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말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.
요약
이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 이식된 배근 신경절(DRG)을 수확하고 배양하는 기술을 제공합니다.
초록
통증의 가장 흔한 말초 신경 세포 특징은 자극 역치가 낮아지거나 배근 신경절(DRG)에서 말단 신경이 과민해지는 것입니다. 이러한 과민증의 제안된 원인 중 하나는 말초 조직의 면역 세포와 뉴런 간의 상호 작용과 관련이 있습니다. 체외 모델은 이러한 메커니즘이 어떻게 통각 수용기 과민증을 유발하는지 이해하는 데 기초적인 지식을 제공했습니다. 그러나 체외 모델은 효능을 인간에게 적용해야 하는 과제에 직면해 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 생리학적, 해부학적으로 관련성이 있는 in vitro 모델이 48웰 플레이트의 3개의 격리된 구획에서 온전한 DRG(dorsal root ganglia)의 배양을 위해 개발되었습니다. 1차 DRG는 인도적 안락사 후 성인 Sprague Dawley 쥐에서 수확됩니다. 과도한 신경근을 잘라내고 DRG를 배양에 적합한 크기로 절단합니다. 그런 다음 DRG는 천연 하이드로겔에서 성장하여 모든 구획에서 강력한 성장을 가능하게 합니다. 이 다중 구획 시스템은 신경 세포와 면역 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 DRG 세포체를 신경돌기에서 해부학적으로 적절하게 분리하고, 생리학적으로 관련된 세포 유형 및 기계적 특성을 제공합니다. 따라서 이 배양 플랫폼은 치료 격리 전략을 조사하기 위한 유용한 도구를 제공하며, 궁극적으로 통증 예측을 위한 개선된 스크리닝 접근법으로 이어집니다.
서문
만성 통증은 전 세계적으로 장애와 실직의 주요 원인입니다1. 만성 통증은 전 세계 성인의 약 20%에게 영향을 미치며 상당한 사회적, 경제적 부담을 초래하고 있습니다.2 미국에서 매년 총 비용은 5,600억 달러에서 6,350억 달러 사이로 추산됩니다3.
만성 통증 환자가 나타내는 주요 말초 특징은 신경의 자극 역치가 낮아져 신경계가 자극에 더 잘 반응한다는 것입니다 4,5. 자극 역치가 낮아지면 이전에는 통증이 없었던 자극에 대한 고통스러운 반응(allodynia) 또는 고통스러운 자극에 대한 반응이 높아질 수 있습니다(통각과민증)6. 현재의 만성 통증 치료법은 효능이 제한적이며, 동물 모델에서 성공한 치료법은 통증 발현의 기계론적 차이로 인해 인간 대상 임상시험에서 실패하는 경우가 많다7. 말초 감작 메커니즘을 보다 정확하게 모방할 수 있는 시험관 내 모델은 새로운 치료제의 번역을 증가시킬 수 있는 잠재력을 ....
프로토콜
DRG 수확은 네브래스카-링컨 대학교(University of Nebraska-Lincoln)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었습니다. 생후 12주(~250g)의 암컷 Sprague Dawley 쥐를 연구에 사용했습니다. 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 다중 구획 장치 제작 및 조립
- 다중 구획 장치의 컴퓨터 지원 설계 및 3D 프린팅
참고: MC 장치는 DRG 세포체와 신경돌기를 분리하기 위한 3개의 구획으로 구성됩니다(그림 2A). MC 장치는 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그러나, 본 명세서에는 3D 프린팅을 가능하게 하기 위해 STL 파일(보충 코딩 파일 1)이 제공된다. MC 인쇄를 완료하는 데 1일이 걸립니다. - 호환되는 소프트웨어를 사용하여 MC의 STL 파일을 Resin 3D 프린터에 업로드합니다.
참고: 인쇄에 이상적인 재료는 고온 수지입니다. 고온 수지 사용의 주요 장점은 생체 적합성이 있고 고압멸균 및 재사용이....
대표적 결과
본 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 DRG를 수확하고 배양하는 기술을 설명했습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 성체 쥐에서 채취한 DRG를 잘라내어 ~0.5mm로 절단했습니다. 그런 다음 트리밍 및 절단된 DRG를 MC 장치의 소마 영역에 있는 하이드로겔에 삽입하고(그림 2) 신경돌기 정량 분석 전에 27일 동안 배양했습니다. D.......
토론
이 프로토콜은 성체 Sprague Dawley DRG를 수확하여 3D 천연 하이드로겔에서 배양하는 방법을 설명합니다. 이 방법과는 대조적으로, 생쥐와 랫드에서 DRG를 채취하는 다른 접근법은 척추를 분리하는 것입니다. 절제된 척추를 반으로 자르고 척수를 제거하여 DRG 23,24,25를 노출시킵니다. 척수의 손상은 혈액 공급을 제한하며, 이는 DRG와 .......
공개
이 연구의 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 말
이 연구는 NSF Grant(2152065)와 NSF CAREER Award(1846857)의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 프로토콜에 기여한 Wachs Lab의 모든 현재 및 과거 구성원에게 감사를 표하고 싶습니다. 그림 1 의 다이어그램은 Biorender로 만든 것입니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
| 10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 - 7.5 pH | |
| 24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
| 3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
| 48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
| Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
| Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
| Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
| Form cure | Form Labs | curing agent | |
| Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
| Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
| Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
| Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
| Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
| Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
| Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 - 115 % methacrylation |
| Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
| Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
| pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
| Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
| Rat | Charles River | ||
| Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
| Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
| Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
| Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
| Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
| Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
| Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
| UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
참고문헌
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
- Goldberg, D. S., Mcgee, S. J.
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