Method Article
* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
이 백서는 테더링된 광유전학 또는 섬유 측광 실험을 위한 최소한의 수정으로 표준 설치류 케이지에서 구현할 수 있는 대체 뚜껑 및 케이지 수정과 함께 자동 공급 시스템의 설계, 조립 및 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 공급 시스템은 시간 제한 공급 및/또는 칼로리 제한을 위한 비용 효율적인 도구를 제공합니다.
간헐적 단식과 시간 제한 칼로리 제한이 체중 조절 및 노화 결과에 미치는 영향을 둘러싼 연구가 사회와 실험실 모두에서 추세에 있습니다. 실험실에서 시간 제한 섭식 및/또는 칼로리 제한을 연구하기 위해 할당된 양의 음식을 예정된 시간 간격으로 분산시킵니다. 설치류의 일정 먹이를 주는 현재 기술에는 게이트 식품 입력 포트가 있는 특수 케이지, 시간 잠금 디지털 호퍼 또는 수동 식품 배달이 포함됩니다. 이러한 실험을 위한 특수 장비는 비용이 많이 들 수 있으며 수동 수유는 종종 조사관이 늦은 밤/이른 아침 시간대에 와야 하므로 장기간의 연구를 할 수 없습니다. 여기에 설명된 자동 급식 시스템은 최소한의 수정으로 표준 설치류 케이지에서 구현할 수 있는 시간 제한 수유 및/또는 칼로리 제한을 위한 비용 효율적인 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 표준 마이크로 아이솔레이터 케이지 뚜껑(마우스, 햄스터, 쥐 또는 기니피그 케이지 뚜껑)이 장착된 기성품 자동 공급기를 사용하며 동물의 가정 케이지에서 프로그래밍된 시간 간격으로 원하는 사료 할당량을 투여할 수 있습니다. 우리의 디자인은 다양한 피더 또는 케이지 치수의 약간의 변화를 수용하도록 수정할 수 있습니다. 당사는 공급 시스템을 위한 설계, 조립 및 프로토콜과 함께 테더링된 광유전학 또는 섬유 측광 실험을 위한 대체 뚜껑 및 케이지 수정을 제공합니다.
간헐적 단식은 신진대사 및 노화 연구의 중요한 영역입니다. 수유와 일주기 리듬의 적절한 정렬은 체중에 대한 식단의 효과를 바꿀 수 있습니다 1,2,3,4. 또한, 간헐적 단식을 장기간 지속하면 수명이 늘어나고 노화 관련 질환이 개선되는 것으로 나타났습니다 5,6,7,8. 장기 단식 프로토콜(>20일)을 시행하는 연구에는 일반적으로 특수 장비가 필요합니다. 예정된 수유 프로토콜에 따라 수동으로 음식을 배달하는 것이 가능하지만, 이를 위해서는 조사관이 장기간 수많은 근무 외 시간에 참석해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 4시간 간격인 세 번의 수유 시간은 오후 8:00, 오전 12:00, 오전 4:00에 수동 배송이 필요합니다. 며칠 이상 지속해야 하는 규정 준수 문제일 수 있습니다.
실험실 설치류를 위한 수동 식품 배달의 대안은 1) 식품에 대한 자동 게이트 접근이 가능한 특수 케이지 또는 2) FED39와 같은 식품에 대한 자동화 및 프로그래밍된 접근을 제공하는 디지털 호퍼 시스템입니다. 게이트 식품 접근이 가능한 케이지 시스템은 비용이 많이 들고 일부는 장기 연구를 위한 적절한 가정용 케이지 환경을 제공하지 않습니다. 예를 들어, 기존의 작동 컨디셔닝 박스는 자동 음식 배달이 가능하지만 장기 주택에 적합하지 않은 철사 강판 바닥이 있습니다. Research Diets의 BioDAQ 시스템은 게이트 외부 포트를 통해 음식과 물을 제공합니다. 프로그래밍 가능한 자동 게이트를 통해 장기간 예정된 섭식 또는 음용 연구가 가능하지만 이 시스템은 비용이 많이 드는 투자입니다. 기계화된 호퍼 시스템은 자동화된 예정된 공급 프로토콜을 위한 또 다른 도구입니다 9,10. 인용 된 두 가지 기계화 호퍼는 가정용 케이지 생활 공간을 줄인다는 경고와 함께 제공됩니다. 음식이 제한된 배고픈 동물은 먹이 기구를 씹을 수 있으며 케이지 파편은 장기 연구를 위한 호퍼 역학을 방해할 수 있습니다. 마지막으로, Takahashi 연구 그룹이 Phenome Technology와 함께 개발한 기계화 호퍼는 장기 정기 섭식 연구를 위해 특별히 설계되었습니다3. 이 시스템에서 기계화 된 호퍼는 음식을 배달하는 슈트가있는 표준 케이지의 와이어 랙 위에 배치됩니다. 그러나 페놈 시스템은 패치 케이블에 묶인 동물(광유전학/섬유 측광 실험)에 유연성을 제공하지 않으며 여기에 설명된 자동 공급 장치에 비해 상대적으로 비쌉니다.
