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요약

이 프로토콜은 효소 해리 및 형광 활성화 세포 분류를 통해 가시쥐(Acomys)에서 골격 및 심장 근육 섬유-지방 생성 전구세포(FAP)를 분리하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에서 얻은 FAP는 근섬유아세포 및 지방세포로 효과적으로 확장되고 분화될 수 있습니다.

초록

뛰어난 복구 프로그램 덕분에 가시 쥐는 재생 의학의 새로운 연구 모델입니다. 섬유지방형성 전구세포(Fibro-adipogenic progenitor)는 지방세포(adipocyte), 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte)로 분화할 수 있는 조직 상주 세포입니다. 섬유-지방 생성 전구세포는 손상 후 세포외 기질 리모델링을 담당하기 때문에 조직 재생을 조율하는 데 필수적입니다. 이 연구는 가시 쥐의 심장 복구 및 골격근 재생에서 섬유-지방 생성 전구 세포의 특정 역할을 조사하는 데 중점을 둡니다. 이를 위해 효소로 해리된 골격근 및 심장 근육의 유세포 분석을 통해 가시 쥐의 섬유-지방 생성 전구 세포를 정제할 수 있도록 프로토콜이 최적화되었습니다. 이 프로토콜에서 얻은 집단은 시험관 내에서 증식할 수 있으며 근섬유아세포(myofibroblast) 및 지방세포(adipocyte)로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 가시쥐의 독특한 특성을 조사하고 이를 Mus musculus 와 비교할 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다. 이것은 이 흥미로운 모델에서 재생 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 통찰력을 제공할 것입니다.

서문

초기에 유난히 연약한 피부와 피부 손상을 복구하는 놀라운 능력으로 인정받은 가시쥐는 Mus musculus 1,2와 비교할 때 근골격계, 신장계, 중추신경계, 심혈관계와 같은 다양한 장기 시스템에서 우수한 재생 능력을 입증했습니다.

섬유지방형성 전구세포(Fibro-adipogenic progenitors, FAPs)는 골격근과 심장근을 포함한 다양한 조직에 존재하는 기질 세포의 하위 집합입니다. 이 세포는 in vivo 및 in vitro 3,4에서 섬유생성 및 지방형성 계통에 전념할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있습니다. FAP는 세포외 기질을 조절하고 복구 과정에 관여하는 다른 세포 유형의 기능을 지원함으로써 조직 재생에 중요한 역할을 합니다. 골격근에서 FAPs는 부상에 대한 반응으로 활성화되고 근육 줄기 세포 분화 및 근육 형성을 촉진합니다 5,6. 심장의 허혈성 손상에서 FAP는 심근의 무결성을 유지하기 위해 흉터 조직을 놓습니다. 근육과 대조적으로, 심장 FAPs는 만성적으로 활성화되어 병리학적 리모델링에 기여한다 7,8.

이전 연구는 가시 쥐의 세포외 기질이 Mus musculus 9,10과 비교하여 재생을 지원하는 다른 구성, 구조 및 특성을 가지고 있음을 보여주었습니다. 근육 및 심장 손상에서 FAPs는 가시 마우스 11,12,13에서 우수한 치유에 기여하는 것으로 나타났습니다. 가시쥐 FAP와 기질의 행동과 조절 제어를 이해하면 재생 능력 이면의 메커니즘에 대한 실마리를 얻을 수 있습니다. FAP는 mus musculus14,15와 같은 다른 동물 모델에서 광범위하게 연구되었지만, 현재로서는 가시 마우스 FAP를 분리하기 위한 발표된 프로토콜은 없습니다. 이러한 프로토콜을 개발하면 이 분야의 상당한 격차를 메우고 연구자들이 가시쥐의 재생 잠재력의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

이 프로토콜은 가시 마우스에서 골격 및 심장 근육 FAP를 분리, 확장 및 구별하기 위한 강력하고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 적합한 고품질 단일 세포 현탁액을 생성합니다. mus musculus FAPs16을 구별하는 데 널리 사용되는 두 가지 방법인 rh-TGFβ1 또는 호환 가능한 상업적으로 이용 가능한 배지를 사용함으로써, 분류된 가시 FAP는 각각 섬유형성 계통 및 지방형성 계통을 따라 분화할 수 있는 능력을 유지합니다(그림 1).

