HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

요약

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

초록

아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)는 중추신경계(CNS)를 조사하기 위한 놀라운 도구입니다. AAV와 같은 혁신적인 캡시드. PHP.eB, 생쥐에 정맥 주사를 통한 CNS의 광범위한 transduction을 보여줍니다. 비교 가능한 형질도입을 달성하려면 중추신경계 실질에 직접 주입하는 것과 비교하여 100배 더 높은 역가(최소 1 x 10¹¹ 게놈 복제/마우스)가 필요합니다. 우리 그룹에서는 AAV를 포함한 AAV 생산. PHP.eB는 부착 HEK293T 세포와 삼중 형질 주입 방법에 의존합니다. 부착 세포로 높은 AAV 수율을 달성하려면 노동 및 재료 집약적인 공정이 수반됩니다. 이러한 제약은 원뿔형 튜브에서 현탁 기반 세포 배양을 위한 프로토콜의 개발을 촉진했습니다. 부착 세포에서 생성된 AAV를 현탁액 생산 방법과 비교했습니다. 형질주입 시약인 폴리에틸렌이민 또는 TransIt을 이용한 현탁액에서의 배양을 비교하였다. AAV 벡터는 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리에 의해 정제된 후 원심 필터를 사용하여 완충액 교환 및 농축에 의해 정제되었습니다. 부착 방법을 사용하면 평균 2.6 x 10¹² 게놈 사본(GC)을 얻을 수 있는 반면, 현탁법과 폴리에틸렌이민은 총 7.7 x 10¹² GC를, TransIt은 총 2.4 x 10¹³ GC를 산출했습니다. 부유세포 시스템과 비교하여 부착체로 생산된 벡터 간의 in vivo transduction 효율에는 차이가 없습니다. 요약하면, 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 도입되어 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄이는 동시에 연구 목적으로 상용 공급업체에서 제공하는 구성 요소를 사용하여 3배에서 9배 더 높은 수율을 달성할 수 있습니다.

서문

아데노 관련 바이러스(AAV)는 1965년에 발견되었으며 이후 수많은 응용 분야에서 사용되고 있습니다¹. AAV는 유전자 및 신경 기능을 연구하거나, 신경 회로를 매핑하거나, 질병에 대한 동물 모델을 생성하기 위해 신경 과학 연구에 적용되었습니다². 전통적으로, 이것은 대부분의 자연적인 혈청형이 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않거나 그렇게 하기 위하여 과다 복용을 필요로 하지 않기 때문에, 관심사의 위치에 직접 주사해서 행해집니다 ^1,2,3.

AAV의 발견과 함께. PHP.B⁴ 및 AAV와 같은 차세대 캡시드. PHP.eB⁵ 및 AAV. CAP-B10⁶의 경우, 간단한 전신 주사를 사용하여 중추신경계(CNS)를 표적으로 할 수 있습니다. 공간 매핑은 AAV의 표적이 되는 세포를 보여줍니다. 셀룰러 수준 ^6,7의 PHP.eB. 특정 프로모터/인핸서와 함께 이러한 캡시드는 신경과학자들이 비침습적 AAV 전달을 통해 유전자 및 뇌 기능을 연구할 수 있는 광범위한 기회를 제공합니다 ^4,8.

AAV에는 더 낮은 용량이 필요합니다. AAV9 (4 x 10¹² GC/^mouse)7에 비해 PHP.eB(일반적으로 1 - 5 x 10¹¹ 게놈 사본(GC)/mouse)는 직접 주입 전략(일반적으로 1 x 10⁹ GC/μL 주입)에 비해 더 많은 벡터를 생성해야 합니다. 대부분의 천연 혈청형은 요오드릭산올 정제 9,10,11,12와 함께 고전적인 부착 세포 배양 시스템을 사용하여 생산할 수 있습니다. AAV의 경우. PHP.eB 이것은 하나의 실험에 충분한 벡터를 얻기 위해 세포를 배양하고 transfection하는 노동 집약적인 과정을 수반한다⁸. 따라서, 원뿔형 튜브의 부유 세포 배양에서 AAV의 생산이 개발되었습니다. 최대 300mL 용량의 코니컬 튜브는 크기가 작아 인큐베이터 공간과 플라스틱을 모두 절약할 수 있습니다. 부유 세포는 15cm 플레이트의 부착 세포보다 배양 및 대량으로 처리하기가 훨씬 쉽습니다. 프로토콜의 transfection 구성 요소는 동일하게 유지됩니다. 따라서, 이전에 부착 시스템과 함께 사용되었던 플라스미드는 현탁 세포에서의 생산에 기초하여 이 프로토콜에서 쉽게 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실의 다른 연구원들에게 성공적으로 이전되어 다양한 캡시드 및 구조물에 성공적으로 사용되었습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 네덜란드 왕립 과학 아카데미(KNAW)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 프로젝트 번호 AVD8010020199126에 따라 동물 실험에 관한 네덜란드 법률을 따랐습니다. 그림 1에는 전체 프로토콜에 대한 개략적인 개요가 나와 있습니다. 세포 파종에서 AAV 정제에 이르기까지 프로토콜을 완료하는 데 6일이 걸립니다.

