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요약

알코올 남용은 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학의 억제로 인해 폐포 대식세포(AM) 면역을 손상시킵니다. 우리는 최근에 에탄올(EtOH) 노출이 AM에서 미토콘드리아 호흡에 대한 글루타민 의존성을 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 본 명세서에서는 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 EtOH 처리된 AM에서 미토콘드리아 호흡을 위한 글루타민의 사용을 결정하기 위한 방법을 제공합니다.

초록

폐포 대식세포(AM)는 병원균에 대항하는 하부 기도의 세포 방어선입니다. 그러나 만성적이고 과도한 알코올 사용은 부분적으로 조절 장애 연료 대사 및 생체 에너지학을 통해 폐포 공간에서 병원체를 식세포화하고 제거하는 AM의 능력을 손상시킵니다. 당사의 이전 연구에 따르면 만성 에탄올(EtOH) 섭취는 미토콘드리아 생체 에너지를 손상시키고 AM의 젖산 수치를 증가시킵니다. 또한, EtOH는 최근 글루타민 의존성과 글루타민 의존성 최대 호흡을 증가시키는 동시에 유연성을 감소시켜 피루브산 의존성 호흡에서 글루타민 의존성 호흡으로 전환한다는 것을 입증했습니다. 글루타미누라이시스(Glutaminolysis)는 피루브산이 젖산 생성에 사용되거나 다른 연료원이 불충분할 때 미토콘드리아 호흡에 대한 중요한 보상 경로입니다. 72시간 동안 EtOH가 없거나 EtOH(0.08%)에 노출된 마우스 AM 세포주, MH-S 세포를 사용하여 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 연료 공급원으로 글루타민에 대한 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학의 의존성을 측정했습니다. 글루타민이 글루타메이트로 효소로 전환되는 것을 방지하는 글루타미나제 1의 억제제인 비스-2-(5-페닐아타미도-1,3,4-티아디아졸-2-일) 에틸 설파이드(BPTES)에 대응하여 매체 차량 또는 차량 단독에 대한 반응으로 실시간 측정을 수행한 후 미토콘드리아 스트레스를 테스트했습니다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 여러 생물학적 및 실험적 복제에 걸쳐 글루타민 의존성 기저 미토콘드리아 호흡, 미토콘드리아 ATP 연관 호흡, 최대 미토콘드리아 호흡 및 미토콘드리아 예비 호흡 용량의 평균 수준을 분석하기 위한 당사의 방법 및 계산을 설명합니다.

서문

알코올 사용 장애(AUD)는 미국에서 2,800만 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다1. AUD 환자는 호흡기 감염이 발생할 가능성이 2-4배 더 높으며 2,3 조기 이환율 및 사망률 3,4,5 위험을 증가시킵니다. 알코올 남용은 호흡기 감염에 대한 감수성을 증가시키는데, 그 이유 중 하나는 폐 면역 기능을 억제하기 때문입니다. 폐포 대식세포(AM)는 폐 하부에 있는 병원체에 대한 세포 방어의 첫 번째 방어선으로, 병원균을 식세포화하고 흡입한 미생물을 제거합니다. 그러나 만성적인 알코올 섭취는 병원체를 집어삼키고 죽이는 AM의 능력을 손상시킵니다 6,7.

식세포작용(phagocytosis)과 같은 AM의 면역 기능은 높은 아데노신 삼인산(ATP) 생성에 필요한 대사 활성 경로를 필요로 하는 에너지를 요구하는 과정입니다. 미토콘드리아 산화 인산화는 ATP를 생성하는 가장 효율적인 세포 과정이지만 만성 에탄올(EtOH) 노출은 미토콘드리아 유래 산화 스트레스를 증가시켜 AMs 8,9,10에서 미토콘드리아 기능 장애를 초래할 수 있습니다. 세포 산소 소비율(OCR)을 사용하여 측정한 미토콘드리아 호흡은 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 실시간으로 정량화할 수 있습니다. 올리고마이신(ATP 합성효소 억제제), 카르보닐 시안화물-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP, 프로톤 언커플러) 및 로테논/안티마이신 A(R/A, 미토콘드리아 복합체 I 및 III 억제제)에 대한 반응으로 평가된 미토콘드리아 호흡 프로파일은 미토콘드리아 생체 에너지학을 결정하는 데 사용됩니다. 만성 EtOH는 AM에서 미토콘드리아 생체 에너지를 감소시키며, 이는 미토콘드리아 기저 호흡, ATP 연계 호흡, 최대 호흡 및 예비 호흡 능력의 감소로 입증된다10.