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프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 절차는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물 보호 위원회의 승인과 브리티시 컬럼비아 대학교의 규정에 따라 수행되었습니다. 동물은 표준 조건(12:12 명암 주기, 21-23°C, 40%-60% 습도 수준)에서 밀폐된 병원체가 없는 시설에 수용되었으며 단백질이 풍부한 쥐 식단과 물을 즉시 제공했습니다. 이 연구에는 성체(4-6개월, 50-60g) 암컷 및 수컷 Acomys dimidiatus 마우스가 사용되었습니다. 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 용액 및 완충액 준비

  1. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다.
  2. 4mL의 0.5M EDTA(2mM)와 996mL의 1x PBS(pH = 7.4)를 혼합하여 PBS-EDTA를 제조합니다.
  3. 2.7745g의 CaCl2를 100mL의 뉴클레아제가 없는 물에 첨가하여 250mM CaCl2를 준비합니다.
  4. 분해 완충액 준비: DMEM/F12에 50μg/mL 리베라제, 2.5mM CaCl2 및 5% 소 태아 혈청(FBS)을 혼합합니다.
  5. 488mL의 1x PBS, 2mL의 0.5M EDTA 및 10mL의 FBS를 혼합하여 FACS 완충액을 준비합니다.
  6. FACS 완충액과 요오드화 프로피듐(PI; 1μg/mL)을 혼합하여 생존도 완충액을 준비합니다.
  7. DMEM/F12를 5% FBS 및 1%(v/v) 펜/스트렙과 혼합하여 기본 미디어를 준비합니다.
  8. DMEM/F12를 10% FBS, 1%(v/v) 펜/연쇄상구균 및 2.5ng/mL bFGF와 혼합하여 증식 배지를 준비합니다.
  9. 염기성 배지와 10 ng/mL rh-TGFβ1을 혼합하여 섬유생성 배지를 제조하고,
  10. DMEM/F12와 1% 펜/연쇄상구균 및 시판되는 10x 마우스 지방형성 분화 보충제를 혼합하여 지방형성 매체(1x)를 준비합니다.
  11. 4x PBS에 4% 파라포름알데히드(w/v)를 첨가하여 1% PFA를 준비합니다.
  12. 0.3x PBS 498.5mL와 TritonX-100 1.5mL를 혼합하여 1% PBS-Triton을 준비합니다.
  13. 당나귀 혈청 5%(v/v), BSA 1%(w/v), PBS-Triton 0.3%를 혼합하여 당나귀 차단 완충액을 준비합니다.
  14. Donkey 차단 완충액 2.5mL와 MOM 차단 완충액 2방울을 섞어 Donkey + MOM 차단 완충액을 준비합니다.
  15. 600x PBS에 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 1nM을 혼합하여 DAPI 염색 용액을 준비합니다.