예정된 수유 프로토콜에 만연한 문제에 대응하여 우리는 비용 효율적인 해결책을 제안합니다. 당사의 자동화 시스템은 미리 결정된 간격으로 정확한 음식 배달을 용이하게 합니다. 시중에서 판매되는 자동 어류 사료 공급기와 함께 3D 프린팅 부품을 결합하여 마이크로 아이솔레이터 상단을 사용하는 독립형 설치류 케이지에 장착할 수 있는 DIY(Do-It-Yourself) 외부 공급 시스템을 고안합니다. 여기에 설명된 먹이 시스템 및 부품은 독립형 케이지가 미세 절연체 상단을 사용하는 경우 쥐, 쥐, 햄스터 또는 기니피그와 같은 설치류 케이지에 직접 적용할 수 있습니다. 케이지의 크기가 다양하기 때문에 배치가 약간 다를 수 있지만 3D 프린팅 브래킷, 공급 시스템 및 외부 물병 디자인은 일반적으로 미세 절연체 뚜껑이 있는 독립형 설치류 케이지에 적용할 수 있습니다.
한 가지 예시로 자동 공급기를 소개하지만, 다른 많은 기성품 자동 공급기를 사용할 수 있으며 3D 프린팅 부품을 약간 변경하여 모듈식 시스템에 장착할 수 있습니다. 3D 프린팅 홀더를 대체 피더로 쉽게 조정하거나 케이지 치수를 약간 변경할 수 있도록 함께 제공되는 STL 파일로 수정 가능한 3차원 SolidWorks 파일을 증명합니다.
자동 급이통의 외부 배치는 가정용 케이지 내에 완전한 공간을 제공하고 동물을 방해하지 않고 급식기의 분리, 살균 및 재장전 또는 교체를 가능하게 합니다. 자동 공급 시스템은 장기 기록에 효율적이고 저렴하며 다양한 시간 제한 공급 및/또는 칼로리 제한 프로토콜을 준수할 수 있습니다. 우리는 샘플 데이터와 함께 공급 시스템을 구현하기 위한 케이지 어셈블리, 설계 및 프로토콜에 대한 자세한 기술 도면을 제공합니다. 둘째, 광유전학 또는 섬유 측광 실험을 위해 패치 케이블에 묶인 동물과 함께 자동 급이기를 사용하기 위한 표준 케이지를 수정하기 위한 일련의 지침을 제공합니다.
