cDNA 말단의 신속 증폭
출처: 파블로 산체스 보쉬2,숀 코코란2, 카타 브뤼크너1,2,3
1 엘리와 에디테 브로드 재생 의학 및 줄기 세포 연구 센터
2 세포 및 조직 생물학학과,
3 미국 캘리포니아 주 샌프란시스코 대학교 심장혈관 연구소
cDNA 끝(RACE)의 신속한 증폭은 시퀀스에 대한 사전 지식 없이도 3' 또는 5'끝으로 확장하여 mRNA로부터 전신 cDNA를 증폭할 수 있는 기술이다(Frohman et al., 1988). 일반 PCR과는 달리, 그것은 단지 하나의 특정 PCR 프라이머와 대부분의 mRNA에 무차별 적으로 바인딩됩니다 두 번째 비 특이적 프라이머를 사용합니다. 증폭되는 영역이 mRNA의 3' 또는 5'끝에 있는지 여부에 따라, 두 번째 프라이머는 모든 성적증명서(5'end)에 추가된 폴리A 꼬리(3'end) 또는 합성 링커를 결합하도록 선택된다. 이러한 프라이머 조합은 한쪽-3 또는 5'(오하라 외, 1989)의 공지된 시퀀스를 사용하여 PCR 증폭으로 인해 "일방적" 또는 "고정된" PCR을 산출하는 것으로 알려져 있다. 접근은 그렇지 않으면 검출하기 어려울 유전자 특정 희귀 mRNAs의 포착을 허용합니다, 예를 들면 그들의 상대적으로 낮은 발현 또는 알려지지 않은 완전한 순서 때문에 (Frohman et al., 1988).
RACE는 mRNA로부터 단일 좌초 된 무료 DNA (cDNA)를 합성하기 위해 역 전사 단계 (RT)로 시작됩니다. 이것은 관심있는 유전자에서 cDNA 단편을 증폭시키는 2개의 연속PCRs에 선행됩니다. RACE를 수행하기 위해서는, 관심 있는 유전자의 서열은 유전자 특이적 프라이머(GSPs)를 설계하는 데 필요한 바와 같이 적어도 부분적으로 알려져야 합니다. 프로만, 1994년; 리우와 고로프스키, 1993년). 두 번째 프라이머 쌍은 샘플에 존재하는 모든 성적체에 대한 음침을 줄이는 일반 프라이머이기 때문에 PCR 반응의 특이성이 감소됩니다. 따라서 RACE는 비특이적 성적증명서를 증폭할 확률을 낮추기 위해 중첩된 두 개의 PCR로 이상적으로 수행됩니다(그림 1). GSP에 비해 증폭방향에 따라 이 기술은 5' 또는 3'RACE(도 1)로 분류됩니다.
3' RACE(도 1A)는 mRNA에 존재하는 폴리(A) 꼬리를 비특이적 프라이머에 대한 제네릭 결합 부위로 활용한다. 이것은 oligo (dT) 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성 할 수 있기 때문에 기술을 단순화합니다. GSP는 성적 증명서의 5'영역에 위치하고 있습니다. 이 RACE 변종은 성적 증명서 변형및 다른 3'UTR (스코토 라비노 등, 2007a)의 검출을 허용합니다. 5'RACE (도 1B)에서, GSPs는 유전자의 3'영역에 위치합니다. 모든 성적증명서에 결합하는 비특이적 프라이머를 사용할 수 있도록 일반 프라이머 결합 부위역할을 하는 어댑터가 5'RNA 끝에 부착된다. mRNA에 어댑터를 부착하려면 외핵체로부터 mRNA를 보호하고 번역을 촉진하는 5'캡을 제거해야 합니다(Bird et al., 2016). 3'RACE에 반대, 5'RACE는 차동 5의 스플라이스 변형과 대안 5'UTR (스코토 라비노 등, 2007b)를 찾는 데 도움이됩니다.