2. 조직 채취

  1. 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 동물을 안락사시킵니다. 가시 마우스의 경우 이소플루란에 이어 CO2 (케이지 부피의 20%/분) 및 척추 탈구를 하여 죽음을 보장하는 것이 좋습니다.
  2. 마우스를 해부 스테이지에 놓고 앙와위 위치에서 70% 에탄올을 철저히 분무하여 마우스 털로 인한 오염을 방지합니다.
  3. 복부 정중선을 2-3cm 수직으로 절개하고 흉곽과 복부 근육을 노출시킵니다. 조직 가위로 xiphoid 돌기의 근육을 자르고 횡격막을 노출시킵니다. 양쪽에서 횡격막과 흉곽을 자릅니다. 지혈제를 사용하여 자른 갈비뼈를 고정하고 벗겨냅니다.
  4. 티슈 가위로 우심방을 흠집내고 20mL 주사기에 부착된 23G 바늘을 심장 정점에 놓고 2mM PBS-EDTA 20mL를 천천히 주입하여 관류합니다.
  5. 심장을 절제하고 얼음 위에 1mm 페트리 접시에 담긴 60x PBS의 찬물로 헹구고 심방을 제거하고 혈액을 최대한 깨끗하게 합니다.
  6. 무릎 관절 위의 피부를 제거합니다. 미세한 집게를 사용하여 근막을 제거하고 대퇴골을 가이드로 사용하여 가위로 대퇴사두근을 분리합니다. 차가운 1x PBS와 함께 별도의 페트리 접시에 넣습니다.
  7. 다른 쪽 다리에 대해 2.6단계를 반복합니다.

3. 조직 소화

  1. 심장용 5mL 수송 바이알에 2mL의 소화 완충액을 추가하고, 2개의 대퇴사두근을 위한 15mL 원심분리 튜브에 4mL의 소화 완충액을 추가합니다.
  2. 페트리 접시 뚜껑에 있는 티슈 가위로 티슈를 1mm3 개 미만으로 다집니다.
  3. 다진 조직을 각각의 소화관에 추가합니다. 저속에서 2초 동안 소용돌이를 섞습니다.
  4. 37 °C에서 부드럽게 회전하고 흔들어 배양합니다.
  5. 20분 후 회전근에서 튜브를 제거하고 조직 조각이 가라앉을 때까지 기다립니다. P1000 피펫으로 50mL 원심분리 튜브에 있는 20mL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액에 상층액을 제거합니다.
  6. 심장 및 근육 소화를 위해 각각 2mL와 4mL의 소화 완충액을 소화 튜브에 채우고 부드럽게 회전하고 흔들어 37°C에 다시 놓습니다.
  7. 3.5 단계에서 3.6 단계를 20 분 후에 한 번 더 반복합니다. 3.5단계에서 상층액을 각각의 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.
  8. 얼음처럼 차가운 FACS 완충액으로 분해 완충액을 담금질하여 60분 후에 분해를 중지합니다.
  9. 50mL 원심분리기 튜브 위에 있는 40μm 세포 여과기를 통해 분해 현탁액과 상층액을 여과합니다. FACS 완충액으로 최대 40mL를 충전할 수 있습니다.
  10. 셀 현탁액을 500 x g 에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 3mL의 ACK 용해 완충액에 재현탁시킵니다. 얼음에서 5분 동안 배양하고 FACS 완충액으로 최대 40mL를 보충합니다.
  11. 500 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅합니다.
  12. 0.5mL의 FACS 완충액에 재현탁하고 세포가 고르게 분산되도록 위아래로 피펫팅합니다.
  13. 셀 스트레이너 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에서 40μm 필터를 통해 현탁액을 여과합니다.

4. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 염색

  1. 단색 및 FMO(Fluorescence-Minus-One) 대조군의 경우 사전 라벨링된 1.5mL 원심분리 튜브에서 2배 작업 농도로 30μL의 염색 완충액(FACS 완충액에 희석된 항체)을 준비합니다. 항체 염색 완충액 설정에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
  2. 근육과 심장에 대한 단색과 FMO 컨트롤을 별도로 준비합니다.
  3. 30μL의 단색 및 FMO 제어 염색 완충액을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 20μL의 FACS 버퍼를 보충합니다.
  4. 시료 FACS 염색의 경우 1.5mL 원심분리 튜브에 2배 작동 농도로 0.5mL의 염색 완충액(FACS 완충액에 희석된 항체)을 준비합니다.
  5. 10 μL의 셀 현탁액을 단색 및 FMO 제어 웰에 추가합니다. 세포 현탁액의 나머지 부분에 염색 완충액을 추가하고 재현탁합니다.
  6. 4 °C에서 30분 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다.
  7. 웰에 100μL의 FACS 완충액을 채우고 시료 튜브에 2mL의 FACS 완충액을 충전합니다.
  8. 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.
  9. 4.7단계와 4.8단계를 반복합니다.
  10. 세포 펠릿을 생존도 완충액에 재현탁시킵니다. 단색 및 FMO 제어의 경우 100 μL, FACS 분류 시료의 경우 1 mL.
  11. 1.7mL 원심분리 튜브에 300μL의 증식 매체를 추가하여 수집 튜브를 준비합니다.