모든 절차는 매사추세츠 대학교 애머스트 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 표준 마이크로 아이솔레이터 케이지 덮개에 자동 공급기 조립(그림 1)
그림 1: 자동 급지대 브래킷과 케이지 덮개 수정 및 조립. (A) 자동 급지대 브래킷의 기술 도면(3D 배율에 대해서는 보충 파일 1 의 SolidWorks/STL 파일 참조). (B) 왼쪽에서 오른쪽으로, 20 x 25mm 구멍이 있는 케이지 상단; 케이지 상단에 설치되고 Petbank 자동 공급기로 장착된 브래킷. (C) 물병이 있는 표준 와이어 랙에 떨어뜨린 식품 펠릿이 있는 케이지에 조립된 Petbank 자동 공급기. 스케일 바 = 25cm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 기성품 자동 공급 장치 예제의 프로그래밍 및 사용
3. 자동 공급기가 있는 밧줄로 묶인 동물을 위한 수정된 케이지 시스템
그림 2: 케이지 상단에 아크릴 판 조립. (A,B) 아크릴 플레이트 및 피더 포트 플러그의 기술 도면. (C) 구멍이 뚫린 인서트와 필터가 있는 왼쪽, 표준 케이지 상단. 중앙, 천공된 인서트 및 필터 제거(늑골이 있는 그리드는 화살표로 표시된 선을 따라 잘라내야 함). 오른쪽, 아크릴 판이 제자리에 끼워졌습니다. (D) 완전한 뚜껑 조립. 눈금 막대 = 25cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 물병 브래킷 어셈블리. (A) 3D 프린팅된 물병 브래킷의 기술 도면. (B) 케이지 개조 및 물병 브래킷 조립; (C) 브래킷이 설치되었습니다. (D) 완전한 케이지 어셈블리. 스케일 바 = 10cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 오토피더가 있는 전체 케이지 어셈블리 요약. (A) 와이어 랙이 있는 표준 케이지, (B) 테더링된 동물을 위한 수정된 케이지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
암컷 마우스의 불임을 유도하기 위한 칼로리 제한 연구(21일)(오토피더 및 케이지 설계, 그림 4A)
만성 에너지 결핍은 포유류의 생식력을 억제하기에 충분하며, 이러한 반응은 설치류와 인간 모두에게 보존되어 있습니다11,12. 이 연구에서는 장기적인 체중 감소를 유도하기 위해 칼로리 제한을 사용합니다. 15-18주 된 성체 암컷 C57BL/6 마우스는 단독 주택으로 12:12시간 라이트:다크 사이클을 진행하고 Zeitgeber Time 12(ZT12)에 소등을 해제했습니다. 먹이가 들어 있는 철사 선반은 기준 음식 섭취량인 3.80 ± 0.64g/일(평균 ± SE)을 설정하기 위해 일주일 간격으로 각 동물에 대해 매일 무게를 잰다. 다음으로, 체중 감소를 유도하기 위해 음식을 제한했습니다. 식품은 세 부분으로 나누어 배급하고 자동 공급기에 의해 ZT 12, 16 및 20의 세 가지 간격으로 분배되었습니다(케이지 구성, 그림 4A). 초기 48시간 동안 동물은 기준 음식 섭취량의 50%로 제한되었습니다. 그런 다음, 동물들은 다음 19일 동안 기준 사료의 ~70%로 제한되었으며, 기준선 체중의 80-90%를 유지하기 위해 제한의 후반부에 약간의 조정이 있었습니다(그림 5A, 하단).
ZT 0과 ZT 1 사이에서, 0.1M 인산염 완충 식염수가 함유된 질 세척으로 채취한 세포의 조직학적 특성화에 의해 배란 주기를 단계화하기 위해 동물의 무게를 측정하고 평가했습니다. 사이클 길이는 80-90% 체중 감소 전과 11일 동안 최소 11일 동안 모니터링되었습니다. 10% 이상의 지속적인 체중 감소는 이전에 발표된 바와 같이 암컷 마우스에서 불임을 유발하기에 충분했다11.
자동 공급기는 적절한 회전과 음식 배달을 위해 매일 조사되었습니다(프로토콜 단계 3.1). 바닥에 남아 있거나 철사 선반에 남아 있는 음식은 모두 버렸습니다. 여기에 프로파일링된 예시 피더에는 16개의 챔버가 있으며 세 가지 간격으로 음식을 배달하도록 설정할 수 있습니다( 재료 표 참조). 우리는 챔버에 맞는 차우의 최대 부피가 2g이라고 결정했으며, 이는 자르거나 크기에 맞게 주문할 수 있습니다. 우리는 또한 프로그래밍된 시간에 도달하면 음식 배달이 ~10초가 걸린다는 것을 확인했습니다. 바닥 문이 완전히 열리는 데 7초가 걸리고 챔버가 개구부 위로 이동하여 음식 펠릿을 분배하는 데 3초가 더 걸립니다. 문이 열리고 빈 철망 선반에 음식 알갱이가 떨어지는 것과 동시에 소음이 발생합니다(비디오 1, 녹음 포함).
