간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

요약

간질액 흐름을 포함하는 침습적 전면부에서 신경교종 종양 미세환경을 복제하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 유체 압력 헤드를 적용할 수 있는 조직 배양 삽입물에 포함된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔입니다. 침입을 정량화할 수 있으며 세포를 분리하거나 용해할 수 있습니다.

초록

교모세포종 재발은 치료 성공의 주요 장애물이며, 신경교종 줄기세포(GSC)가 외과적 절제술로 접근할 수 없고 기존 화학요법에 내성이 있는 건강한 조직으로 침입하는 것이 원인입니다. 조직 수준 유체 이동 또는 간질액 흐름(IFF)은 종양 미세환경(TME)에 의존하는 방식으로 GSC 침습을 조절하며, IFF와 TME를 모두 통합하는 모델 시스템의 필요성을 강조합니다. 우리는 교모세포종에서 침습성 TME를 복제하기 위한 접근 가능한 방법, 즉 조직 배양 삽입물에 파종된 인간 GSC, 성상교세포 및 미세아교세포로 구성된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔을 제시합니다. 상승된 IFF는 하이드로겔에 유체 압력 헤드를 적용하여 나타낼 수 있습니다. 또한 이 모델은 세포 비율, 유속 또는 매트릭스 강성의 환자 간 또는 환자 내 차이를 복제하도록 조정할 수 있습니다. 침습을 정량화할 수 있으며, 겔을 채취하여 GSC 침습, 유세포 분석, 단백질 또는 RNA 추출 또는 이미징을 포함한 다양한 결과를 얻을 수 있습니다.

서문

교모세포종(glioblastoma)은 임상적으로 이용 가능한 치료법에 의해 완만하게 연장되는 짧은 생존 기간¹이 특징인 파괴적인 질병입니다 ^2,3. 효과적인 치료에 대한 이러한 장애는 주로 절제에 접근하기 어렵고 재발성 종양을 종파할 수 없는 화학저항성 신경교종 줄기세포(GSC)의 고도의 침윤성 특성에 의해 주도된다⁴. 동시에, GSC는 매우 가소성이며, 생존하고 침범하기 위해 종양 미세환경(TME)의 다양한 자극에 반응합니다 ^5,6. 특히, 밀집된 종양과 누출된 혈관 구조는 종양 경계에서 가파른 압력 차이를 생성하여 GSC 침범과 상관관계가 있는 별개의 영역에서 간질액 흐름(interstitial fluid flow, IFF)을 증가시킨다⁷. 이 증가된 IFF는 ^8,9,10....

프로토콜

이 프로토콜은 Virginia Tech Institutional Biosafety Committee에서 정한 지침에 따라 개발되었습니다.

참고: 달리 명시되지 않는 한 BSL-2 세포 배양 캐비닛에서 모든 절차를 수행하십시오. 인간 세포 사용에 대한 지침은 해당 기관의 생물 안전 위원회에 문의하십시오.

1. 겔 준비를 위한 계산

1. 실험에 필요한 조건의 수를 계산합니다.
   참고: "조건"은 용액의 내용물(예: 세포 농도, 콜라겐 농도 등)에 의해 정의되며, 이 예에서 사용된 유체 압력 수두와 같이 외부에서 적용되는 변수가 아닙니다.
2. 각 상태 용액에 필요한 겔의 총 부피를 계산합니다.
   참고: 12mm 직경의 조직 배양 인서트를 사용하는 12웰 겔에 필요한 부피는 인서트당 100-150μL입니다. 침입을 정량화할 때 최소 세 가지 기술적 반복이 권장됩니다. 또한 파이펫팅 오류로 인한 부피 손실을 설명하기 위해 각 조건 솔루션에 추가 반복실험의 부피를 추가합니다.
3. 1.2단계에서 실험에 필요한 겔 용액의 총 부피를 계산합니다.
4. 실험에 ....

토론

TME 모델 조립에는 1) 유사한 조건 사이의 세포 통과 및 세포 분리, 2) 모든 조건에 대한 농축 콜라겐 용액 조립, 3) 각 조건에 대한 겔 구성 요소(세포, 콜라겐, 메타크릴레이트 히알루론산 및 광개시제) 결합 4) 도금 겔, 5) UV 노출 및 열에 의한 가교, 6) 유체 압력 헤드 추가. 18시간 이상 경과한 후에는 유세포 분석, RNA 추출, 단백질 추출, 이미징 또는 기타 다운스트림 응용 분?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Well Tissue Culture Plate, Sterile	Celltreat Scientific Products	229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, Sterile	DOT Scientific	667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA	Thorlabs	M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, Sterile	Celltreat Scientific Products	229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm Diameter	Millicell	PI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Ethanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)	ScienCell Research Laboratories	1801	Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin.
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12587010
BSA (MACS)	Miltenyi Biotec	130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)	Fisher Scientific	25-0719-41
Cell Counting Chambered Slides	Nexcelom Bioscience	CHT4-PD100-002
Cell Scrapers	Biologix USA	70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)	VWR	NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-Speed	Eppendorf	5702 R	Centrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, Corning	Fisher Scientific	07-200-108	V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)	Thermo Fisher Scientific	50116047
Collagen I, High Concentration, Rat Tail	Corning	354249
Collagen I, Rat Tail	Corning	354236	"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)	United States Biological	C7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nm	Thorlabs	COP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips	Amazon	B01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7)	United States Biological	D3760
DMEM, high glucose (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11330032
EVOS FL	Invitrogen	AMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	26140079	For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich)	Millipore Sigma	HT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00
Glioma stem cells	n/a	n/a	Can be patient derived or commercial glioma stem cell lines.
Guava easyCyte HT System	Millipore Sigma	0500-4008	Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich)	Millipore Sigma	H6648
HEPES (1 M) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max	Thorlabs	DC2200	Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)	Thermo Fisher Scientific	62249
Human Astrocytes	ScienCell Research Laboratories	1800	Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	PHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERT	Applied Biological Materials	T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 position	Benchmark Scientific	H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibody	Miltenyi Biotec	130-120-420
LED UV Curing Meter	Gigahertz-Optik	X1-RCH-116	Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Advanced Biomatrix	5269-100MG	Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)	Advanced Biomatrix	5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)	Fisher Scientific	75-997-203	Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & Mg	Quality Biological	119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)	VWR	97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)	Fisher Scientific	SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25200056
ViaStain AOPI Staining Solution	Nexcelom Bioscience	CS2-0106