본 프로토콜은 염화칼슘절차(12)의적응을 이용하여 유능한 대장균 DH5α의 제조 및 변형을 설명한다.

1. 셋업

1. 설비
   • 분광광계
   • 소발 원심분리기 (또는 이에 상응하는)
   • 벤치탑 원심분리기
   • 열 블록 또는 수조
   • 궤도 셰이커
   • 고정 인큐베이터
   • 젤 캐스팅 트레이
   • 잘 빗
   • 전압 소스
   • 젤 박스
   • UV 광원
   • 마이크로파
2. 솔루션 및 시약
   • 루리아 베르타니 (LB) 국물 (10 g 카제인 효소 가수 분해제, 효모 추출물 5g, 염화 나트륨 5 g H₂O 1000mL)
   • 카타볼라이트 억압(SOC)을 함유한 슈퍼 최적 국물: (2% (w/v) 트라이프톤, 0.5% (w/v) 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl_2,10mM MgSO_4,20mM포도당)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl_2,20 mM CaCl₂₎용액.
   • M CaCl₂ 용액(세포가 즉시 변형되는 경우) 또는 10% (v/v) 글리세롤을 함유하는 0.1M CaCl₂ 용액(향후 사용을 위해 세포가 동결되는 경우).
   • LB 한천 플레이트
   • LB agar 선택적 플레이트 (이 실험을 위해, 플라스미드가 콩퍼 암피실린 저항을 사용했기 때문에, 암피실린 100 μg/mL을 포함하는 LB 한천 판이 사용되었다)
   • 대장균 DH5α 균주
   • 플라스미드 pUC19 DNA (100 pg/μl)
   • QIAprep 스핀 미니프렙 키트 (키아겐)
   • 힌드 (주) III 제한 효소
   • 1 kb 플러스 DNA 사다리
   • 낮은 융점 아가로즈
   • 1X TAE 버퍼 (40m 트라이베이스, 20m 아세트산 및 1mM EDTA)
   • 에티듐 브로마이드 (10mg/mL)
3. 일반 안전 노트
   대장균 DH5α는 생물안전 수준 1(BSL1)으로 분류됩니다. 이 범주에 있는 세균은 건강한 성인에 있는 감염의 거의 또는 전혀 위협을 제기합니다. 그러나 미생물을 신중하게 조작해야 합니다.

중요한 이 프로토콜의 모든 단계는 표시되지 않는 한 무균 기술과 얼음 또는 4°C 온도에서 수행해야 합니다.