21일 동안 우리는 Petbank의 이 특정 사료 공급기를 사용하여 회전 및 음식 배달의 완전한 정확성을 관찰했습니다(Table of Materials). 테스트 당시 피더는 처음 사용한 지 3개월에서 6개월 사이였으며 내부 충전식 배터리는 21일 시험 기간 동안 완전 충전 표시를 유지했습니다. 이것은 상대적으로 작은 피더 샘플(n = 4)이었기 때문에 이후에 10개의 자동 피더로 21일 동안 또 다른 연구를 수행했으며 일치하는 비율로 음식을 분배하도록 설정했습니다. 후속 연구는 피더를 처음 사용한 후 10개월 후에 수행되었습니다. 21일 동안 한 피더는 15일째에 단일 막대의 전력(~25% 전력 손실)을 잃었고 다른 하나는 17일째에 단일 막대를 잃은 반면, 나머지 8개의 피더는 21일 내내 완전 충전 표시를 받았습니다. 예제 피더의 전력 수준은 4개의 막대로 표시됩니다. 우리의 정량화는 각 막대가 25%의 전력을 나타낸다고 가정합니다. 초기 테스트와 마찬가지로 후속 연구의 피더는 연구 기간 동안 오류 없이 회전과 음식 배달을 다시 수행했습니다.
그림 5: 자동 공급기를 사용한 칼로리 제한 기간 동안 암컷 마우스에서 오버레이된 발정 사이클링 데이터가 있는 체중 궤적. (A) 자동 급식기를 사용하여 세 가지 시점(4시간 간격, 소등 시 시작)에 걸쳐 기준 음식 섭취량의 50-70%를 전달하기 위해 자동 급식 장치를 사용한 평균 체중 감량 궤적(아래). 체중 감량과 연계된 대표적인 발정 주기 데이터(위). 회색 강조 표시는 시작 체중의 10% 이상의 체중 감소를 나타냅니다. 화살표는 와이어 랙에 음식을 채우고 자동 공급기를 제거하여 임시 식품 접근으로 돌아가는 것을 나타냅니다. (B) 체중 감량 중 발정적인 사이클링; 동물이 1%에서 10% 사이일 때 diestrus의 % 시간(오픈 바) 체중 감소 대 >10% 체중 감소(회색 막대, 참고: diestrus에서 체포되는 것은 불임의 징후임) n = 4. (C) 체중 감량 대 사이클링의 폭포 그래프. 최대 8%의 체중 감소로 동물의 100%가 가임력 및 사이클링을 한 반면, 20%의 체중 감소에서는 동물의 100%가 비순환 및 불임이었습니다. 약어: P = 발정기; E = 발정; D = 디스트러스. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 문이 열리고 음식물 알갱이가 빈 철사 선반에 떨어지는 것을 나타내는 소음. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 자동 피더 브래킷에 대한 기술 도면 및 SolidWorks + STL 파일이 포함된 Zip 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 아크릴 판의 기술 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 포트 플러그에 대한 기술 도면 및 SolidWorks + STL 파일이 포함된 Zip 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: 기술 도면이 포함된 Zip 파일, 물병 브래킷 및 물병 홀더에 대한 SolidWorks + STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
전임상 동물 모델에서 칼로리 제한은 신진대사를 정밀하게 조작하고 연구할 수 있는 강력한 실험 도구입니다. 지속적인 체중 감량은 비만, 당뇨병, 노화, 생식력 및 폐경(생식 노화의 일종)에 영향을 미치며, 이 모든 것은 중요한 번역 종점입니다. 그러나 칼로리 제한 패러다임은 장기간 지속하기 어려울 수 있습니다. 이 원고에서는 실험실 환경에서 장기적인 칼로리 제한을 달성할 수 있는 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다. 기성품 자동 급식기를 표준 마이크로 아이솔레이터 뚜껑이 있는 설치류 케이지에 연결하는 지침이 제공됩니다. 모이통은 동물의 집 우리에 조립되며 예정된 시간에 음식을 배달하도록 프로그래밍되어 있습니다. 예정된 음식 배달은 음식 접근의 양과 시간을 제어하며 직원이 방에 들어올 필요가 없습니다. 또한 비용 효율적인 시스템은 장기간(수개월) 동안 실행할 수 있어 실험실 환경에서 장기적인 칼로리 제한을 달성할 수 있는 능력을 향상시킵니다.