5. 형광 활성화 세포 분류

  1. 게이팅 전략: FSC 사용 vs. SSC(로그)를 사용하여 파편을 제거합니다. FSC-H 사용 대 FSC-A는 단일항을 게이트합니다. CD31 사용 vs. 생존 가능한 세포와 계통 음성 세포를 게이트하는 PI. PDGFRα를 사용하여 FAP를 게이트합니다(그림 2).
  2. 미리 준비된 수집 튜브로 분류합니다.

6. 조직 배양

  1. 수집된 세포를 800 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  2. P1000 피펫으로 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
  3. 펠릿을 배양 배지(250μL/웰)에 재현탁시키고 48웰 조직 배양 플레이트에서 25k 세포/웰로 파종합니다.
  4. 인큐베이터에서의 배양(37°C, 5% CO2). 세포가 80% 밀도에 도달할 때까지 3일마다 배지를 교체합니다.

7. 섬유화 분화

  1. 세포를 처리할 준비가 되면 염기성 배지와 1x DPBS를 사용하기 전에 따뜻한 목욕 또는 실온에 넣으십시오.
  2. 배양 매체를 흡인합니다.
  3. 200μL의 1x DPBS로 두 번 헹굽니다.
  4. 200μL의 염기성 매체로 한 번 헹굽니다.
  5. 250 μL의 섬유질 또는 염기성 매체를 각 웰에 추가합니다.
  6. 세포를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)로 되돌립니다.
  7. 48시간 후에 분화를 중지하십시오.

8. 지방발생 분화(Adipogenic differentiation)

  1. 세포를 치료할 준비가 되면 염기성 배지, 지방 배지 및 1x DPBS를 사용하기 전에 따뜻한 목욕 또는 실온에 두십시오.
  2. 배양 매체를 흡인합니다.
  3. 200μL의 1x DPBS로 두 번 헹굽니다.
  4. 200μL의 염기성 매체로 한 번 헹굽니다.
  5. 400 μL의 지방 생성 또는 염기성 매체를 각 웰에 추가합니다.
  6. 인큐베이터(37°C, 5% CO2)로 돌아갑니다.
  7. 2일마다 웰에서 피펫으로 200μL 배지를 제거하고 200μL의 신선한 지방 생성 또는 염기성 배지를 추가합니다.
  8. 골격근 FAP의 경우6일째 , 심장 FAP의 경우 14일째 되는 날에 분화를 중지합니다.

