는 일차 RPE 세포의 기능을 모방하고 이론적으로 무제한으로 공급할 수 있기 때문에 세포 치료에 이상적인 세포 공급원입니다⁸. 그러나 분화 과정은 힘들고 얻어진 RPE 세포의 저장 수명은 후속 상피-중간엽 전이(EMT)로 인해 상대적으로 짧습니다. 따라서 hESC 유래 RPE 세포의 동결 보존은 장기 보관 및 주문형 배포에 필요한 필수 단계입니다⁹.

동결보존에 의한 세포 손상은 의도치 않게 치료 효능을 손상시킬 수 있다^10,11. 따라서, 동결보존에 관한 최근의 연구들은 세포치료제를 설계할 때 최적의 동결보관 조건을 결정해야 한다고 제안하고^{있다 12}. 성공적인 동결 보존은 효율적인 세포 회수, 높은 생존율 및 동결-해동 주기 후 세포 기능 복원을 보장합니다. 그러나 포유류 세포의 부착 단층의 동결 보존에 대한 이전 연구에서는 해동 후 매우 가변적인(35%-95%) 생존율(13,14,15)을 보고했습니다. 많은 요인들이 동결보존의 결과에 상당한 영향을 미치며, 특히 동결 단계^{동안에 영향을 미친다 16,17}. 최근 연구에 따르면 서로 다른 시점에서 동결된 RPE 세포는 해동 후 다양한 회복을 보였다¹⁷. 우리가 아는 한, 줄기 세포 유래 RPE 세포의 최적 동결 시간 창 결정에 대한 연구는 부족합니다. 다른 연구에서, 세포는 다양한 단계에서 동결되었다 : 일부 세포는 passaging 직후 또는 합류 또는 색소 침착 ^8,15,18 전에 동결 된 반면, 다른 세포는 다른 시점 9,19,20,21에서 동결되었다. 또한, 동결 보존에 사용되는 RPE 세포의 단계 또는 단계가 해동 후 RPE 기능에 영향을 미치는지에 대한 명확한 증거는 없습니다. 이전 연구에서 우리는 세포 성장의 기하급수적 단계(P2D5)가 세포 생존력과 세포 특성 및 기능의 회복 측면에서 hESC 유래 RPE 세포의 동결 보존을 위한 최상의 단계임을 처음으로 입증했습니다¹⁷.

여기에서 확립된 방법은 hESC 유래 RPE를 최적 단계에서 동결 보존하여 해동 후 세포 생존력 및 기능 측면에서 최상의 보존을 달성하는 것을 목표로 합니다. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 라벨링 분석을 사용하여 동결 보존 전에 DNA 합성의 기하급수적 단계를 검출한 결과, 해동된 RPE 세포는 >80%의 생존율 및 부착률, RPE 특이적 유전자 발현, 분극 세포 형태, 색소 상피 유래 인자 분비, 적절한 경상피 저항성 및 식세포 능력을 보여주었습니다 ^8,17,22. 이 프로토콜은 hESC 유래 RPE 세포에 초점을 맞추고 모든 치료 세포가 동일하게 동결 보존되는 것은 아니지만, 지수 단계에서 동결 전략은 다른 많은 치료 세포에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 해리

1. 앞서 설명한 대로 RPE 셀을 유지^17,22.
   참고: 모든 세포는 프로토콜 기간 동안 37% CO₅ 분위기에서 2°C에서 성장합니다.
2. 필요한 양의 PBS 및 배양 배지를 37 ° C 수조에서 준비하고 세포 해리 시약을 실온에 둡니다.
3. 배양 용액을 버리고 웰당 1mL의 예열된 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.
4. 세포 해리 시약 1mL를 6-웰 플레이트에 추가하고 37°C에서 15분 동안 세포를 분해합니다. 배양 후 수축하고 가장자리에서 빛나는 세포를 현미경으로 관찰하여 소화가 끝났는지 확인합니다.
   참고: 트립신 기반 해리는 세포 생존율이 낮기 때문에 권장되지 않습니다.
5. 1mL 피펫으로 10배 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 해리하고 세포 현탁액을 예열된 배양 배지(Y-27632 제외)로 1:10의 비율로 희석합니다. 그런 다음 실온에서 250× g에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다.
6. 원심분리 후 상층액을 빠르게 붓고, 배양 배지 2mL에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하고, 피펫으로 세포를 10-15배 재현탁시킵니다.
7. 40μm 세포 여과기로 세포 현탁액을 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻고 세포 수를 계산합니다.
   참고: 단일 세포 현탁액은 해동 후 정확한 세포 계수와 균일한 세포 파종 밀도를 위해 필수적입니다.

2. 동결 보존을 위한 최적의 세포 단계 결정

참고: 세포 상태는 분화 방법과 세포주에 따라 다르기 때문에 서로 다른 실험실에서 배양된 RPE 세포의 기하급수적 단계는 동결 전에 결정해야 합니다.