세포는 ATP 생성을 위해 피루브산, 글루타민 또는 지방산과 같은 연료 공급원에 다양한 수준의 의존성을 가지고 있습니다. 또한 세포 생체 에너지를 조절하기 위해 연료 사용을 전환할 수 있는 수준의 유연성을 가지고 있습니다. 글루타미누리아 용해는 미토콘드리아 호흡을 위한 핵심 경로이며, 특히 피루브산이 젖산 생성으로 이동하거나 지방산이 충분하지 않을 때 그렇습니다. 당사의 최근 연구에 따르면 만성 EtOH 노출은 글루타민에 대한 AM 의존도를 증가시키고 미토콘드리아 호흡을 위해 글루타민 및 기타 연료 공급원을 사용할 AM 유연성을 감소시킨다11. 이러한 결과는 피루브산 산화 억제제 UK5099로 EtOH 노출된 MH-S 세포를 처리했을 때 UK5099로 처리된 매체 제어 노출 MH-S 세포에 비해 미토콘드리아 생체 에너지학에 변화가 없음을 입증하는 데이터와 함께 EtOH MH-S 세포에서 피루브산 의존 호흡에서 글루타민 의존 호흡으로의 전환을 시사했습니다. 그러나 이러한 변화는 AM 생물에너지 수요를 충족시키기에는 불충분하다11. 여기에서는 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 만성 EtOH 노출 AM에서 미토콘드리아 호흡을 위한 연료 공급원으로서 글루타민을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 96-well(11.04mm2 area) 형식에 맞게 생성 및 최적화되었으며 더 큰 세포 배양 웰 크기에 맞게 조정해야 합니다. 미토콘드리아 생물 에너지학에 대한 글루타민 의존성은 글루타민이 글루타메이트로 효소적으로 전환되는 것을 선택적으로 억제하기 위해 비스-2-(5-페닐아세타미도-1,3,4-티아디아졸-2-일) 에틸 설파이드(BPTES, 글루타미나제 1 억제제)를 사용하여 측정합니다. 이 연구에서 제시된 데이터는 Crotty et al.11에 발표된 미처리 대조군 및 만성 EtOH 노출 마우스 AM 세포주, MH-S 세포의 배지 대조군 및 BPTES 처리 실험군에 대한 추가 생물학적 복제입니다.

프로토콜

1. 시험관 내 만성 EtOH 노출

  1. 가습 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 11.9mM 중탄산 나트륨, 40mg/mL 겐타마이신 및 50μM 2-메르캅토에탄올이 포함된 RPMI-1640을 포함하는 완전한배지에서 생 쥐 폐포 대식세포 세포주를 배양합니다.
  2. 배양된 MH-S 세포를 EtOH(0.8mg/mL 또는 0.08%)와 함께 또는 없이 72시간 동안 처리하며, 여기서 EtOH는 24시간마다 교체해야 합니다. 인큐베이터 물에 0.08% EtOH가 포함된 별도의 가습 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO2 로 EtOH 처리된 MH-S 세포를 배양합니다.