9. 면역염색

  1. 배지를 흡입하고 250μL의 1x PBS로 두 번 헹구어 분화 분석을 중지합니다. 세포 분리를 방지하기 위해 3mL 주사기에 부착된 18G 바늘로 모든 세척을 수행합니다.
  2. 웰당 250μL의 4% PFA를 추가하고 실온에서 7분 동안 배양합니다.
  3. PFA를 제거하고 3μL의 250x PBS로 매번 5분 동안 1번 헹굽니다.
  4. 마지막 세척 시 1x PBS를 흡인하고 250μL의 Donkey + MOM 차단 완충액을 추가합니다.
  5. 실온에서 60분 동안 배양합니다.
  6. 웰당 100μL의 최종 부피를 위해 Donkey 차단 완충액(anti-SMA 및 anti-perilipin)에 1차 항체 염색 용액을 준비합니다.
  7. 염색 우물을 흡인합니다. 해당되는 경우 Donkey + MOM 차단 버퍼를 잘 제어하도록 둡니다.
  8. 각 웰에 1차 항체 염색 용액을 추가합니다.
  9. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  10. 다음 날, 1x PBS로 매번 5분 동안 3번 세척합니다.
  11. Donkey 차단 완충액에 웰당 최종 부피가 100μL인 2차 항체 염색 용액을 준비합니다.
  12. 마지막 세척을 흡인하고 모든 웰에 2차 항체 염색 용액을 추가합니다.
  13. 실온에서 45분 동안 배양합니다(샘플은 이 시점부터 빛으로부터 보호해야 함).
  14. 1x PBS로 매번 5분 동안 3번 세척합니다.
  15. 마지막 세척액을 흡입하고 250μL의 DAPI 염색 용액을 추가합니다.
  16. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  17. DAPI 염색 용액을 제거하고 1x PBS로 5분 동안 한 번 세척합니다.
  18. 각 웰에 100μL의 Fluoromount-G를 추가합니다.
  19. 증발을 최소화하기 위해 뚜껑과 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 이미징할 때까지 빛으로부터 보호되는 4 °C에서 보관하십시오.
  20. 현미경으로 본 이미지(그림 3 및 그림 4).
    참고: 당나귀 혈청은 이 프로토콜에 사용되는 당나귀 유래 2차 항체에 대한 종 특이적 차단제로서 완충액을 차단하는 데 사용됩니다. mouse-on-mouse 차단 시약은 마우스에서 발생하는 anti-SMA primary 항체에 대해 사용됩니다.

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결과

골격근 및 심장 FAP를 분리하고 배양하기 위한 이 프로토콜의 회로도는 그림 1에 요약되어 있습니다. 조직 채취의 경우 간 색이 짙은 빨간색에서 옅은 노란색으로 변하는 것은 일반적으로 성공적인 관류를 나타냅니다. 가시 쥐의 지정된 연령대에서 심장 무게는 일반적으로 약 200mg이고 대퇴사두근은 약 350mg입니다.

3.5-3.7 단계에?...

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토론

가시 쥐 조직은 조직 해리의 스트레스에 더 민감하며, 이 프로토콜에는 세포 생존력을 향상시키기 위해 스트레스를 최소화하는 것을 목표로 하는 여러 측면이 있습니다. 연속 효소 해리 기법은 필요한 효소의 농도를 낮추기 위해 시료 준비에 사용됩니다. 효소 소화가 진행됨에 따라 효소 활성은 감소합니다. 신선한 효소로 대체하면 전체 소화에 걸쳐 일관된 효소 활성을 ...

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공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

FACS 프로토콜 최적화에 대한 전문 지식과 도움을 주신 UBC flow core의 Andy Johnson과 Justin Wong, 그리고 가시쥐 치료를 위한 UBC Biomedical Research Center 동물 시설 직원에게 감사드립니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 만들어졌습니다. 그림 2 는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 만들어졌습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogen15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubesVWR87003-294
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
20 mL syringeBD309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD3571
40 μm cell strainerFalcon352340
48 well flat-bottom tissue culture plateFalcon53078
5 mL polypropyleneFalcon352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
5 mL syringeBD309646
50 mL centrifuge tubeFalcon352070
60 mm Petri dishFalcon353002
96 well V-bottom tissue culture plateCorning3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferGibcoA10492-01
Anti-perilipin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
Bovine serum albuminSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
CentrifugeEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Donkey serumSigmaS30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasersBeckman coulterB52102
Fetal bovine serumGemini100-500
Fine scissorsFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForcepsFST11051-10
HemostatFST91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)Gibco13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Inverted microscope - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SupplementSTEMCELL technologies5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydeSigmaP1648-500g
Penicillin-StreptomycinGibco15140–122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Propidium iodide (PI)InvitrogenP3566
Transport vial 5mL tubeCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

참고문헌

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