1. 시약 준비

1. 플라스미드 정제
   1. 플라스미드의 무균성을 보장하기 위해 몇 가지 조정을 통해 제조업체가 설명한 대로 플라스미드 추출을 수행합니다.
   2. 멸균 증류수와 절대 에탄올을 사용하여 70% 에탄올을 준비합니다.
   3. 이소프로판올 원심분리 단계 후 플로우 캐비닛 후드에서 플라스미드를 건조시키고 멸균 70% 에탄올을 튜브에 추가합니다. 에탄올 침전 후 플로우 캐비닛 후드에서 플라스미드를 건조시키고 플라스미드를 멸균 증류수에 재현탁시킵니다. 멸균된 미세 원심분리기 튜브를 사용하도록 주의하십시오.
   4. 정량화, 제한 분석 및 필요한 경우 염기서열분석을 위해 부분 표본을 채취합니다. 돌연변이가 수율에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 역말단 반복(ITR)의 무결성을 확인하는 것이 좋습니다. 시료 농도를 1μg/μL로 조정합니다.
2. 10x 트윈 용해 완충액의 준비
   1. 멸균 증류수 400mL에 Tris 완충액 30.3g과 MgCl_{2.6H 2O}2.03g을 녹이고 pH를 8.0으로 설정하고 총 부피를 450mL로 늘립니다.
   2. Tween 20을 멸균 상태로 유지하고, 후드의 완충 용액에 Tween 20 50mL를 추가하고, 0.2μM 진공 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
3. 요오딕사놀 희석
   1. 요오딕사놀 용액은 60% 농도로 제공됩니다. 시작 솔루션을 사용하여 15%, 25% 및 40% 솔루션을 만듭니다.
   2. 15% 용액의 경우 60% 용액 60mL를 5M NaCl 48mL 및 PBS-MK 48mL(5mM MgCl₂ 및 12.5mM KCl의 5x PBS)로 희석하고 최대 240mL의 증류수를 추가합니다.
   3. 25% 용액의 경우 60% 용액 67mL와 PBS-MK 32mL를 희석합니다. 최대 160mL의 증류수를 추가합니다. 잘 섞고 페놀 레드 용액 1.6mL를 추가합니다.
   4. 40% 용액의 경우 60% 용액 160mL를 PBS-MK 48mL로 희석하고 증류수를 최대 240mL까지 추가합니다. 60% 용액의 경우 페놀 레드 1mL를 60% 용액 100mL에 추가합니다.
4. PBS 5% 자당 용액
   1. 칼슘이나 마그네슘이 없는 DPBS 500mL 병에 자당 25g을 추가합니다. 잘 흔들어 0.2μM 병 진공 필터를 사용하여 걸러냅니다.
5. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000 용액
   1. 400g의 PEG 8000과 24g의 NaCl을 멸균 증류수에 녹이고 최종 부피 1000mL로 조정합니다. 완전히 녹을 때까지 가열하여 저어줍니다. pH 종이를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
   2. 0.2μM 병 진공 필터를 사용하여 필터를 멸균하여 40% PEG 8000 용액을 얻습니다. 여과는 4°C에서 용액 저장소의 점도로 인해 시간이 걸립니다.