2. 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 글루타민을 연료원으로 평가하기 위한 MH-S 세포 도금

  1. 처리되지 않은 대조군(Con) 및 만성 EtOH 처리된 MH-S 세포가 T-75 플라스크에서 최소 50% 밀도(70%-90% 밀도가 이상적)로 성장하여 96웰 세포외 플럭스 미세배양 플레이트로 들어가도록 합니다. BPTES 주입과 비교하기 위해 Con 및 EtOH 실험 조건 및 각각에 대한 배지 대조군의 생물학적 복제당 5-6개의 기술 복제에 대한 플레이트 맵을 준비합니다(생물학적 n= 1에 대한 총 4개 그룹).
  2. 매체 또는 인산염 완충 식염수로 세포를 헹굽니다.
  3. 플라스크에 혈청 함유 배지 6mL를 추가합니다.
  4. 세포가 분리되고 플레이트 바닥이 깨끗해질 때까지 세포를 긁어냅니다. 트립신은 MH-S 세포 분리에 필요하지 않지만 다른 세포 유형에는 도움이 될 수 있습니다.
  5. 혈청학적 피펫 또는 1mL 피펫을 사용하여 세포를 분리합니다.
  6. 부유 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 200 x g 에서 6분 동안 원심분리합니다.
  7. 상층액을 흡인합니다.
  8. 1mL의 배지를 추가하고 세포를 완전히 재현탁합니다.
  9. 10μL를 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 10μL의 트리판 블루를 추가합니다. 잘 섞는다.
  10. 10μL의 세포/트리판 블루 혼합물을 혈구계 또는 세포 카운터의 한쪽으로 옮깁니다.
  11. 광학 현미경 또는 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오.
  12. 세포 밀도를 밀리리터당 평균 살아있는 세포 수로 계산합니다.
  13. 필요한 희석액을 계산하십시오.
    필요한 웰 수 x 10000-15000 셀 = 필요한 총 셀 수.
    필요한 웰 수 x 80 μL = 필요한 재현탁 세포의 총 부피.
  14. 80μL의 세포를 96웰 세포외 플럭스 미세배양 플레이트의 필요한 웰에 적용합니다.
  15. 세포나 매체가 전혀 없는 모서리 웰을 그대로 두십시오. 이 우물은 배경 측정에 사용됩니다.
  16. 37 ° C의 가습 인큐베이터에서 밤새 5 % CO2 로 세포를 배양하여 세포가 세포 외 플럭스 미세 배양 플레이트에 부착되고 평형을 이룰 수 있도록합니다.
  17. 1단계를 사용하여 96웰 세포외 플럭스 미세배양 플레이트에서 MH-S 세포를 72시간 동안 처리합니다.
  18. 세포외 플럭스 바이오분석기 실험을 실행하기 최소 4시간 전에 최대 24시간 전에 96웰 세포외 플럭스 팩 카트리지를 수화합니다.
    1. 세포외 플럭스 팩의 상단 부분을 제거하고 플럭스 팩의 프로브된 부분을 위로 향하게 하여 벤치에 놓습니다. 200 μL의 세포외 플럭스 보정 용액을 세포외 플럭스 팩 카트리지의 바닥 부분에 있는 각 웰에 적용합니다.
    2. 섹션을 함께 넣고 세포외 플럭스 팩 카트리지를 파라필름으로 감쌉니다. 37 °C non-CO2 가습 인큐베이터 또는 37 °C 비드 배스에 넣습니다.
  19. 분석 디자인이 포함된 컴퓨터를 켜고 세포외 플럭스 바이오분석기 기기에 연결된 실행/분석 소프트웨어를 열어 실험을 수행하기 최소 4시간 전에 예열할 수 있도록 합니다.

3. 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 MH-S 세포의 미토콘드리아 호흡을 위한 연료 공급원으로 글루타민을 평가