최근 신경 과학의 발전으로 연구자들은 깨어 있고 행동하는 동물의 섭식을 촉진하는 뉴런을 조작하거나 기록할 수 있습니다. 구체적으로, 영양 뉴런의 섬유 측광 기록(생체 내 기록 기술)은 신경 활동을 촉진하기 위해 단식한 다음 다시 먹이를 공급하여 신경 활동의 변화를 조사하는 순서로 수행되었습니다 13,14,15. 동물의 집 우리(16)에서 생체 내 녹음을 수행하는 것이 가장 좋지만, 패치 케이블에 묶여 있는 동안 이동성을 제공하기 위해 외부 경기장에서 수행되는 경우가 많습니다. 더욱이, 생체 내 기록은 문이 있는 음식에 접근할 수 있는 수단 없이 방에 들어가는 핸들러에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 섭식 회로에서 뉴런의 측광 기록에 대한 두 가지 혼란스러운 문제를 해결하기 위해, 우리는 자동 공급기(프로토콜 섹션 3 및 4)에 연결된 연장된 기간 동안 묶인 동물을 수용하기 위한 가정용 케이지 변형을 설계했습니다. 이 접근 방식의 한계는 케이지 덮개 삽입 설계에 레이저 절단기가 필요하다는 것입니다. 회전식 도구와 스코어링 장치를 사용하여 아크릴 인서트를 절단할 수 있지만 도구는 작은 탭과 얇은 슬릿을 생성하지 못할 수 있습니다.
여기에 설명된 공급 시스템에는 제한 사항이 있습니다. 즉, 조립에는 3D 프린팅 부품이 필요합니다. 또한, 예시 자동 공급기의 시계는 24시간 주기로 작동하므로, 일주기 연구를 위한 음식 전달 타이밍은 동물의 자유 실행 기간에 수동으로 정렬되어야 합니다(17). 마지막으로, 이 장치는 16개의 챔버와 3개의 프로그래밍된 시간 간격으로 제한됩니다. 피더는 음식을 분배합니다. 소비를 모니터링하지 않습니다. 정해진 시간 동안 섭취하지 않은 음식은 케이지 바닥이나 철망에서 꺼낼 수 있지만, 먹지 않은 음식을 계산하고 회수하는 데 오류가 있을 수 있습니다.
표준 설치류 케이지에 장착된 상업용 기성품 자동 공급기의 장점을 강조하기 위해 이 장치가 사용자 친화적이며 특정 시간 간격으로 정확한 먹이 할당을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 시스템은 홈 케이지 영역을 방해하지 않습니다. 사료 공급기는 동물의 케이지 외부에 위치하며 3D 프린팅 홀더에서 쉽게 분리할 수 있기 때문에 동물에 대한 방해를 최소화하면서 정기적인 유지 관리, 사료 보충 및 청소를 수행할 수 있습니다.
예를 들어, 우리는 칼로리 제한을 유도하고 궁극적으로 불임을 유발하기 위해 자동 공급기를 사용했습니다. 우리는 21일 칼로리 제한 연구(그림 5)에서 자동 공급기의 사용을 시연하고 이후 실험실에서 수많은 실험에 피더를 사용했습니다. 결과에서 설명한 바와 같이 모이통은 신뢰할 수 있고 정확하게 음식을 배달했습니다. 내부 충전식 배터리는 시간이 지남에 따라 다소 감소하는 것으로 보이지만 피더를 거의 1년 동안 사용한 후에는 약간의 전력 손실이 등록되기 전에 최소 15일 동안 작동합니다. 제조업체는 배터리가 완전 충전부터 60일 동안 작동할 수 있다고 추정합니다. 장기간(>30일)의 경우 피더의 배터리 수명이 최대 충전량의 50% 미만일 때 완전히 충전된 교체용 피더를 회전시키는 것이 좋습니다.
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Jason Lê는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받는 학사 후 연구 교육 프로그램의 지원을 받고 있습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#7 Stopper W/ 3-1/2" curved sipper tube no ball | Labex | 2067 | |
AN75 mouse cage bottom | Ancare | AN75HT | |
Automatic Fish Feeder for Aquarium | Petbank-tek.com | Amazon distribution (#B0BRCWP16K) | |
Rodent Micro-filter Tops | Ancare | N10MBTPLF | |
Rubber Stoppers, One Hole | United Scientific | S24009 | |
standard rodent chow | Prolab IsoPro 3000 |
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