2. HEK293 부유세포 배양

1. 청소를 위해 70% 에탄올에 적신 물티슈를 사용하십시오. 생물 안전 후드를 청소하고 세포 배양에 필요한 모든 재료를 준비하고 세척하십시오.
2. 50mL 원뿔형 배양 튜브에서 30mL의 부유 세포 배지를 37°C로 예열합니다. 액체 질소에서 바이러스 생산 세포를 회수합니다. 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 바이알이 완전히 해동되기 직전에 70% 에탄올에 적신 물티슈로 세척하고 바이알을 생물 안전 후드로 옮깁니다.
   참고: 여기에 사용된 바이러스 생산 세포에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.
3. 세포를 예열된 50mL 원뿔형 배양 튜브로 빠르게 옮깁니다. 37°C, 습도 80%, CO₂ 8%, 분당 회전수 200회, 진탕 직경 50mm의 진탕 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 통로 세포, 생존율이 90% 이상이고 세포 밀도가 1-3 x 10⁶ cells/mL 이상이면
   알림: 사용된 인큐베이터의 흔들림 직경은 50mm입니다. 배양 조건은 다른 쉐이킹 직경에 맞게 조정되어야 합니다.
4. 해동 후 3-4 일 후에 통과 세포. 배양 튜브를 확인하여 오염의 징후가 없는지 확인하십시오. 예를 들어, 곰팡이는 변색된(검은색 또는 녹색) 고리로 나타납니다.
5. 1mL 스트리펫을 사용하여 샘플당 400μL의 0.4% 트리판 블루 용액을 준비합니다.
6. 인큐베이터에서 부유 세포를 빠르게 회수할 수 있습니다. 1mL 스트리펫을 사용하여 튜브에서 500μL를 즉시 추출합니다. 부드럽게 위아래로 피펫을 합니다.
7. 준비된 트리판 블루 튜브에 100μL의 셀 현탁액을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합하십시오. 피펫으로 혼합하면 세포가 죽을 수 있으므로 피펫으로 혼합하지 마십시오. 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.
8. 50μL의 트리판 블루 처리된 세포 현탁액을 혈구계 슬라이드에 바릅니다. 총 생존 가능한 세포를 계산하고 다음 날 통과 또는 transfection에 필요한 세포 현탁액 및 배지의 양을 계산합니다.
9. 인큐베이터에서 10-15분 동안 배지를 데웁니다. 가열된 배지에 세포 현탁액을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 3일(즉, 월요일-목요일) 동안 세포를 통과시키는 경우 0.5 x 10⁶ 세포/mL로 설정합니다. 4일(예: 목요일-월요일) 동안 세포를 통과시키는 경우 0.3 x 10⁶ cells/mL로 설정합니다.
   참고: 제조업체에 따르면 바이러스 생산 세포는 26시간마다 두 배가 되며 통과하기 전에 3.5 x 10⁶ 에서 5.5 x 10⁶ 사이여야 합니다. 세포는 통로 20까지 유지될 수 있다.

3. 형질주입

1. 1일차
   1. transfection 전 24시간에 300mL의 배지에서 mL당 1 x 10⁶ 세포를 배양합니다.
2. 2일차
   1. 배지, 플라스미드 및 transfection 시약을 실온으로 데웁니다. 준비할 금액은 표 1을 참조하십시오.
   2. 간단히 말해서 와류 플라스미드와 시약. 준비된 배지인 소용돌이에 플라스미드를 추가합니다. transfection 시약과 소용돌이를 잠깐 추가합니다. 이 단계 후에 혼합물을 휘젓지 마십시오. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 그동안 1일차에 준비한 셀을 계산합니다. 세포는 mL당 2 - 2.5 x 10⁶ 세포여야 하며 생존율> 95%여야 합니다.
   4. 배양 후 한 방울 방식으로 transfection 혼합물을 튜브를 부드럽게 휘젓면서 세포에 추가합니다. 72-96 시간 동안 배양합니다.

4. 세포 채취

1. 5일차
   1. 33 mL의 10x 세포 용해 완충액 (500 mM Tris pH 8, 10 % 트윈 20, 20 mM MgCl₂)을 넣고 부드럽게 흔들어 혼합하고 37 ° C에서 1.5 시간 동안 흔들어 배양합니다.
   2. 4°C에서 3428 x g 으로 60분 동안 원심분리기 0.45μM PES 진공 필터를 통해 여과하여 세포 용해물을 정화하고 정화된 용해물을 필터 용기에 남깁니다.
      참고: 여과 후 선택 사항: 정량적 PCR(Q-PCR)의 경우 50μL의 샘플을 채취합니다.
   3. 90mL의 40% PEG 8000 용액을 360mL의 여과된 세포 용해물에 추가합니다.
   4. 70% 에탄올로 교반 막대를 세척하고 샘플에 추가합니다. 얼음 위나 차가운 방에서 300RPM으로 1시간 동안 저어줍니다. 밤새 젓지 않고 4 °C에서 배양합니다.
      참고: 1시간에서 72시간의 배양 시간이 테스트되었습니다. 배양 시간이 길어지면 전체 단백질 침전에 부정적인 영향을 미칩니다.