참고: 이 절차의 일반적인 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. 광학 현미경으로 Con- 및 EtOH 처리된 배양된 MH-S 세포를 확인하고 세포가 건강하고 단층의 웰에 부착되어 있는지 확인합니다. 분석을 안정적으로 수행하기 위해 세포가 70% 이상 합류(90% 밀도가 이상적)하는지 확인하십시오.
  2. 다음 보충제로 세포외 플럭스 염기 배지를 준비합니다.
    1. 35mL의 세포외 플럭스 염기 배지를 50mL 튜브에 분취합니다.
    2. 100mM 피루브산나트륨(1mM 최종 농도) 350μL, D-글루코스 350μL(10mM 최종 농도) 및 L-글루타민(2mM 최종 농도)에 비해 상온 안정성이 더 높은 GlutaMAX 350μL를 추가합니다.
      참고: 신선한 L-글루타민도 동일한 농도로 사용할 수 있습니다.
    3. 용액을 37°C로 데우고 pH가 37°C에서 7.4 ± 0.05가 되도록 합니다.
  3. 세포외 미세배양판에서 성장 배지를 부드럽게 흡인합니다. 바닥에서 세포를 흡입하지 않고 가능한 한 적은 양의 매체를 남겨 둡니다. 최대 50 μL의 세포외 플럭스 보충 기본 배지로 한 번 세척하십시오.
  4. 각 웰에 180μL의 세포외 플럭스 보충 기본 배지를 추가하고 세포외 미세배양 플레이트를 37°C의 non-CO2 가습 인큐베이터에서 30분에서 1시간 동안 배양하여 평형을 유지합니다.
  5. 글루타민 산화 시험 시약을 용해하십시오.
    1. BPTES 튜브에 700μL의 세포외 플럭스 보충 기본 배지를 첨가하여 120mM 원액을 만듭니다. 화합물을 적절하게 용해시키기 위해 피펫팅을 위아래로 10회 합니다.
      주의: BPTES는 피부와 눈에 자극을 일으키고 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 취급 시 보호 장갑, 보안경 및 안면 보호구를 착용하십시오. 내용물과 용기는 승인된 폐기물 처리 시설에 폐기하십시오.
    2. 올리고마이신 튜브에 630μL의 세포외 플럭스 보충 기본 배지를 첨가하여 100mM 원액을 만듭니다. 화합물을 적절하게 용해시키기 위해 피펫팅을 위아래로 10회 합니다.
    3. FCCP 튜브에 720μL의 세포외 플럭스 보충 염기 배지를 첨가하여 100mM 원액을 만듭니다. 화합물을 적절하게 용해시키기 위해 피펫팅을 위아래로 10회 합니다.
      주의 : FCCP는 삼키면 유해하고, 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으키고, 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있으며, 수생 생물에 오래 지속되는 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 취급 시 보호 장갑, 보호복, 보안경 및 안면 보호구를 착용하십시오. 내용물과 용기는 승인된 폐기물 처리 시설에 폐기하십시오.
    4. R/A 튜브에 540μL의 세포외 플럭스 보충 기본 배지를 추가하여 50mM 원액을 만듭니다. 화합물을 적절하게 용해시키기 위해 피펫팅을 위아래로 10회 합니다.
      주의: 로테논은 삼키거나 흡입하면 치명적이고, 피부 자극을 일으키고, 눈에 심각한 자극을 일으키고, 호흡기 자극을 유발할 수 있으며, 수중 생물에 매우 독성이 있어 오래 지속되는 영향을 미칩니다. 보호 장갑, 눈 보호구, 안면 보호구 및 호흡기 보호구를 착용하십시오. 내용물과 용기는 승인된 폐기물 처리 시설에 폐기하십시오. 안티마이신 A는 삼키면 치명적이며 수생 생물에 매우 독성이 있으며 오래 지속되는 영향을 미칩니다. 내용물과 용기는 승인된 폐기물 처리 시설에 폐기하십시오.