여기에서 는 드로소필라 dSmad2 (Smox)유전자에 의해 인코딩된 공지된 5' 서열(그림 2A)을 사용하여 상이한 성적증명서 변이체를 식별하고 격리하기 위해 3'RACE를 수행합니다. dSmad2, 플라이 스마드 단백질, 액티빈 β 신호의 중요 한 변환기, TGF-β 슈퍼 패밀리의 경로. dSmad2는 세포 증식, 세포 세포 증식 및 분화와 같은 다중 세포 과정을 조절합니다(Upadhyay et al., 2017). dSmad2의 차분하게 접합된 성적증명서가 성인 비행에서 다른 기능을 가질 수 있기 때문에, 이러한 잠재적 기능을 탐구하는 첫 번째 단계는 이 발달 단계에서 dSmad2의 모든 성적 증명서 변형을 평가하는 것입니다.
1. 3'RACE에 대한 실험 설정
- 관심 유전자(유전자 특이적 프라이머 1, GSP-1)에 대한 5' 특정 프라이머를 설계한다. 특이성을 도입하는 유일한 프라이머이기 때문에 매우 구체적이어야 합니다. 따라서, 상대적으로 긴 프라이머가 바람직할 것이다(55-65°C에서 24개의 뉴클레오티드, Tm의 전형적인 길이).
- 두 번째 중첩 프라이머(GSP-2)를 설계하는 것은, 즉 프라이머는 GSP-1의 3'에 위치해야 한다. 이 단계는 선택 사항이지만 중첩 된 프라이머로 두 번째 PCR을 수행하면 관심 유전자에 대한 PCR의 수율 및 특이성을 증가시게됩니다. dSmad2 cDN을 증폭시키는 데 사용되는 프라이머는 표 2에 나열됩니다.
2. cDNA 합성
- 제조자의 프로토콜에 따라 RNA 추출 방법 또는 키트를 사용하여 샘플에서 RNA를 추출한다. 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 DNase로 샘플을 치료하십시오. 우리의 예에서
플라이베이스에서 드로소필라 dSmad2에 대한 두 개의 노이티드 성적 증명서가 있습니다 (도 2A). 그러나 우리의 결과는 750 bp에서 1400 bp (도 2B)에 이르는 크기에 이르기까지 dSmad2에대한 세 가지 다른 성적 증명서를 보여줍니다. 대역 의 강도의 차이는 상대식 수준을 나타냅니다. 예측된 제품 중, 하나의 성적증명서가 우세(도 2B, 검은 화살 A), 그리고 하나는 낮은 수준에서 표현된다(도 2B, ...
RACE는 부분적으로만 알려진 시퀀스또는 증폭하기 어려운 희귀 한 성적 증명서에서 cDN을 얻을 수있는 빠르고 저렴하며 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 이미 알려진 유전자에서 알 수 없는 성적 증명서의 순서를 찾거나 추가 연구를 위한 그 같은 성적증명서를 복제하기 위하여 이용될 수 있습니다. RACE 다음, 이러한 성적증명서는 세포 기반 시스템 또는 모델 유기체에서 과발현되어 생체 내에서 ...
- Bird, J.G., Zhang, Y., Tian, Y., Panova, N., Barvík, I., Greene, L., Liu, M., Buckley, B., Krásný, L., Lee, J.K., et al. (2016). The mechanism of RNA 5′ capping with NAD+, NADH and desphospho-CoA. Nature 535, 444–447.
- Frohman, M.A. (1994). On beyond classic RACE (rapid amplification of cDNA ends). PCR Methods Appl. 4, S40–S58.
- Frohman, M.A., Dush, M.K., and Martin, G.R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.a. 85, 8998–9002.
- Liu, X., and Gorovsky, M.A. (1993). Mapping the 5′ and 3′ ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Nucleic Acids Res. 21, 4954–4960.
- Ohara, O., Dorit, R.L., and Gilbert, W. (1989). One-sided polymerase chain reaction: the amplification of cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5673–5677.
- Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007a). 3′ End cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2742–2745.
- Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007b). 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2555–2562.
- Upadhyay, A., Moss-Taylor, L., Kim, M.-J., Ghosh, A.C., and O’Connor, M.B. (2017). TGF-β Family Signaling in Drosophila. Cold Spring Harb Perspect Biol 9, a022152.
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