2. 프로토콜

1. 대장균 DH5α의 냉동 육수에서 (LB에서 자란 하룻밤 문화에서 20 % 글리세롤로 냉동) LB 한천 판에 격리박테리아를 줄입니다. 하룻밤 사이에 37°C에서 배양(16-20시간).
2. 튜브에 있는 LB 국물의 3mL로 단일 식민지를 접종합니다. 하룻밤 사이에 37°C에서 210rpm에서 흔들리며 성장합니다(16-20시간).
3. 하룻밤 문화의 OD600을 측정합니다. 하룻밤 문화를 사용하여 1리터 플라스크에서 LB 국물의 100mL를 OD600=0.01로 접종한다. 문화가 OD600=0.35(약 3시간)에 도달할 때까지 15-20분마다 분광계에서 37°C 모니터링 OD600에서 활발하게 흔들리는 배양(210rpm)을 배양한다.
   참고: 변환이 효율적이기 위해서는 세균 세포가 중간 기하급수적인 성장 단계에 있어야 합니다. 세포의 최대 수는 10⁸ 세포/mL이어야 하며, 이는 대부분의 대장균균의 경우 OD600=0.4에 해당합니다. 분광계를 사용하면 OD600을 측정할 수 있으며, 이는 세포가 적절한 성장 단계에 있는지 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜이 박테리아의 다른 균주에 사용되는 경우, 특정 OD600 값에서 단위를 형성하는 식민지수를 결정하기 위해 교정이 이 상관 관계를 결정하는 데 필요합니다.
4. 문화의 50mL를 각각 2개의 얼음 냉간 폴리프로필렌 원심분리기 병으로 옮춥니다. 병을 얼음 위에 20분 동안 놓아 식힙니다.
5. 4°C에서 10분 동안 2700g(소발 GSA 로터의 4100rpm)에서 원심분리로 세포를 회수합니다.
6. 상부체를 제거합니다. 병을 패드 나 종이 타월에 거꾸로 놓아 미디어의 마지막 흔적을 빼내십시오.
7. 각 세균성 펠릿을 CaCl 2-MgCl 2(80m MgCl_2, 20mM CaCl₂₎얼음냉용액의 30mL로 재보종한다. 먼저 5mL의 용액을 추가하고 펠릿이 완전히 용해될 때까지 조심스럽게 소용돌이쳐 남은 25mL의 용액을 추가합니다.
8. 2.4 단계를 반복합니다.
9. 2.5 단계를 반복합니다.
10. 유능한 세포가 직접 변형될 경우 각 세균성 펠릿을 CaCl 2(0.1 M) 얼음 냉용액의 2mL로 조심스럽게 소용돌이치게 한다. 펠릿이 이 방법으로 다시 중단되지 않으면 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 중단하십시오(거품 형성을 피하십시오).
    대안적으로, 유능한 세포는 동결및 나중에 사용하기 위해 저장될 수 있다. 유능한 세포의 냉동 된 주식을 준비하려면, 10 %(v /v) 글리세롤을 포함하는 0.1M CaCl₂ 용액의 2 ml에서 펠릿을 다시 놓습니다. 이 솔루션은 얼음차가운 것이어야 합니다. 얼음 감기 1.5 mL 폴리 프로필렌 튜브 (튜브 당 160 μl)로 알리 쿼트 셀 서스펜션. 마른 얼음/에탄올 욕조에서 유능한 세포를 즉시 동결하십시오. 튜브를 -70°C 냉동고로 옮춥춥시다.
11. CaCl_2-처리된세포를 변환하기 위하여는, 2 1.5 ml polypropylene 관의 각으로 유능한 세포의 50 의 침을 전송합니다. pUC19 플라스미드 DNA의 1 μl(100 pg)을 튜브 중 하나에 추가하고 DNA(음성 제어)없이 두 번째 튜브를 둡니다. 부드럽게 섞으세요(거품 형성을 피하십시오). 얼음에 30 분 동안 배양.
    참고: 10 μL 이하의 부피에서 DNA의 50 ng 이하는 변환에 사용되어서는 안됩니다.
12. 튜브를 열 블록으로 옮기고 42°C에서 45s의 배양을 정확하게 전달합니다.
    참고: 열 충격은 중요한 단계입니다. 온도 또는 잠복기 시간을 초과하지 마십시오.
13. 튜브를 얼음으로 쉽게 옮기십시오. 2 분 동안 인큐베이션.
14. SOC 매체의 950 μL을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 튜브를 배양하여 박테리아가 플라스미드에서 인코딩된 항생제 내성 마커를 회수하고 표현할 수 있도록 합니다.
15. SOC(1/100 희석)에서 1000 μL및 SOC(1/10 희석)에서 셀 서스펜션의 10μL을 희석시 1000 μL으로 희석한다. 희석제의 100 μl을 플레이트, 뿐만 아니라 컨트롤, 선택적 플레이트에, 주걱을 사용하여 확산. 일반적으로 1/100 및 1/10 희석의 100 μL을 도금하면 플레이트 당 충분한 수의 콜로니 성형 유닛(cfu)이 생성됩니다. 이상적으로, 이 숫자는 충분한 식민지가 있지만 서로 분리되도록 30-300 cfu 사이의 범위해야합니다. 그러나 cfu 수는 변환 효율성에 따라 달라집니다(데이터 분석 및 결과 섹션 참조).
16. 플레이트를 37°C에서 배양합니다. 변형된 식민지는 12-16시간 동안 나타나야 합니다(이 범위는 세포 변형 및 선택 방법에 따라 달라집니다). 어떤 식민지도 부정적인 통제에서 성장해서는 안됩니다.
17. 변환을 위해 얻은 cfu/플레이트를 계산합니다(표1).
18. 변압제를 확인하기 위해 pUC19 플라스미드를 수용하고, 플라스미드 제제와 후속 소화가 수행됩니다. 이를 위해 단일 콜로니를 튜브에 3 ml의 LB 국물에 접종하십시오. 하룻밤 사이에 37°C에서 210rpm에서 흔들리며 성장합니다(16-20시간).
19. 제조업체의 지시에 따라 QIAprep 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 준비를 준비하십시오.
20. 1시간 동안 37°C에서 제한 효소 힌dIII로 정제된 pUC19의 1 μg를 소화한다.
    참고: pUC19 다중 복제 부위에서 절단하는 모든 효소는 이 단계에 사용할 수 있습니다.

21. 분자량 사다리, 소화된 pUC19 DNA 및 소화되지 않은 pUC19 DNA를 95V에서 1시간 동안 1 μg/mL 에티듐 브로마이드1%를 함유한 1% 아가로즈 젤로 실행한다.
    참고: 사용 장비에 따라 시간과 전압이 달라집니다.
22. 자외선 아래에서 젤을 시각화합니다. 소화 및 소화되지 않은 pUC19 DNA의 크기를 비교합니다(그림2)(데이터 분석 및 결과 섹션 참조).
    각 특정 변환 실험의 목표에 따라 변환을 확인하는 데 필요한 단계를 진행합니다.

그림 2: 변형된 DH5α 세포에서 회수된 플라스미드 DNA의 소화. 플라스미드 DNA는 힌dIII로 소화된 변형된 DH5α 세포로부터 회수되었고, 1% 아가로즈 젤로 실행하고 UV 소스(단계 2.19 ~ 2.22)로 시각화하였다.

3. 데이터 분석 및 결과

변환 효율을 계산하기 위하여는, 세포가 세포외 DNA를 얼마나 잘 차지했는지의 표시기, 변환에서 얻은 식민지는 계산될 필요가 있습니다:

표 1: 변환 실험에서 계산된 콜로니 성형 유닛(cfu).

변환 효율(TE)은 플라스미드 1μg을 유능한 셀의 지정된 부피로 변환하여 발생하는 cfu 수의 척도이다. 많은 파라미터는 플라스미드 크기, 세포 유전자형, 역량 준비 중 성장 단계, 변환 방법 등 변환 효율에 영향을 미칩니다. TE를 계산할 때 도금 전에 수행된 희석(있는 경우)을 고려하고 총 cfu 수의 계산에 통합하는 것이 중요합니다. 변환 효율(TE)은 다음 방정식으로 계산됩니다.

먼저 cfu를 DNA의 μg로 분할하여, 이 예에서 0.0001μg. 그런 다음 결과를 희석 계수로 나눕니다. 이 예에서, 1/10 희석이 사용되었고 1ml 용액의 100μL이 도금되었다(희석: 1/10 × 100 μL/1000 μL=0.01).