  6. 기질 산화 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 시약의 작업 농도를 준비합니다.
    1. BPTES의 경우 1,500 μL의 세포외 플럭스 보충 염기 배지와 500 μL의 120 mM BPTES 원액을 혼합하여 30 μM BPTES 작업 용액을 만듭니다.
    2. 올리고마이신의 경우 2,520μL의 세포외 플럭스 보충 염기 배지와 480μL의 100mM 올리고마이신을 혼합하여 16mM 올리고마이신 작업 용액을 만듭니다.
    3. FCCP의 경우 2,865μL의 세포외 플럭스 보충 염기 배지와 135μL의 100mM FCCP를 혼합하여 4.5mM FCCP 작업 용액을 만듭니다.
    4. R/A의 경우 2,700μL의 세포외 플럭스 보충 기본 배지와 300μL의 50mM R/A를 혼합하여 5mM R/A 작업 용액을 만듭니다.
  7. extracellular flux pak 카트리지의 상부 포트에 다음을 장착합니다.
    1. 20 μL의 세포외 플럭스 보충 염기 배지를 포트 A에, 22 μL의 올리고마이신을 포트 B에, 25 μL의 FCCP를 포트 C에, 27 μL의 R/A를 포트 D에 로드합니다.
    2. 20 μL의 배지 제어 또는 BPTES가 있는 세포 함유 웰을 포트 A(BPTES의 경우 최종 농도 3μM), 22μL의 올리고마이신을 포트 B(올리고마이신의 경우 최종 농도 2μM), FCCP 25μL를 포트 C(FCCP의 경우 최종 농도 0.5μM), R/A 27μL(R/A의 경우 최종 농도 0.5μM)를 포트 D에 로드합니다.
  8. 다음 타이밍 및 주입 전략을 사용하여 기기에 부착된 분석 설계 및 분석을 위한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 세포외 플럭스 생물분석기 실험을 수행합니다.
    1. BPTES용 포트 A를 사용한 주입의 경우 측정 횟수를 6으로 설정합니다. 혼합 시간을 3분으로 설정하고 대기 시간은 0분, 측정 시간은 3분으로 설정합니다.
    2. oligomycin에 대한 포트 B를 사용한 주입의 경우 측정 횟수를 3으로 설정합니다. 혼합 시간을 3분으로 설정하고 대기 시간은 0분, 측정 시간은 3분으로 설정합니다.
    3. FCCP용 포트 C를 사용한 주입의 경우 측정 횟수를 3으로 설정합니다. 혼합 시간을 3분으로 설정하고 대기 시간은 6분, 측정 시간은 3분으로 설정합니다.
    4. R/A용 포트 D를 사용한 주입의 경우 측정 횟수를 3으로 설정합니다. 혼합 시간을 3분으로 설정하고 대기 시간은 0분, 측정 시간은 3분으로 설정합니다.
    5. 모든 세트 배경, 매체 제어 및 실험 그룹 웰을 검토합니다. 분석을 저장하고 실행합니다. 먼저 세포외 플럭스 팩에 A-D 주입을 로드합니다. 셀 플레이트를 로드할 준비가 될 때까지 보정이 발생합니다.
    6. 분석이 끝나면 즉시 세포판을 제거합니다. 나중에 다른 장치에서 분석할 수 있도록 결과를 저장합니다.
    7. 광학 현미경을 사용하여 세포가 여전히 부착되어 있는지 확인하십시오. 인산염 완충 식염수로 1x 세척하고 선호하는 세포 용해 완충액으로 세포를 용해합니다. -80 °C에서 보관하거나 단백질 농도를 즉시 분석하십시오.