5. 요오딕사놀 정화

1. 6일째
   1. 전체 PEG 침전된 배양 부피 샘플을 깨끗하고 큰 원뿔형 튜브와 2820 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리기로 옮깁니다.
   2. 상층액을 버리고 PEG 펠릿을 칼슘 및 마그네슘과 함께 DPBS 15mL에 재현탁시킵니다. 펠릿은 재현탁하기 어렵습니다. 시간을 내어 이 작업을 신중하게 수행하십시오.
   3. 재현탁 부위를 깨끗한 50mL 튜브로 옮깁니다. PEG는 생물 반응기 튜브의 측면에 남아 있습니다. 10mL를 더 넣고 모든 PEG 침전물을 모으도록 주의합니다. 총 부피가 25-30mL인 50mL 용기에 모두 옮깁니다.
   4. 40μL의 DNaseI(10U/μL)을 추가합니다. 인큐베이터에 넣어 1시간 37°C로 가열합니다.
      참고: DNase 배양 후 선택 사항: Q-PCR용 샘플 50μL를 채취합니다.
   5. PEG 침전에 사용된 교반 막대를 염화물 용액과 70% 에탄올로 잘 청소합니다. 다음 실험을 위해 70% 에탄올에 교반 막대를 남겨 둡니다.
   6. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 25mm x 89mm 폴리알로머 튜브에 각 튜브에 15.5mL의 농축 세포 용해물을 채웁니다. 세포 용해물을 첨가한 후 유리 파스퇴르 피펫을 새 것으로 교체합니다.
   7. 15%-60%의 요오드화놀 용액 추가: 15% 요오드산올 용액 9mL를 세포 용해물 아래에 부드럽게 주입합니다. 다음으로 5% 및 25% 요오드산올 용액 40mL를 넣고 마지막으로 5% 요오드산올 용액 60mL를 추가합니다.
   8. DPBS +/+가 있는 주사기를 사용하여 튜브를 채우고 요오드릭산올 층을 방해하지 않도록 주의하면서 대부분의 기포를 제거합니다. 전기 튜브 토퍼를 사용하여 튜브를 밀봉합니다.
   9. 초원심분리기에서 16°C, 490,000 x g 에서 1시간 10분 동안 비스윙 로터에서 원심분리합니다. 초원심분리기에서 꺼내 금속 걸쇠에 튜브를 조립하고 수집 튜브를 준비합니다. 탈수 중 엎질러진 경우 후드의 로터를 여십시오.
   10. 그래디언트당 50mL 튜브 1개(로터 튜브 폐기용), 15mL 튜브 1개(바이러스 수집용), 5mL 주사기, 30G 및 19G 바늘을 준비합니다.
   11. 30G 바늘로 튜브 상단의 구멍을 뚫습니다. 바늘을 제자리에 두십시오. 주사기에 19G 바늘을 놓습니다.
   12. 페놀 빨간색 표시기로 볼 수 있는 40%/60% 인터페이스 바로 아래에 튜브에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 바늘 베벨이 40% 층을 향하고 있는지 확인하십시오.
   13. 자주 사용하지 않는 손을 사용하여 튜브 상단에서 30G 바늘을 제거합니다. 바늘을 비스듬히 대고 바이러스/요오드산올을 천천히 추출합니다. 목표는 3mL에서 4.5mL 사이를 추출하는 것입니다. 40%/투명 층의 중간쯤에서 바늘을 베벨이 아래를 향하도록 돌리고 단백질 층에서 모이지 않도록 계속 추출합니다.
   14. 자주 사용하지 않는 손으로 50mL 튜브를 준비하고 튜브를 50mL 튜브에 넣으면서 바늘을 조심스럽게 빼낸 후 버립니다. AAV/요오딕사놀 현탁액을 최대 15mL까지 채워 DPBS에 5배 희석합니다.
   15. 원심 필터 튜브로 옮기고 3428 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 버리십시오. 필터 홀더를 조심스럽게 제거하고 하단 용기를 쓰레기통에 넣습니다. PBS-5% 슈크로스 15mL를 추가하여 여과하고 재현탁합니다.
   16. 4°C에서 3428 x g 으로 20분 동안 원심분리기 버퍼 교환을 3회 이상 반복합니다. 바이러스(~150-250 μL)를 4 °C(PHP. B 변이체는 최대 3개월) 또는 50μL 분취액으로 분취하여 -80°C에서 장기간 보관합니다.
       참고 : PHP. B 캡시드 변종은 동결/해동에 민감하므로 이를 피해야 합니다.
   17. 이전 프로토콜¹⁰에 설명된 대로 적정을 수행합니다.

결과

대부분의 학술 실험실은 AAV 생산을 위해 부착 HEK293T 세포를 사용합니다 ^8,9. 이는 직접 주입에 소량의 AAV가 필요할 때 비교적 잘 작동하지만, AAV와 같은 전신 캡시드와 유사한 transduction을 달성하려면 100배 더 높은 titer(최소 1 x 10¹¹ GC/mouse)가 필요합니다. PHP.eB입니다.

이 프로토콜에서는 원뿔형 튜브에서 배양된 현탁액 HEK293 세...

토론

AAV의 전신 투여는 중추신경계로의 유전자 전달을 위한 강력한 도구입니다. 그러나 AAV의 생산은 비용이 많이 들고 힘든 과정입니다. 부유 셀을 사용하면 15cm² 플레이트에 HEK293T 부착 배양에 비해 노동력과 플라스틱이 줄어 듭니다. 또한 여기에 구현된 원뿔형 튜브는 다루기 쉽고 실험실 공간 사용을 극대화합니다. 이 프로토콜은 두 명의 연구원에 의해 설정되었으며 이후 실험실의 다른 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363