초단파 자기조립 펩타이드 매트릭스에서 SW1222 세포주의 대장암 오가노이드 제조 및 특성화

요약

이 프로토콜은 면역염색에 의한 세포 접착, 오가노이드 형태 및 유전자 발현을 위한 생체 기능성 자기 조립 펩타이드를 평가하는 것을 목표로 합니다. 우리는 결장직장암 세포주를 사용하여 집중적인 테스트를 위한 오가노이드를 얻는 비용 효율적인 방법을 제공할 것입니다.

초록

초단파 자기 조립 펩타이드(SAP)는 세포외 기질과 유사한 나노섬유를 자발적으로 형성할 수 있습니다. 이러한 섬유는 생체 적합성, 생분해성 및 비면역원성인 하이드로겔을 형성할 수 있습니다. 우리는 이전에 SAP가 단백질 유래 모티브로 생체 기능화될 때 결장직장 오가노이드 형성을 지원하는 세포외 기질 특성을 모방할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 생체 기능 펩타이드 하이드로겔은 원래 모체 펩타이드의 기계적 특성, 조정 가능성 및 인쇄성을 유지하면서 세포-매트릭스 상호 작용이 세포 접착력을 높일 수 있도록 하는 단서를 통합합니다. 이 논문은 비용 효율적으로 대장암 오가노이드를 형성할 수 있는 선암암 세포주를 사용하여 세포 접착 및 내강 형성에 대한 다양한 생체 기능 펩타이드 하이드로겔의 효과를 평가하고 특성화하는 데 필요한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 면역염색 및 형광 이미지 분석을 사용하여 세포 접착 및 발광 형성에 대한 생체 기능 펩타이드 하이드로겔 효과를 평가하는 데 도움이 됩니다. 이 연구에 사용된 세포주는 이전에 동물 유래 매트릭스에서 오가노이드를 생성하는 데 활용되었습니다.

서문

최근 몇 년 동안 자가 조립 펩타이드(SAP)가 조직 공학 응용 분야를 위한 유망한 생체 재료로 부상했습니다. SAP는 나노섬유의 자발적 형성, 생체 적합성, 생분해성, 비면역원성 등 고유한 특성을 가지고 있어 스캐폴드 개발을 위한 매력적인 후보입니다¹. SAP는 이전에 다양한 유형의 세포와 함께 사용되었으며, 특히 보고된 초단파 SAP는 30개 이상의 통로를 포괄하는 장기간에 걸쳐 다능성을 유지하면서 줄기세포의 캡슐화를 촉진하고 염색체 수차의 발생률을 최소화했습니다 ^2,3,4. 따라서 오가노이드 배양에서 SAP를 사용할 수 있도록 SAP를 조정하는 것은 합리적인 후속 단계를 구성했습니다.

오가노이드는 단일 만능 세포에서 발생하는 복잡한 3차원 구조입니다. 이러한 구조는 다양한 세포 유형을 생성하며, 이 세포는 체외에서 배아 및 조직 성장의 발달 과정을 복제하기 위해 자체 조직화됩니다 5. 이 혁신적인 프레임워크는 in vitro<....

프로토콜

1. 완충액 및 용액 준비

알림: 명시된 모든 농도는 최종 농도입니다.

1. 소 태아 혈청(FBS)과 페니실린-스트렙토마이신을 각각 10% 및 1%의 최종 농도로 첨가하여 완전한 Iscove의 IMDM(Modified Dulbecco's Medium)을 준비합니다. 4 °C의 어두운 곳에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
2. MgCl₂ (3 mM), 자당 (300 mM) 및 Triton X-100 (0.5 %)을 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합하여 투과화 완충액을 제조합니다. 이 용액을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.
3. 소 혈청 알부민(BSA, 1%), 글리신(0.3M) 및 Tween-20(0.1%)을 PBS에 결합하여 차단 완충액을 준비합니다. 이 용액을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.
4. 멸균 상태에서 초순수로 10배에서 2배 PBS를 희석합니다. 이 용액을 실온에서 6개월 이상 보관하십시오.
5. 펩타이드 분말 3mg을 자외선으로 30분 동안 살균합니다. 초순수 500μL를 추가하여 와류 믹서를 사용하여 용해시킵니다.
   참고: 1x 농도는 3mg/mL가 되므로 최종 농도는 목표 농도의 두 ....

토론

생물의학 연구에서 SAP의 방대한 잠재력은 생체 기능화를 통한 가단성과 적응성으로 강조됩니다. 이러한 광범위한 순열 배열로 인해 특히 오가노이드 연구에서 특정 응용 분야에 대해 가장 유망한 구성을 효율적으로 테스트하고 결정하는 데 문제가 발생합니다. 빠르고 비용 효율적인 솔루션이 가장 중요합니다. 인간 대장 선암에서 유래한 SW1222 세포주는 이러한 집중적인 평가를 위한 핵심 후보로.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015