4. MH-S 세포에서 미토콘드리아 호흡을 위한 연료 공급원으로서의 글루타민을 평가하기 위한 결과 분석

  1. 각 웰의 세포에서 단백질을 추출하여 산소 소비율(OCR) 데이터를 단백질로 정규화합니다.
    1. 웰당 단백질의 농도(나노그램/마이크로리터[ng/μL])를 계산합니다.
    2. 전체 세포외 플럭스 미세배양 플레이트에 대한 평균 단백질 농도(ng/μL)를 계산합니다.
    3. 각 웰의 단백질 농도를 평균 플레이트의 단백질 농도로 나누어 정규화 계수를 구합니다.
    4. 분석 설계 및 분석을 위해 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 관심 있는 데이터 파일에 정규화 인자를 적용합니다.
  2. 모든 배경 웰의 OCR 값이 0에 가까운지 확인합니다.
  3. 기준선에서 OCR이 10< 있는 셀 웰을 선택 취소합니다. 데이터는 삭제되지 않지만 강조 표시된 웰은 내보낸 데이터 파일에 표시됩니다.
  4. 분석 설계 및 분석을 위해 컴퓨터 소프트웨어 프로그램의 데이터를 컴퓨터 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다.
  5. 컴퓨터 스프레드시트 프로그램에서 파일을 열고 OCR 값을 줄여 모든 데이터를 정렬합니다. 배경 웰, 이전에 선택 취소된(삭제되지 않은) 웰, 세포 생존율이 낮은 웰, 세포 밀도가 낮은 웰, 전체 주입 전략이 완료되지 않은 웰, 단백질 농도 판독값이 부정확한 웰, 기준선 OCR이 10<인 웰 및 기타 미리 결정된 기준을 삭제합니다.
  6. 나머지 모든 데이터를 측정별, 그룹별, OCR별로 정렬합니다.
  7. 측정을 통해 각 생물학적 N의 기술적 복제를 독립적으로 평균화합니다. 기술적 복제를 평균화한 후 생물학적 N당 실험군당 최소 18개의 다른 값(기준선 3개, 매체/BPTES 후 3개, 올리고마이신 후 3개, FCCP 후 3개, 로테논/안티마이신 A 후 6개)이 있는지 확인합니다. 나중에 분석된 데이터에 대해 평균의 표준 편차 또는 표준 오차를 계산할 수 있도록 각 생물학적 N에 대해 개별적으로 이 작업을 수행합니다.
  8. 모든 평균값을 실험 그룹별로 구분된 새 스프레드시트에 복사합니다.
  9. 각 실험 그룹에서 주입 전략에 따라 OCR 값의 평균을 구합니다.
  10. 산소 소비량을 기반으로 미토콘드리아 생체 에너지학의 매개변수를 계산합니다.
    1. 기초 호흡을 계산합니다.
      1. 다음과 같이 기초 미토콘드리아 호흡을 계산합니다.
        기초 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #1, 2, 3 - AVG OCR 측정 #16, 17, 18] x [시간 #3 - 시간 #1])
        참고: 기초 호흡은 억제제가 주입되기 전이기 때문에 매체 대조군과 BPTES 그룹 간에 유사해야 합니다.
      2. 다음과 같이 글루타민에 의존하지 않는 기초 미토콘드리아 호흡을 계산하십시오.
        글루타민에 의존하지 않는 기초 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #4, 5, 6, 7, 8, 9 - AVG OCR 측정 #16, 17, 18] x [Time #9 - Time #4])
        참고: 세포가 글루타민에 크게 의존하지 않는 한 글루타민에 의존하지 않는 한 기저 미토콘드리아 호흡은 기저 미토콘드리아 호흡보다 작아야 합니다.
      3. 다음과 같이 글루타민에 의존하는 기초 미토콘드리아 호흡을 계산합니다.
        글루타민에 의존하는 기초 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #1, 2, 3 - AVG OCR 측정 #4, 5, 6, 7, 8, 9] x [Time #9 - Time #4])
        참고: 총 기저 미토콘드리아 호흡은 기저 미토콘드리아 호흡에서 빼서는 안 되며, 글루타민은 다른 시점에서 계산되기 때문에 글루타민에 의존해서는 안 됩니다.
    2. ATP 연관 호흡을 다음과 같이 계산합니다.
      1. 다음과 같이 모든 연료의 총 미토콘드리아 ATP 결합 호흡을 계산합니다.
        모든 연료의 총 미토콘드리아 ATP 관련 호흡(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #1, 2, 3 - AVG OCR 측정 #10, 11, 12] x [Time #12 - Time #10])