1. 기저막 매트릭스 용액 한 바이알을 4°C의 얼음에서 밤새 해동합니다. 매트릭스를 12mL의 차가운 DMEM/F-12에 희석하고 잘 섞습니다. 웰당 하나의 커버슬립을 추가하고 24웰 플레이트의 각 웰에 0.25mL의 희석된 용액을 코팅합니다. 사용하기 전에 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양하고 세포를 도금하기 직전에 코팅 용액을 흡입합니다.
   참고: 부분 표본 부피에 대한 지침은 단백질 농도에 따라 로트별로 다르며 제품 사양 시트에서 확인할 수 있습니다.
2. 배양 배지 1mL에 10⁵/cm² 의 밀도로 기저막 매트릭스 코팅된 커버슬립의 1.7단계에서 RPE 단일 세포를 시드합니다. 2-3일마다 배양 배지를 새로 고칩니다.
3. 표시된 시점(통과 후 1, 3, 5, 7 및 11일)에 24시간 동안 배지에 10μM EdU로 RPE 세포를 배양합니다. 설명서에 설명된 대로 반응 칵테일로 세포를 고정, 투과 및 염색하여 통합된 EdU를 검출합니다.
4. 형광 현미경으로 5개의 무작위 필드에서 이미지를 캡처하고 EdU 양성 세포의 비율을 계산합니다. 해당하는 EdU-양의 proportion-time 곡선을 플로팅하여 성장 곡선을 생성합니다. 그런 다음 성장 곡선에 따라 각 세포주에 대한 동결 창 또는 지수 단계를 결정합니다.
   참고: 재확립된 육각형 세포 형태는 세포가 기하급수적 단계를 벗어났음을 나타냅니다.

3. 냉동 보존

1. 단계 1.1 내지 1.7에 따라, 분해 시간이 5분으로 감소하는 것을 제외하고는, 세포 현탁액을 실온에서 250 × g에서 3분 동안 원심분리한다.
2. 원심분리 후 빠르게 부어 상층액을 버리고 세포 펠릿을 동결 보존 매체에 2 × 10⁶ cells/mL의 밀도로 부드럽게 재현탁시키고 세포 현탁액 1mL를 1.2mL 극저온 바이알에 옮깁니다.
3. 즉시 극저온 바이알을 냉동 용기에 넣고 -80°C에서 밤새 얼려 -1°C/min의 냉각 속도를 달성한 다음 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다.

4. 해동

1. 배양 배지를 37°C 수조에서 데우고 예열된 배양 배지 10mL를 15mL 튜브에 미리 채웁니다.
2. 자동 해동 시스템을 사용하여 액체 질소 저장고에서 직접 채취한 극저온 바이알을 빠르게 해동합니다.
3. 0.5-1mL의 예열된 배양 배지를 극저온 바이알에 떨어뜨려 동결된 세포가 점차 새로운 환경에 적응하도록 합니다. 그런 다음 15mL 튜브에서 세포 현탁액 1.5-2mL를 배양 배지 10mL로 옮기고 실온에서 3분 동안 250× g 으로 세포를 원심분리합니다.
4. 원심분리 후 빠르게 부어 상층액을 버리고, 예열된 배양 배지 2mL에 펠릿을 재현탁하고, 혈구계를 사용하여 세포 수를 세어 표준 트리판 블루 배제(0.4% 트리판 블루 염색)를 사용하여 회수율과 생존율을 결정합니다.
5. Y-27632(최종 농도: 10μM)가 보충된 배양 배지에서 10⁵ viable cells/^cm2 의 밀도로 기저막 매트릭스 코팅된 표면의 세포를 배양합니다. 24시간 후에 Y-27632를 제거합니다.
6. 부착 속도를 결정하려면 세포를 다시 해리하고 해동 후 24시간 후에 세포 수를 계산합니다.

5. 최적 동결 단계 검증

1. 2.4단계에서 결정된 최적의 동결 단계를 검증하기 위해 다른 시점 및 배양에서 동결된 RPE 세포를 28일 동안 해동합니다. qPCR 및 면역염색 분석을 위해 세포를 수확하여 앞서 설명한 대로 RPE 마커의 발현을 평가합니다¹⁷.

결과

여기서, P1D35에서의 hESC-유래 RPE 세포는 10⁵/^cm2의 밀도로 통과되고 파종되었다. 파종 후 일주일 이내에 특징적인 육각형 형태와 색소 침착이 지연 단계 (약 2 일) 동안 손실되었습니다. RPE 세포는 지수 단계(약 5일, 그림 1A)에서 육각형 형태를 점차적으로 다시 채택하고 보다 다각형 형태로 감속 단계(약 6일)에 진입했습니다. 세포 배양을 일주일 더 계속하면 세?...

토론

본 연구에서는 연구 및 임상적 필요를 위한 hESC 유래 RPE 세포에 대한 성공적인 동결-해동 프로토콜에 대해 설명합니다. 불멸화된 RPE 세포주인 ARPE-19와 달리, 줄기세포 유래 RPE 세포와 같이 적절한 특징적인 상피 표현형 및 기능을 가진 RPE 세포는 동결 보존에 더 민감합니다. 세포의 32% 미만이 제대로 보존되지 않은 경우 해동 후 24시간 동안 남아 있었다¹⁷. 냉동 보존 시기는 중요한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049