Fonte: Pablo Sanchez Bosch², Sean Corcoran² e Katja Brückner^1,2,3
1 Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
² Dipartimento di Biologia Cellulare e Tissutale,
³ Istituto di ricerca cardiovascolare, Università della California San Francisco, San Francisco, CA, USA

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) è una tecnica che permette l'amplificazione del cDNA a lunghezza intera dall'mRNA estendendosi all'estremità 3' o 5', anche senza previa conoscenza della sequenza (Frohman et al., 1988). A differenza della normale PCR, utilizza solo un primer PCR specifico e un secondo primer non specifico che si legherà indiscriminatamente alla maggior parte degli mRNA. A seconda che l'area da amplificare sia all'estremità 3' o 5' dell'mRNA, il secondo primer viene scelto per legare la coda polyA (estremità 3') o un linker sintetico aggiunto a tutti i trascritti (estremità 5'). Queste combinazioni di primer sono note per produrre PCR "unilaterale" o "ancorata" a causa dell'amplificazione PCR utilizzando la sequenza nota di un lato - 3' o 5' (Ohara et al., 1989). L'approccio consente la cattura di mRNA rari gene-specifici che altrimenti sarebbero difficili da rilevare, ad esempio a causa della loro espressione relativamente bassa o della sequenza completa sconosciuta (Frohman et al., 1988).

RACE viene avviato con una fase di trascrizione inversa (RT) per sintetizzare il DNA complementare a singolo filamento (cDNA) dall'mRNA. Questo è seguito da due PCR consecutive che amplificano i frammenti di cDNA da un gene di interesse. Per eseguire RACE, la sequenza del gene di interesse deve essere almeno parzialmente nota, in quanto è necessaria per progettare i primer gene-specifici (GSP; Frohman, 1994; Liu e Gorovsky, 1993). Poiché la seconda coppia di primer è un primer generico che si ricottura a tutti i trascritti presenti nel campione, la specificità delle reazioni PCR è ridotta. RACE viene quindi eseguito idealmente con due PCR nidificate per ridurre le possibilità di amplificare trascrizioni non specifiche (Figura 1). A seconda della direzione di amplificazione rispetto al GSP, la tecnica è classificata come 5' o 3' RACE (Figura 1).

3' RACE (Figura 1A) sfrutta la coda poli(A) presente negli mRNA come sito di legame generico per il primer non specifico. Questo semplifica la tecnica, in quanto si può sintetizzare il cDNA usando primer oligo (dT). I GSP si trovano nella regione 5' delle trascrizioni. Questa variante RACE permette il rilevamento di varianti di trascrizione e diversi 3' UMR (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5' RACE (Figura 1B), i GSP si trovano nella regione 3' del gene. Per essere in grado di utilizzare un primer non specifico che si lega a tutti i trascritti, un adattatore che funge da sito di legame del primer generico è collegato alle estremità dell'RNA 5 '. Per collegare l'adattatore all'mRNA, è necessario rimuovere il cappuccio da 5' che protegge gli mRNA dalle esonucleasi e promuove la traduzione (Bird et al., 2016). Opposto a 3' RACE, 5' RACE aiuta a trovare varianti differenziali di giunzione 5' e UMR alternativi da 5' (Scotto Lavino et al., 2007b).

Qui eseguiremo 3' RACE per identificare e isolare diverse varianti di trascrizione utilizzando la nota sequenza 5' (Figura 2A) codificata dal gene Drosophila dSmad2 (Smox). dSmad2, una proteina Smad della mosca, è un importante trasduttore della segnalazione di Activin-β, una via della superfamiglia TGF-β. dSmad2 regola molteplici processi cellulari, come la proliferazione cellulare, l'apoptosi e la differenziazione (Upadhyay et al., 2017). Poiché i trascritti differenzialmente spliced di dSmad2 possono avere funzioni diverse nella mosca adulta, un primo passo nell'esplorazione di queste potenziali funzioni è valutare tutte le varianti di trascrizione di dSmad2 in questa fase dello sviluppo.

1. Configurazione dell'esperimento per 3' RACE

1. Progettare un primer specifico da 5' per un gene di interesse (gene specific primer 1, GSP-1). Deve essere altamente specifico, in quanto è l'unico primer che introduce specificità. Pertanto, sarebbe preferibile un primer relativamente lungo (lunghezza tipica intorno a 24 nucleotidi, Tm che va da 55-65 ° C).
2. Progettare un secondo primer nidificato (GSP-2), ovvero il primer dovrebbe trovarsi a 3' di GSP-1. Questo passaggio è facoltativo, ma l'esecuzione di

Ci sono due trascrizioni annotate per Drosophila dSmad2 in FlyBase (Fig. 2A). I nostri risultati, tuttavia, rivelano tre diverse trascrizioni per dSmad2, di dimensioni variabili da 750 bp a 1400 bp (Fig. 2B). Le differenze nell'intensità delle bande indicano i loro livelli di espressione relativa. Tra i prodotti previsti, una trascrizione è predominante (Fig. 2B, freccia nera A) e una è espressa a un livello inferiore (Fig. 2B, freccia nera B). Inoltre, è stato rilevato un prodotto più piccolo prec...

RACE fornisce uno strumento rapido, economico e potente per ottenere cDNA da sequenze che sono solo parzialmente conosciute o da trascrizioni rare che altrimenti sono più difficili da amplificare. Può essere utilizzato per trovare la sequenza di trascrizioni sconosciute da un gene già noto o per clonare tali trascrizioni per ulteriori studi. Seguendo RACE, tali trascrizioni possono essere sovraespresse in sistemi cellulari o organismi modello per studiare la loro funzione in vivo.

1. Bird, J.G., Zhang, Y., Tian, Y., Panova, N., Barvík, I., Greene, L., Liu, M., Buckley, B., Krásný, L., Lee, J.K., et al. (2016). The mechanism of RNA 5′ capping with NAD+, NADH and desphospho-CoA. Nature 535, 444–447.
2. Frohman, M.A. (1994). On beyond classic RACE (rapid amplification of cDNA ends). PCR Methods Appl. 4, S40–S58.
3. Frohman, M.A., Dush, M.K., and Martin, G.R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.a. 85, 8998–9002.
4. Liu, X., and Gorovsky, M.A. (1993).  Mapping the 5′ and 3′ ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Nucleic Acids Res. 21, 4954–4960.
5. Ohara, O., Dorit, R.L., and Gilbert, W. (1989). One-sided polymerase chain reaction: the amplification of cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5673–5677.
6. Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007a). 3′ End cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2742–2745.
7. Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007b). 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2555–2562.
8. Upadhyay, A., Moss-Taylor, L., Kim, M.-J., Ghosh, A.C., and O’Connor, M.B. (2017). TGF-β Family Signaling in Drosophila. Cold Spring Harb Perspect Biol 9, a022152.