        참고: 측정 #10, 11 및 12에 대한 평균 OCR은 올리고마이신이 ATP 합성효소를 강하게 억제해야 하고 하나의 연료 경로를 억제해도 총 ATP 연결 호흡을 변경해서는 안 되기 때문에 매체 대조군과 BPTES 그룹 간에 유사해야 합니다.
      2. 글루타민에 의존하지 않는 ATP 결합 미토콘드리아 호흡을 다음과 같이 계산합니다.
        글루타민에 의존하지 않는 ATP 결합 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #4, 5, 6, 7, 8, 9 - AVG OCR 측정 #10, 11, 12] x [Time #12 - Time #10])
        참고: 세포가 글루타민에 크게 의존하지 않는 한 글루타민에 의존하지 않는 ATP 연결 미토콘드리아 호흡은 ATP 연결 미토콘드리아 호흡보다 작아야 합니다.
      3. 글루타민에 의존하는 ATP 결합 미토콘드리아 호흡을 다음과 같이 계산합니다.
        글루타민에 의존하는 ATP 결합 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = 모든 연료의 총 ATP 결합 미토콘드리아 호흡 - 글루타민에 의존하지 않는 ATP 결합 미토콘드리아 호흡
    3. 다음과 같이 최대 호흡을 계산하십시오.
      1. 다음과 같이 총 최대 미토콘드리아 호흡을 계산합니다.
        총 최대 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #13, 14, 15 - AVG OCR 측정 #16, 17, 18] x [Time #15 - Time #13])
      2. 다음과 같이 글루타민에 의존하지 않는 최대 미토콘드리아 호흡을 계산하십시오.
        글루타민에 의존하지 않는 최대 미토콘드리아 호흡(pmol O2 섭취) = ([BPTES 그룹의 AVG OCR 측정 #13, 14, 15 - BPTES 그룹의 AVG OCR 측정 #16, 17, 18] x [시간 #15 - #Time 13])
      3. 다음과 같이 글루타민에 의존하는 최대 미토콘드리아 호흡을 계산하십시오.
        글루타민에 의존하는 최대 미토콘드리아 호흡(pmol O2 소비) = 모든 연료의 총 최대 미토콘드리아 호흡 - 글루타민에 의존하지 않는 최대 미토콘드리아 호흡
        참고: 이 계산은 다른 연료와 비교하여 글루타민의 예비 용량에 대한 세포 의존성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 최대 미토콘드리아 호흡이 클수록 글루타민에 대한 의존도가 높아지며, 이는 BPTES 그룹으로 표현될 수 있습니다 - 최대 미토콘드리아 호흡의 손실 또는 총 호흡의 백분율을 나타내는 대조군.
    4. 다음과 같이 예비 호흡 활량을 계산하십시오.
      1. 다음과 같이 총 예비 호흡 활수를 계산하십시오.
        총 예비 호흡량(pmol O2 소비) = ([AVG OCR 측정 #13, 14, 15 - AVG OCR 측정 #1, 2, 3] x [Time #15 - Time #13])
      2. 다음과 같이 글루타민에 의존하지 않는 예비 호흡 용량을 계산하십시오.
        글루타민에 의존하지 않는 예비 호흡량(pmol O2 소비) = ([BPTES 그룹의 AVG OCR 측정 #13, 14, 15 - BPTES 그룹의 AVG OCR 측정 #1, 2, 3] x [시간 #15 - 시간 #13])
      3. 다음과 같이 글루타민에 의존하는 예비 호흡 용량을 계산하십시오.
        글루타민에 의존하는 예비 호흡량(pmol O2 소비) = 모든 연료의 총 예비 호흡량 - 글루타민에 의존하지 않는 예비 호흡 용량
        참고: 이 계산은 글루타민에 의존하는 세포의 유연성과 필요할 때 글루타민 없이 더 큰 호흡을 달성할 수 있는지 여부를 나타냅니다.
  11. 억제제 그룹별로 매체 제어를 빼고 원하는 경우 대조군에 비해 소비된 pmol O2 를 정규화합니다.
  12. 글루타민에 의존하는 OCR 생체 에너지 프로필(pmol O2/min), 기초 호흡(pmol O2), ATP 연결 호흡(pmol O2), 최대 호흡(pmol O2) 및 예비 호흡량(pmol O2)의 그래프를 생성합니다.
  13. 미토콘드리아 생체 에너지 종말점 값을 막대 그래프로 묘사하거나 매체 대조군에 상대적인 억제제 그룹의 수단으로 표현합니다. 각 생물학적 N을 개별적으로 계산하는 경우 모든 생물학적 N에서 분석된 데이터에 대한 평균의 표준 편차 또는 표준 오차를 계산합니다.

5. 통계 분석

  1. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 통계 분석을 수행합니다.
  2. OCR 생체 에너지 프로파일의 선형 포인트의 경우, 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행한 후 Tukey의 사후 분석(post-hoc analysis)을 수행하여 이 4개 실험 그룹의 데이터를 Con + 매체, Con + BPTES, EtOH + 매체 및 EtOH + BPTES의 두 가지 요인(처리 및 주입 전략)과 비교합니다.
  3. 글루타민에 의존하는 기초 호흡, ATP 연관 호흡, 최대 호흡 및 예비 호흡량의 막대 그래프를 위해 Student's t-test 분석을 수행하여 Con + BPTES 및 EtOH + BPTES의 두 실험 그룹의 데이터를 비교합니다.
  4. 데이터를 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시합니다. p < 0.05가 통계적으로 유의하다고 가정합니다.

결과

만성 EtOH 노출은 MH-S 세포의 글루타민 의존성을 감소시킵니다.
글루타민 용해는 미토콘드리아 호흡을 위한 중요한 경로로, 세포 생체 에너지학의 중요한 연료 공급원으로서 글루타민을 지원합니다. EtOH에 대한 만성 노출이 미토콘드리아 호흡을 위한 연료 공급원인 글루타민에 대한 MH-S 세포의 의존성을 변화시키는지 확인하기 위해 MH-S 세포를 EtOH 대조군(Co...

토론

본 명세서에 제시된 데이터는 배지 제어 또는 BPTES로 처리된 치료되지 않은 만성 EtOH 노출 MH-S 세포에 대한 추가적인 생물학적 복제물이며, 이는 Crotty et al.11에 발표되어 있다. 설명된 프로토콜은 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학을 위한 연료 공급원인 글루타민에 대한 EtOH 노출 MH-S 세포의 의존성을 평가하는 ...

공개

모든 저자는 보고해야 할 관련 재정적 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

우리는 실험을 위한 MH-S 세포의 초기 세포 배양 및 준비에 대한 Sarah S. Chang, BS의 기여를 인정합니다. 이 연구는 NIAAA R01-AA026086에서 SMY(ORCID: 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938에서 KMC, NIGMS T32-GM008602에서 Emory University의 약리학 및 화학 생물학과 Randy Hall의 지원을 받았습니다. 이 보고서의 내용은 재향군인회나 미국 정부의 견해를 대변하지 않습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tube VWR International, Inc.21008-670Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich Co.M6250Used for culturing MH-S cells.
Cell scraperDot Scientific, Inc.70-1180Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counterFisher Scientific CompanyAMQAF2000Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose Sigma Aldrich Co.G8270Used for the extracellular flux base medium.
EthanolFisher Scientific Company4355720Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serumSciencell Research Laboratories500Used for culturing MH-S cells.
GentamicinSigma Aldrich Co.G1397Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/ASoftware for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-2019Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube USA Scientific, Inc.4036-3212Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet programMicrosoftN/ASoftware for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycinFisher Scientific Company15140122Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered salineVWR International, Inc.45000-446Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysisAgilent Technologies, Inc.N/AThe computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4Agilent Technologies, Inc.103334-100Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test KitAgilent Technologies, Inc.103674-100Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzerAgilent Technologies, Inc.N/AExtracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solutionAgilent Technologies, Inc.102416-100Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-550678Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonateSigma Aldrich Co.S6014Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate Sigma Aldrich Co.P4562Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasksSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Used for culturing MH-S cells.

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